堿提西番蓮葉多糖的分離、鑒定及生物活性

李 霞 劉承鑫 黃 艷 莫觀(guān)蘭 關(guān) 媛

(桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541006)

西番蓮(PassifloraedulisSims)含有大量對(duì)人體有益的活性物質(zhì)及礦物元素[1]，其葉被視為一種藥材，用于醫(yī)治失眠、情緒失常和癲癇，有緩解止痛的功效[2]?，F(xiàn)有研究表明植物多糖具有降血糖和抗凝活性，Colomeu等[3]研究表明西番蓮葉水提物中酚類(lèi)化合物具有一定糖尿病免疫作用；全娜[4]研究發(fā)現(xiàn)枸杞葉多糖顯著提高小鼠血清胰島素的含量，降低血糖的同時(shí)也能保護(hù)糖尿病小鼠臟器及血清內(nèi)酶活力；馬琳[5]研究得出堿提紅棗多糖對(duì)APTT值的延長(zhǎng)達(dá)到水提紅棗多糖的11.1倍，說(shuō)明堿提紅棗多糖抗凝效果較好；Francisco等[6]研究表明紅藻中的硫酸化多糖不僅具有良好的抗凝血作用，還具備有效的抗血栓形成作用以及抑制血小板聚集的作用。

目前，關(guān)于西番蓮果皮抗氧化[7-8]、降血壓[9]等方面的研究文獻(xiàn)較多，但對(duì)西番蓮葉中多糖組分的體外降血糖和抗凝血活性研究還沒(méi)有詳細(xì)的報(bào)道。植物多糖除水溶性多糖外，還有大量的胞內(nèi)多糖或細(xì)胞壁結(jié)合多糖，熱水提取法不能使之溶出，且水提后的殘?jiān)ǔ?huì)被丟棄，而一定濃度堿溶液可以繼續(xù)提出殘?jiān)械募?xì)胞壁結(jié)合多糖或胞內(nèi)多糖[10]。研究擬以熱水提取后的西番蓮葉殘?jiān)鼮樵?，利用堿溶液從殘?jiān)欣^續(xù)提取多糖，對(duì)多糖進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行體外降血糖和抗凝血活性的研究，以期為西番蓮葉中多糖相關(guān)藥物的研究開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

西番蓮葉：桂林萬(wàn)禾農(nóng)產(chǎn)品有限公司；

NaOH、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇、3，5-二硝基水楊酸、無(wú)水碳酸鈉等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

苯酚：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；

考馬斯亮藍(lán)：分析純，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；

α-淀粉酶：3.7 U/mg，北京索萊寶科技有限公司；

α-葡萄糖苷酶：酶活25 U/mg，上海源葉生物科技有限公司；

阿卡波糖：杭州中美華東制藥有限公司；

肝素鈉：北京索萊寶科技有限公司；

活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定試劑盒、凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒、凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑盒：上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：UV760CRT型，上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV760CRT型，上海傲譜分析儀器有限公司；

冷凍干燥儀：ALPHA1-2LD型，德國(guó)Martin Christ公司；

離心機(jī)：DL-5-B型，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；

振蕩培養(yǎng)箱：LRH-250-Z型，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；

傅里葉紅外光譜儀：IS10型，美國(guó)Thermo Fisher公司；

液相色譜儀：LC1220型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離 西番蓮葉烘干粉碎，用75%的乙醇在85 ℃下冷凝回流提取2 h，提取3次。將醇提后的西番蓮葉烘干，按照料液比(m西番蓮葉∶V乙醇)1∶16 (g/mL)、100 ℃ 熱水提取6 h，將熱水提取后的西番蓮葉殘?jiān)娓?，以料液?m西番蓮葉殘?jiān)肰NaOH)1∶15.6 (g/mL)用6% NaOH浸泡12 h后，60 ℃水浴提取1 h，提取4次，得到西番蓮葉的堿提液，濃縮至其1/6體積，冷卻，加入3倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃醇沉48 h，過(guò)濾，4 500 r/min離心15 min，蒸餾水復(fù)溶，35%鹽酸中和，流水透析48 h，冷凍干燥[11]，得到堿提西番蓮葉粗多糖(APEL)。將APEL用DEAE-52纖維素柱分離，分別用蒸餾水洗脫出APEL-3、0.7 mol/L NaCl洗脫出APEL-2、0.1 mol/L NaOH溶液洗脫出APEL-1，流速15 mL/min。

1.3.2 多糖主要成分測(cè)定

(1) 總糖含量：采用苯酚—硫酸法[12]。

(2) 糖醛酸含量：間羥基聯(lián)苯法[13]。

(3) 蛋白質(zhì)含量：考馬斯亮藍(lán)法[14]。

(4) 還原糖含量：3,5-二硝基水楊酸法[15]。

1.3.3 紅外光譜分析 取適量多糖樣品，按照(m多糖∶m溴化鉀)1∶100的比例加入干燥的溴化鉀晶體，均勻研磨后壓片，于4 000～400 cm-1區(qū)間用傅里葉紅外光譜進(jìn)行掃描分析。

1.3.4 單糖組成分析 采用高效液相色譜法[16]。將含1 mol/L HCl的無(wú)水甲醇(0.5 mL)和多糖樣品(2 mg)混合并在80 ℃下水解16 h，然后在120 ℃下用2 mol/L 三氟乙酸(0.5 mL)水解1 h。用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)處理所得的水解產(chǎn)物，并在連接Shimadzu的DIKMA Inertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm×150 mm)上進(jìn)行分析。選用SPD-10AVD UV-VIS檢測(cè)器。注入PMP衍生物(20 μL)，用82.0% 磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)和18.0%乙腈(VPBS∶V乙腈)4.5∶1.0的比例以1.0 mL/min 的流速洗脫，并通過(guò)245 nm下的紫外光譜(UV)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

1.3.5 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 采用凝膠滲透色譜法[17]。色譜條件：配備RI檢測(cè)器的Tosoh EcoSEC HLC-8320凝膠色譜柱和TSKgel guard PW×l + 2×TSKgel MPW×l + TSKgel G2500PW×l (7.8 mm×300 mm)色譜柱，流動(dòng)相為0.1 mol/L NaNO3，流速1 mL/min，上樣體積100 μL，柱溫40 ℃。

1.3.6 體外降血糖活性測(cè)定

(1) 對(duì)α-淀粉酶的抑制作用：根據(jù)文獻(xiàn)[18]修改如下，取1 mL不同濃度梯度的樣品溶液，加入0.3 mL酶液，并在37 ℃預(yù)熱20 min，加入0.4 mL淀粉溶液混勻反應(yīng)5 min，加入1 mL鹽酸，0.2 mL碘液搖勻，于660 nm處測(cè)量吸光度值A(chǔ)1，用蒸餾水代替酶液測(cè)量吸光度值A(chǔ)2，蒸餾水作為空白，吸光度值為A0，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，按式(1)計(jì)算α-淀粉酶清除率。

(1)

式中：

K——α-淀粉酶清除率，%；

A0——蒸餾水代替樣品反應(yīng)后的吸光值；

A1——加入樣品反應(yīng)后的吸光度值；

A2——蒸餾水代替酶液反應(yīng)后的吸光度值。

(2) 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用：取112 μL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液與0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液20 μL混合后加入二甲基亞砜8 μL，然后加入不同濃度梯度的樣品溶液50 μL，37 ℃下孵育20 min后加入10 mmol/L 的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷20 μL，繼續(xù)孵育20 min，加入0.2 mol/L Na2CO380 μL，在410 nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)，并用不加樣品(不加樣品的以0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液代替)測(cè)定酶的活力吸光度值A(chǔ)0，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照[19]。按式(2)計(jì)算α-葡萄糖苷酶清除率。

(2)

式中：

S——α-葡萄糖苷酶清除率，%；

A0——不加樣品測(cè)定酶的活力吸光度值；

A——加入樣品反應(yīng)后的吸光度值。

1.3.7 體外抗凝血活性測(cè)定 采集新鮮雞血，將0.109 mol/L 檸檬酸鈉溶液與全血按V檸檬酸鈉∶V全血=1∶9混合，3 600 r/min離心15 min，取上層血漿。以9%生理鹽水為溶劑配制0.10 g/L多糖樣品溶液，用9%生理鹽水將樣品溶液稀釋成5，20，50，100 μg/mL的質(zhì)量濃度梯度。陽(yáng)性對(duì)照：用9%生理鹽水配制質(zhì)量濃度為0.10 g/L 的肝素鈉溶液[20]。采用上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司的試劑盒分別檢測(cè)活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)3個(gè)抗凝血活性指標(biāo)。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 采用Origin 7.0作圖和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖成分

如表1所示，APEL、APEL-1、APEL-2和APEL-3總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為73.80%，81.42%，83.34%，62.93%，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.38%，4.04%，9.15%，5.59%。APEL經(jīng)過(guò)分離后，APEL-1、APEL-2和APEL-3的蛋白質(zhì)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，說(shuō)明使用DEAE-52纖維素柱分離APEL具有一定的純化效果，而其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏高，推測(cè)是在堿性條件下蛋白質(zhì)易溶于溶液中，形成較難去除的高水平蛋白質(zhì)[21]。

2.2 紅外光譜分析

如圖1所示，APEL及其各組分均在3 417 cm-1左右有較強(qiáng)的吸收峰，該峰是由多糖中的羥基O—H伸縮振動(dòng)引起的[22]；在2 927～2 937 cm-1的吸收峰是C—H的伸縮振動(dòng)，為糖類(lèi)的特征峰；在1 635～1 639 cm-1附近處的吸收峰是由于C═O伸縮振動(dòng)引起的[23]，表明含有糖醛酸；在1 400 cm-1附近的吸收峰是由于C—H的變角振動(dòng)引起的；1 043～1 079 cm-1附近的吸收峰是由C—O的伸縮振動(dòng)引起的[24]，其中APEL-3的C—O伸縮振動(dòng)為變角振動(dòng)。

表1 多糖樣品中化學(xué)成分和功能性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

圖1 多糖樣品的紅外光譜圖Figure 1 Infrared spectra of polysaccharide samples

2.3 單糖組成成分

如表2所示，APEL由阿拉伯糖、半乳糖醛酸和半乳糖3種單糖組成，以阿拉伯糖為主，其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.11%。與APEL相比，分離后得到的APEL-1、APEL-2 和APEL-3的單糖組成明顯發(fā)生變化；APEL-1主要由葡萄糖和木糖組成，其中葡萄糖組分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大為40.53%，木糖相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)32.36%；APEL-3 主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，同時(shí)含有少量的木糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸；APEL-2的單糖成分主要為半乳糖醛酸，其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.63%，其次是阿拉伯糖(18.89%)和半乳糖(12.36%)；在所有的多糖中都能夠檢測(cè)到阿拉伯糖和半乳糖的存在，但其質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，并且這兩種單糖在所有的多糖中占比都比較大。中性多糖APEL-3中阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差不大，在糖鏈中分布較均勻；而酸性多糖APEL-2的糖鏈中半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高，所以阿拉伯糖和半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。堿提多糖APEL-1中阿拉伯糖和半乳糖含量較低，葡萄糖和木糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可能是在堿溶液洗脫過(guò)程中，各成分之間發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化或部分產(chǎn)生了降解。

2.4 多糖相對(duì)分子質(zhì)量

堿提西番蓮葉多糖及其組分的相對(duì)分子質(zhì)量分布圖如圖2所示，APEL、APEL-1的相對(duì)分子質(zhì)量分布圖中都是單峰，而APEL-2、APEL-3的有多個(gè)峰，說(shuō)明APEL-2和APEL-3中可能存在其他雜質(zhì)，純度不高，需要進(jìn)一步分離純化。從相對(duì)分子質(zhì)量大小來(lái)看，堿提多糖APEL及其組分相對(duì)分子質(zhì)量都比較大，且分布較集中。多糖樣品中各峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量見(jiàn)表3。

表2 各樣品單糖組分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖2 多糖樣品的相對(duì)分子質(zhì)量分布圖Figure 2 Relative molecular mass distribution of polysaccharide samples

2.5 體外降血糖活性

2.5.1 對(duì)α-淀粉酶的抑制作用 如圖3所示，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，所有樣品對(duì)α-淀粉酶抑制效果均隨質(zhì)量濃度的增大而增加，說(shuō)明各樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制率均存在一定的劑量依賴(lài)性。1.0 mg/mL時(shí)，APEL-1和APEL-2對(duì)α-淀粉酶的抑制率接近陽(yáng)性對(duì)照組(阿卡波糖)的，表明這2種多糖組分對(duì)α-淀粉酶的抑制作用較好；堿提西番蓮葉多糖及其組分對(duì)α-淀粉酶抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)锳PEL-2>APEL-1>APEL>APEL-3，其中APEL-2對(duì)α-淀粉酶的抑制作用最強(qiáng)，最高達(dá)到39.21%。

2.5.2 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用 如圖4所示，隨質(zhì)量濃度的增大，各樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性逐漸升高。與陽(yáng)性對(duì)照相比，堿提西番蓮葉多糖及其組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性均低于阿卡波糖，其中APEL-1對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高，為63.89%。APEL經(jīng)過(guò)分離后，APEL-1和APEL-3對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果均高于分離前多糖APEL，而APEL-2對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力最低；推測(cè)可能與其單糖組成及相對(duì)分子質(zhì)量不同有密切關(guān)系[25]。

表3 樣品各峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量

圖3 多糖樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Figure 3 Effects of polysaccharide on α-amylase

圖4 多糖樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Figure 4 Inhibition of α-glucosidase by polysaccharide sample

2.6 體外抗凝血活性

如表4所示，與生理鹽水相比，隨著質(zhì)量濃度的增加，堿提西番蓮葉多糖及其組分均明顯延長(zhǎng)了APTT的時(shí)間(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴(lài)性，尤其是APEL，在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，APEL的APTT凝血時(shí)間是生理鹽水的4.82倍，說(shuō)明堿提西番蓮葉多糖組分是通過(guò)參與內(nèi)源性凝血途徑來(lái)發(fā)揮抗凝血作用。多糖中的糖醛酸含量會(huì)影響其抗凝血效果，糖醛酸含量高，抗凝效果好[26]；在多糖理化性質(zhì)中，APEL和APEL-2的糖醛酸含量高，而單糖組成分析中這兩種多糖的半乳糖醛酸含量都較大，所以APEL和APEL-2相比于生理鹽水具有較好的抗凝效果。

如表5所示，與生理鹽水相比，質(zhì)量濃度為5～100 μg/mL 時(shí)，所有多糖樣品對(duì)PT的影響均達(dá)到顯著性水平(P<0.05或P<0.01)，各多糖樣品組對(duì)PT時(shí)間均有明顯延長(zhǎng)作用，表明西番蓮葉中多糖組分也通過(guò)外源性發(fā)揮抗凝血效果；其中，APEL-2在0～50 μg/mL時(shí)對(duì)PT基本沒(méi)有影響，而100 μg/mL時(shí)可以顯著延長(zhǎng)PT，延長(zhǎng)了30.53%。研究表明，當(dāng)肝素鈉分子量在1 000～10 000 Da 時(shí)，肝素鈉的抗凝血效果較弱[27]；而多糖的分子量也可能影響抗凝功能，分子量過(guò)小，無(wú)抗凝血能力[28]，APEL、APEL-1、APEL-2和APEL-3均為分子量很大的多糖，所以均具有較好的抗凝血活性。

如表6所示，堿提西番蓮葉多糖及其組分對(duì)TT也有延長(zhǎng)作用，但與肝素鈉相比，其增長(zhǎng)幅度極小，各多糖樣品要達(dá)到相同的抗凝血作用則需要更高的濃度，因此推測(cè)其可能不是通過(guò)共同途徑來(lái)影響凝血過(guò)程。而有研究[29]發(fā)現(xiàn)，含有硫酸基的多糖均表現(xiàn)出較好的抗凝血活性；肝素鈉本身是一種硫酸氨基葡萄糖鈉鹽，因此肝素鈉會(huì)表現(xiàn)出比多糖較好的抗凝血效果。半乳糖是黏附分子凝集素家族識(shí)別的配體，與凝集素結(jié)合后，阻斷了凝集素在血栓形成中的粘附作用，從而達(dá)到抗凝血的效果；崔瑩瑩等[30]發(fā)現(xiàn)堿提大蒜多糖組分中的半乳糖構(gòu)成比例較大，可能是其具有抗凝血活性的原因；單糖組成分析發(fā)現(xiàn)堿提西番蓮葉多糖組分都存在半乳糖，推測(cè)其抗凝血活性可能與半乳糖含量有關(guān)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，堿提西番蓮葉多糖及其組分具有典型的多糖特征吸收峰，均含有阿拉伯糖和半乳糖，且堿提西番蓮葉多糖及其堿洗脫組分為單峰，多糖組分對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，主要是多糖鏈上含有羥基和羧基，可以與消化酶的氨基酸殘基結(jié)合，從而抑制酶的活性，并且堿提西番蓮葉多糖及其組分對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率大小順序與糖含量的一致，說(shuō)明其抑制作用與糖含量呈正相關(guān)。抗凝血試驗(yàn)顯示，堿提西番蓮葉多糖及其組分均顯著延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，呈現(xiàn)非常好的抗凝血作用；尤其在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，堿提西番蓮葉多糖及其堿洗脫組分分別顯著延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，凝血時(shí)間分別達(dá)到生理鹽水的4.82倍和1.68倍，說(shuō)明其通過(guò)內(nèi)外源性凝血途徑達(dá)到抗凝效果。綜上所述，堿提西番蓮葉多糖明顯具有潛在的降血糖和抗凝血作用。后續(xù)將進(jìn)一步探索堿提西番蓮葉多糖的體內(nèi)降血糖和抗凝血活性機(jī)制，對(duì)其他功能活性如抗血栓等方面進(jìn)行研究。

表4 多糖樣品對(duì)APTT的影響?

表5 多糖樣品對(duì)PT的影響?

表6 多糖樣品對(duì)TT的影響?