養(yǎng)血生發(fā)合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升的實(shí)驗(yàn)研究

張韶湘 鄒昱蕾 李江 余曉玲 陳凌云

摘要：目的 建立養(yǎng)血生發(fā)合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用TLC對本品中當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂進(jìn)行定性鑒別。采用HPLC對本品中大黃素進(jìn)行含量測定。采用單因素試驗(yàn)法，對含量測定中供試品溶液的前處理方法進(jìn)行考察。結(jié)果 可檢出當(dāng)歸和補(bǔ)骨脂且陰性無干擾。大黃素在6.17～79.35 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=34.43x+5.31（R2=0.999 8），平均加樣回收率為103.42%（RSD=2.16%，n=6），其余方法學(xué)考察項(xiàng)均合格。結(jié)論 所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以用于養(yǎng)血生發(fā)合劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)血生發(fā)合劑;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);薄層鑒別;含量測定;大黃素

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）03-0072-04

養(yǎng)血生發(fā)合劑是昆明市中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，運(yùn)用于臨床長達(dá)30余年。該制劑由制何首烏、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂（鹽）、菟絲子（鹽）、牛膝、茯苓共6味藥經(jīng)提取后制備而成，具有養(yǎng)血生發(fā)、烏須發(fā)的功效，用于腎氣不足、氣血虧虛所致的須發(fā)脫落、早白。方中制何首烏為君藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、益精血、烏須發(fā)的功效，所含蒽醌類成分大黃素具有抗衰老、保護(hù)肝腎、增強(qiáng)免疫力等作用[1-3]，其余當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂（鹽）、菟絲子（鹽）等藥材亦具有保肝強(qiáng)腎、抗衰老、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能等效果[4-6]。

由于該合劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容過于簡單，檢查項(xiàng)目專屬性不強(qiáng)，且沒有含量測定項(xiàng)，很難實(shí)現(xiàn)對該制劑的質(zhì)量控制。因此，本研究采用TLC法對方中各藥味進(jìn)行定性鑒別研究，以建立快速、靈敏、專屬性強(qiáng)的定性鑒別方法;同時，采用單因素試驗(yàn)法，對含量測定中供試品溶液的制備條件進(jìn)行考察，以確定適宜的供試品溶液制備方法，并采用HPLC法建立養(yǎng)血生發(fā)合劑中主要有效成分大黃素的含量測定方法，為養(yǎng)血生發(fā)合劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100系列高效液相色譜儀（Agilent公司）;T-1000型電子天平（美國雙杰兄弟有限公司）;Diamonsil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm，迪馬科技公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）;硅膠G板（青島海洋化工分廠、青島鼎康硅膠有限公司）;點(diǎn)樣毛細(xì)管（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試藥 當(dāng)歸對照藥材（批號：120927-201617），補(bǔ)骨脂對照藥材（批號：121056-201605），大黃素對照品（批號：110756-201512，含量以98.7%計(jì)）均購自中國食品藥品檢定研究院。養(yǎng)血生發(fā)合劑（批號：180811、180812、180813，由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 當(dāng)歸的薄層鑒別 取本品20 mL，濃縮至約10 mL，加乙醚萃取2次，每次10 mL，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[7]。取當(dāng)歸對照藥材0.5 g，加乙醚20 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。取不含當(dāng)歸的陰性樣品溶液，按上述供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）通則0502進(jìn)行試驗(yàn)，以硅膠G板為吸附劑，對照藥材溶液、供試品溶液、陰性對照溶液點(diǎn)樣量各5、10、10 μL，以正己烷-乙酸乙酯（7：1）為展開劑，展開，待晾干后于365 nm紫外光燈下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無干擾。結(jié)果見圖1。

2.1.2 補(bǔ)骨脂的鑒別 取本品20 mL，濃縮至約10 mL，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液[8]。取補(bǔ)骨脂對照藥材0.2 g，加乙酸乙酯20 mL超聲提取10 min，濾過，料液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為對照藥材溶液。取不含補(bǔ)骨脂的陰性樣品溶液，按上述供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）通則0502進(jìn)行試驗(yàn)，以硅膠G板為吸附劑，各溶液點(diǎn)樣量均為10 μl。以正己烷-乙酸乙酯（4：1）為展開劑，展開，待晾干后，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，于365 nm紫外光燈下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無干擾。結(jié)果見圖1。

2.2 大黃素含量測定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 以Diamonsil C18為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸溶液（79：21）為流動相，254 nm為檢測波長，在30℃柱溫，10 μl進(jìn)樣量，1.0 mL/min流速條件下檢測。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算不低于5000，大黃素峰對稱因子在0.95～1.05內(nèi)，且該峰與附近峰分離度≥1.57，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖2。

2.2.2 對照品溶液的制備 取大黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成40 μg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密移取本品30 mL，水浴蒸干，取8%鹽酸溶液20 mL分次加入蒸發(fā)皿中，溶解殘?jiān)⑾礈煺舭l(fā)皿，溶解液合并洗滌液，移置圓底燒瓶中，加三氯甲烷20 mL，水浴加熱回流3 h，取出，冷卻。用分液漏斗分取三氯甲烷層（取10 mL三氯甲烷分次洗滌燒瓶，洗液并入分液漏斗中），剩余鹽酸溶液再用三氯甲烷液萃取3次，每次15 mL，合并上述所有三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙舛ㄈ葜? mL，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取不含制何首烏的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系及范圍考察 精密稱取大黃素對照品（含量以98.7%計(jì)）0.01005 g，置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，取該溶液1mL，移至5mL量瓶中加甲醇定容，得濃度為79.35 μg/mL的溶液，取該溶液3mL，移至5mL量瓶中加甲醇定容，依次稀釋，得濃度為28.56，17.14，10.28，6.17 μg/mL的對照品溶液。分別吸取上述各溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下的條件檢測。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=34.43x+5.31（R2=0.999 8）。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液和“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件，分別在0，4，8，12，16 h測定大黃素的峰面積，計(jì)算得對照品溶液峰面積的RSD=0.69%，供試品溶液峰面積得RSD=1.56%，表明二者的穩(wěn)定性符合方法學(xué)要求。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次養(yǎng)血生發(fā)合劑6份，每份30mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件檢測，計(jì)算得大黃素平均含量為6.34 μg/mL，RSD=1.87%（n=6），表明該方法重復(fù)性好。

2.2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取同一批次養(yǎng)血生發(fā)合劑（含量為6.34 μg/mL）6份，每份15 mL，分別加入濃度為44.29 μg/mL的大黃素對照品溶液各2 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按”2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，得平均加樣回收率是103.42%，RSD=2.16%（n=6），表明所建方法符合含量測定要求。結(jié)果見表1。

2.2.9 含量測定 取3批次養(yǎng)血生發(fā)合劑（批號見表2），每批次取2份藥液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法檢測，計(jì)算大黃素含量。結(jié)果顯示，3批次養(yǎng)血生發(fā)合劑中大黃素平均含量為6.33 μg/mL，RSD =1.32%。結(jié)果見表2。

3 討論

本研究建立了養(yǎng)血生發(fā)合劑中當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂的TLC鑒別方法。同時，由于薄層鑒別常受點(diǎn)樣量、溫度、濕度、薄層板廠家、樣品批次等因素的影響，本研究依據(jù)《云南省中藥材（民族藥材）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》對2藥的鑒別進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果表明，在15℃～25℃，50%～90%濕度，兩個不同廠家（青島海洋化工分廠、青島鼎康硅膠有限公司）薄層版條件下，3個批次養(yǎng)血生發(fā)合劑均可鑒別出當(dāng)歸和補(bǔ)骨脂。方中其余4藥的TLC鑒別中，菟絲子、牛膝、茯苓均存在陰性干擾，何首烏中的大黃素已作為定量指標(biāo)，故本研究并未建立何首烏及上述3味藥的TLC鑒別方法。

本文對含量測定中供試品溶液的前處理方法進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明，是否進(jìn)行水解、水解所用酸的種類、所用酸的用量、水解時間、水解后酸液的萃取次數(shù)、水解所用酸的濃度對大黃素的檢測均有影響，其中前4項(xiàng)影響較大，其余則影響較小。

本研究對當(dāng)歸中的阿魏酸進(jìn)行了含量測定研究，發(fā)現(xiàn)其存在陰性干擾且含量偏低。在對菟絲子中的金絲桃苷進(jìn)行測定時，未能檢出金絲桃苷，推測可能與金絲桃苷在本合劑中的穩(wěn)定性不佳有關(guān)。同時，補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂素亦存在陰性干擾，而異補(bǔ)骨脂則未能檢測到。牛膝中的β-蛻皮甾酮在原藥材中的含量較低（2015年版中國藥典規(guī)定應(yīng)≥0.030%），考慮到處方藥材制備為口服液后所含含量更低，故不宜作為定量指標(biāo)。剩余的茯苓在藥典中則無“含量測定”項(xiàng)，故本研究建立了何首烏中大黃素的含量測定方法。

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（收稿日期：2020-09-17）