口腔黏膜下纖維性變癌變的分子機制研究進展

李冰霞，溫琦濤，王 濤，孫冠宇，符 驍，蘇守達

（1.海南醫(yī)學院口腔醫(yī)學院，海南 ?？?571199；2.海南省人民醫(yī)院口腔科，海南 ?？?570311）

口腔黏膜下纖維性變（oral submucous fibrosis，OSF）是一種因過多的細胞外基質(zhì)沉積而導致口腔黏膜上皮萎縮、口腔黏膜下固有層膠原堆積和血管減少的炎癥性反應，早期病理表現(xiàn)為膠原纖維水腫、血管擴張充血，可見上皮下皰和過度角化，晚期致密的纖維替代深層肌組織，膠原纖維玻璃樣變，血管和成纖維細胞明顯減少，有輕至中等程度慢性炎癥細胞浸潤，部分病例見上皮異常增生。OSF 可出現(xiàn)7%～13%幾率的癌變，且隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展及檳榔商品化，這一概率將隨之增加［1，2］。一些流行病學及病例對照研究表明該病具有明顯的地域性特征，國外的東南亞地區(qū)及中國的海南、湖南和臺灣等地具有較高的患病率，這些地區(qū)居民有咀嚼檳 榔 的 習 俗，是 導 致OSF 癌 變 的 主 要 因 素［3，4］。本文系統(tǒng)整理了國內(nèi)外近年來關(guān)于OSF 癌變的研究報道，圍繞細胞周期改變、遺傳易感性、表觀遺傳調(diào)控、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、缺氧與血管生成等方面對OSF 癌變的分子機制進行綜述。

1 細胞周期改變

細胞周期是一個準確而有序的過程，該過程受到多種基因和蛋白調(diào)控，當這些基因和蛋白表達異常時，會出現(xiàn)細胞增殖失控、細胞凋亡抑制，遺傳不穩(wěn)定因素積累的現(xiàn)象，進而導致腫瘤的發(fā)生。因此，細胞周期的改變可能是OSF 癌變的機制之一。

p21 和p27 是腫瘤抑制因子，也是細胞周期檢查點的重要調(diào)節(jié)因子，在基因組完整性方面發(fā)揮著重要作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，檳榔堿可增強OSCC 細胞中的活性氧（ROS），通過ROS/mTORC1 途徑下調(diào)OSCC 細胞中p21 和p27 的表達，促進細胞周期G1/S 期轉(zhuǎn)變，增加了DNA 復制出錯的概率，從而提高了OSF 癌變風險。

磷酸化激酶細胞分裂周期蛋白2（p34cdc2）與細胞周期蛋白B1（Cyclin B1）形成的唯一復合物p34cdc2-Cyclin B1 是細胞周期G2/M 期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因 子。Vay 等［5］發(fā) 現(xiàn)，p34cdc2- Cyclin B1 在 正 常、OSF 和OSF 癌變口腔黏膜組織中的表達逐漸增加，其表達增加可磷酸化凋亡抑制因子Survivin。另有研究指 出，磷 酸 化Survivin（phosphorylation-Survivin，p-Survivin）的表達水平在OSF 癌變?yōu)镺SCC 組中明顯高于正常組和OSF 組，在OSF 的癌變過程中表達呈上升趨勢［6］，提示p-Survivin 可能通過抑制細胞凋亡，促進了細胞分裂和增殖，嚴重影響了有絲分裂期的穩(wěn)定，導致了OSF 的癌變。

增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表達與細胞分裂密切相關(guān)，在G1、S期增加，G2 期減少。PCNA 在OSF 和口腔鱗狀細胞癌（OSCC）中均有表達，在OSF 中主要在上皮基底層、棘層表達，在OSCC 中可在上皮全層表達［7］。隨著口腔組織從正常上皮到OSF 再到OSCC，PCNA 的分布逐漸增加，證實了細胞周期改變與OSF癌變相關(guān)。

2 遺傳易感性

遺傳易感性主要包括基因突變、單核苷酸多態(tài)性及基因的雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）等。

檳榔中的生物堿、多酚及其特有的亞硝胺具有遺傳毒性及致突變性，可直接作用于口腔黏膜并誘導OSF 的發(fā)生，進而癌變。Ekanayaka 等［8］觀察到，檳榔堿在Ames 試驗中具有突變性，可在幾種類型的細胞中誘導姐妹染色單體交換、染色體畸變和微核形成。

基因啟動子區(qū)域的SNP 與咀嚼檳榔導致的OSF 和OSCC 患者的易感性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在OSF 和OSCC 中均有較高的膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）以及賴氨酰氧化酶高危等位基因和基因型頻率，其改變了轉(zhuǎn)錄活性和相應蛋白表達與功能，增加了OSF 癌變的危險性［9］。

Ray 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，OSCC 標本中所有常染色體上均存在LOH 的現(xiàn)象，高頻LOH 與OSCC 的進展和復發(fā)呈正相關(guān)；同時，OSF 和OSCC 共有的LOH 基因座含有多種參與維持口腔上皮遺傳完整性和防御能力的抑癌基因，例如PTEN、乳腺癌基因1、2（BRAC1、BRAC2）、脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）以及細胞素色P450（CYP450）等，這些抑癌基因一旦發(fā)生LOH，其具有的DNA 修復、細胞黏附等功能將受到影響，使OSF 發(fā)生癌變。由此推測，LOH 可能在OSF 的癌變進展中起重要作用，并促進OSF的癌變。

3 表觀遺傳調(diào)控

表觀遺傳學改變指基因DNA 序列不變而功能發(fā)生可遺傳的變化，導致表型變化，包括DNA 修飾、組蛋白修飾和非編碼RNA 調(diào)控等。因其具有可遺傳、可逆的特點，現(xiàn)已成為開發(fā)疾病生物標記物有吸引力的候選者，并成為治療幾種人類癌癥的新興靶點，也為了解OSF 癌變進程相關(guān)的分子和細胞事件提供了新的見解。

啟動子異常甲基化是口腔癌最早的分子事件之一。Dickkopf-1（DKK1）是一種特異性抑制Wnt/β-catenin 通路的基因，在各種纖維化疾病和腫瘤中異常表達。DKK1 甲基化水平在正常組較低，在OSF 組和OSF 癌變組較高，提示DKK1 的高甲基化或許通過沉默DKK1 基因或通過抑制DKK1 基因的表達，異常激活Wnt/β-catenin 通路，導致OSF 的發(fā)生和癌變［11］。由此可見，發(fā)現(xiàn)檢測原發(fā)腫瘤組織和體液中人類基因啟動子CpG 島甲基化是一種具有前景的非侵入性篩查和癌癥早期診斷的方法，有望應用于口腔癌篩查中。

非編碼RNA 的異常表達及功能障礙可促進OSF 的癌變。microRNA（miRNA）經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)位于與癌癥風險相關(guān)的脆弱基因組位置和基因組區(qū)域，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中有明確特征。miR-22 作為腫瘤抑制因子，其在檳榔堿處理的OSCC 細胞中表達受抑制，與c-Myc癌基因的表達上調(diào)相當，且c-Myc 也可直接抑制miR-22；另外，p53 是miR-22 的直接轉(zhuǎn)錄因子，可誘導miR-22 表達，但檳榔堿抑制p53 表 達，從 而 間 接 抑 制miR-22 表 達［12］，表 明miR-22 的異常表達在OSF 癌變過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）的失控和功能障礙與多種惡性腫瘤相關(guān)。有研究通過對正常、OSF、OSCC 口腔黏膜組織進行RNA 測序，發(fā)現(xiàn)差異表達的lncRNAs 參與了炎癥、Wnt 和p53 等信號通路，這些信號通路參與了OSF的炎癥和纖維彈性病理變化以及進一步的癌變進展［13］。環(huán)狀RNA（circRNA）是特殊的非編碼RNA，Wang 等［14］學 者 對circRNA 進 行 微 陣 列 分 析，鑒 定了circEPSTI1 是一種circRNA，其在正?？谇火つさ絆SF 再到OSCC 具有一致地順序上調(diào)，在功能上顯著促進口腔鱗癌細胞的增殖和侵襲。

4 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesen-chymal transition，EMT）使極化的上皮細胞向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變，其特征是失去細胞-細胞連接，并獲得紡錘形形態(tài)以建立運動型和侵襲性表型，在炎癥、纖維化及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。EMT 可促進細胞外基質(zhì)的堆積，是OSF 及其癌變進程中的重要步驟。EMT 的特征包括上皮性標志物如E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、細胞角蛋白的表達和功能的喪失，及間質(zhì)標志物的豐度增加，如N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白和整合素［15］。

咀嚼檳榔被認為是導致口腔EMT 并激活口腔頰黏膜成纖維細胞（buccal mucosal fibroblast，BMF）的主要病因，檳榔堿可降低BMF 中E-cadherin 的表達，增加N-cadherin 和波形蛋白的表達［16］。檳榔堿以劑量依賴的方式上調(diào)E-cadherin 轉(zhuǎn)錄抑制物Snail 的表達，繼而觸發(fā)了肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化，增加了多種纖維化因子，如Ⅰ型膠原（Col-1）和α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）的表達，且增加了白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達，升高的炎性細胞因子導致口腔中組織修復和纖維化形成的失衡，且Snail 的過度表達與OSCC 的臨床病理特征有關(guān)［17-19］。IL-6 通過信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Stat3）/Snail 信號通路在多種癌癥中誘導EMT［20］。有實驗顯示，IL-6 是Snail 的直接靶標，介導了Snail 誘導的肌成纖維細胞的激活，表明Snail 與IL-6 之間存在正向調(diào)節(jié)檳榔相關(guān)肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化的環(huán)路，提示阻斷Snail 可作為治療OSF 的有力策略［21］。由此可推斷，Snail對維持肌成纖維細胞的活性至關(guān)重要，以Snail 為靶點的治療方法或許可以緩解OSF 的癌變，并下調(diào)由其引起的慢性炎癥。除此之外，檳榔堿可上調(diào)胰島素樣生長因子-1 受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）的轉(zhuǎn)錄，并誘導IGF-1R 磷酸化，從而誘導E-cadherin 轉(zhuǎn)錄抑制物鋅指E 蛋白ZEB1 的激 活，降 低E-cadherin 的 表 達［22］，同 時 也 加 深 了 對EMT 在OSF 癌變進程中的理解。

整合素αvβ6 參與多種器官的病理性纖維化，其在OSF 中表達上調(diào)，證實了檳榔堿依賴αvβ6 的上調(diào)促進了口腔成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化［22］。OSF 癌變患者中RAS 基因表達率較高，這可能是OSF 癌變?yōu)镺SCC 的原因之一。也有學者指出，檳榔堿可上調(diào)角質(zhì)形成細胞αvβ6 的表達，繼而 激 活TGF-β1，TGF-β1 和RAS 可 能 參 與 調(diào) 節(jié) 腫瘤細胞侵襲的EMT 過程［19］。

近年來有報道m(xù)iRNAs 在檳榔堿誘導的EMT過程中的作用。miR-203 在OSF 組織中的表達明顯低于正?？谇火つそM織，其上調(diào)后顯著抑制細胞增殖，顯著上調(diào)了細胞角蛋白19（CK19）和E-cadherin 的表達，下調(diào)了N-cadherin 和波形蛋白的表達，從而逆轉(zhuǎn)了EMT 進程［23］。另有研究者觀察到檳榔堿可劑量依賴性地降低人骨髓間充質(zhì)干細胞miR-200b 基因的表達，在骨髓間充質(zhì)干細胞中過表達miR-200b 后，檳榔堿誘導的肌成纖維細胞活性被取消。此外，miR-200b 的增加抑制了α-SMA 的表達［24］。

這些研究表明檳榔導致口腔EMT 發(fā)生或許是OSF 癌變進程中的關(guān)鍵一環(huán)，亦可成為阻止OSF 癌變的潛在靶標。

5 缺氧與血管生成

缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α）被認為與上皮癌變有關(guān)［25］。HIF-1α 的穩(wěn)定可促進腫瘤發(fā)生、血管生成的基因表達，并獲得更具糖酵解的表型，使癌細胞不依賴氧氣來產(chǎn)生ATP，新生血管和糖酵解的增加代表了對缺氧微環(huán)境的適應，這與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［26，27］。

HIF-1α 在成纖維細胞、上皮細胞和炎癥細胞中的表達在正常、OSF、OSCC 組織中依次遞增［28］。另外，OSF 組織中HIF-1α 在蛋白和基因水平均有上調(diào)，且與上皮異型增生相關(guān)，同時BMF 中檳榔堿可劑 量 依 賴 性 地 上 調(diào)HIF-1α 基 因 的 表 達［29，30］。這 表明細胞的增殖、成熟和代謝適應發(fā)生變化，增加了癌變的可能性。碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase，CAⅨ）是一種缺氧誘導酶，已被證明是HIF 的直接靶標，負責調(diào)控細胞內(nèi)pH 及參與細胞外空間的形成，在癌癥中缺氧時顯著上調(diào)，促進腫瘤細胞的侵襲［26］。有學者發(fā)現(xiàn)， OSF 中，CA 總活性和CAⅨ基因表達水平均高于正常BMF，且檳榔堿以劑量依賴性地增加正常BMF 中CAⅨ的表達，咀嚼檳榔的患者比不咀嚼檳榔的患者血漿CAⅨ水平更高，口腔癌患者的血漿CAⅨ水平在統(tǒng)計學上和臨床分期顯著相關(guān)［31］。

在幾種人類癌癥的癌前階段，血管生成開關(guān)可能被激活，因此，腫瘤血管生成并不一定是浸潤性腫瘤的特征，而可能是癌癥發(fā)展過程中的早期事件。HIF-1α 的多種靶基因，如血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素和成纖維細胞生長因子，通過促進內(nèi)皮細胞的有絲分裂和遷移活性來調(diào)節(jié)血管生成，促進不規(guī)則血管內(nèi)皮細胞的增殖和分化［32］。從OSF 到OSCC 再到OSCC 伴OSF，HIF-1α 的表達呈上升趨勢，且與血管密度呈正相關(guān)［33］。有體內(nèi)研究顯示，OSF 微血管變化以萎縮、減少為主，OSF 后期血管增加考慮為OSF 癌變［34］。由此推斷，HIF-1α 的上調(diào)是OSF 癌變發(fā)生的早期事件。OSCC 組織中HIF-1α 的表達伴隨著血管數(shù)目的增加，但與血管數(shù)量增加相比，成纖維細胞的數(shù)量增加更多，即OSF癌變是由于成纖維細胞引發(fā)的纖維化增加，更加缺氧的條件導致HIF-1α 的表達增加［25］。

由此可見，缺氧對OSF 癌變進展的影響是通過缺氧誘導的一系列蛋白質(zhì)和基因組變化來介導的，這些變化激活了血管生成、無氧代謝和其他使腫瘤細胞能夠生存或逃離缺氧環(huán)境的過程。

6 其他

除了以上所述機制，近些年學者們還從細胞衰老、腫瘤干細胞、微量元素、口腔微生物組、免疫微環(huán)境等多方面對OSF 癌變的分子機制進行了研究，同時對OSF 癌變的生物標志物及治療靶標進行了新的探索，這些研究與探索將幫助人們對OSF 癌變的分子機制進行深層次的認識與理解，并對其癌變防治提供新的策略。

結(jié)語 OSF 癌變是一個復雜動態(tài)的過程，該過程主要涉及細胞周期變化、遺傳易感性、表觀遺傳調(diào)控、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、缺氧與血管生成等多種分子機制。從OSF 的發(fā)生、發(fā)展到OSF 癌變?yōu)镺SCC，各個機制之間相互影響，協(xié)同促進OSF 癌變的進展，因此進一步闡明檳榔誘發(fā)OSF 癌變的分子機制對今后檳榔咀嚼相關(guān)疾病的防治具有重要意義。隨著OSF 及其癌變所產(chǎn)生的經(jīng)濟、社會等負擔逐漸加重，臨床醫(yī)生與相關(guān)研究人員應當加強一級預防，對有檳榔咀嚼習慣的患者進行健康宣教。此外，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療OSF 是預防OSF 癌變的關(guān)鍵。應當繼續(xù)深入研究OSF 癌變的分子機制，確定主要的分子靶向方式，明確OSF 發(fā)生及癌變規(guī)律，為OSF 癌變的防治提供新的思路。

作者貢獻度說明：

李冰霞：提出研究思路，撰寫論文并修改；王濤、溫琦濤：檢查全文并提出修改意見，提供指導；孫冠宇、符驍、蘇守達：協(xié)助收集文獻，整理文檔。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。