藍光脅迫對金線蓮游離氨基酸組分的影響

王 弛，劉 慧 ， 吳文晞 ，褚克丹，趙 峰*

(1. 福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122；2. 福建省恒正檢測技術有限公司，福建 福州 350199)

藥材金線蓮為蘭科金線蓮屬植物金線蓮(Anoectochilus roxburghii)的干燥全草，由于人為釆挖以及自然生境破壞，野生金線蓮瀕臨滅絕，人工繁育成為解決金線蓮市場供應不足問題的一種重要途徑[1]。金線蓮在栽培生長過程中會受到各種環(huán)境因子的影響，光作為最重要的環(huán)境因子之一，對金線蓮的分化發(fā)育、形態(tài)建成及代謝等方面有深刻影響。另外在給予植物一定的非生物脅迫后，一些游離氨基酸的含量會增加來減輕脅迫的不利影響[2—6]。因此研究光質(zhì)對金線蓮游離氨基酸的影響，對提高金線蓮產(chǎn)量與品質(zhì)具有指導意義，有助于緩解有限的金線蓮產(chǎn)量與越來越大的需求之間的矛盾。Ye等[7]和冼康華等[8]通過研究不同光質(zhì)對金線蓮生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)藍光培養(yǎng)下的金線蓮鮮重最高，莖最健壯，葉面積最大，并且光合色素濃度和抗氧化酶活性(CAT、SOD 和 POD)最高。吳水華等[9]通過使用柱前自動衍生HPLC-FLD法測定不同金線蓮的游離氨基酸含量，共檢測出15種游離氨基酸，發(fā)現(xiàn)組培金線蓮移植至林下后，氨基酸含量明顯下降，移植時間越長，降低越明顯。許夢潔等[10]使用全自動氨基酸分析儀比較不同種質(zhì)的金線蓮游離氨基酸含量，共檢測出16種氨基酸，天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量明顯高于其他氨基酸組分。前人研究發(fā)現(xiàn)，藍光可以促進金線蓮黃酮類成分與多糖類成分含量增加，對于游離氨基酸組分含量變化缺乏系統(tǒng)研究。本研究通過AQC柱前衍生結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)，對藍光脅迫下的金線蓮游離氨基酸進行定量測定，并探究藍光脅迫對金線蓮游離氨基酸的影響，為栽培過程中尋找有效提高生物量的光照條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及實驗處理

將泥炭土(丹麥，品氏)和珍珠巖(中國，德沃多)按照2:1(體積比)混合成栽培基質(zhì)，稱取40 g，裝入塑料育苗盆(口徑8 cm，盆高11 cm，底徑4.8 cm)，并栽入金線蓮苗(組培4個月)，澆足量水后，在LED人工氣候箱進行1個月適應性栽培，期間每周澆施60 mL去離子水。

實驗設置四組光照條件處理，對照組(CK)給予30 μmol·m–2·s–1白光，其余三組在對照組的基礎上，提供三種強度藍光，分別為 60 μmol·m–2·s–1(L 組)、120 μmol·m–2·s–1(M 組)和 180 μmol·m–2·s–1(H 組)，培養(yǎng)箱環(huán)境參數(shù)為光周期14 h、溫度25 ℃、相對濕度75%，隨后，按照一周澆去離子水1次(每盆60 mL)，下一周澆施營養(yǎng)液(濃度 1 g·L–1，每盆 60 mL)的頻率，持續(xù)管理56 d。期間分別取(第0、7、14、21、28、42和56天)全草樣品，去離子水洗凈后，液氮速凍后，凍干，置于-80 ℃冰箱。

1.2 儀器與試劑

Nexera X2 LC-30A高效液相色譜儀(日本，Shimadzu公司)，串聯(lián)Sciex 4500 Q-Trap質(zhì)譜儀(美國，Sciex公司)、XS 105分析天平(美國，梅特勒公司)、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、Milli-Q Integral 5超純水機(默克公司)、LGJ-10FD真空冷凍干燥機(北京松源華興生物技術有限公司)、DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)、MM400球磨儀(德國Retsch公司)。

33種氨基酸標品：同型半胱氨酸(Hcy)、γ-氨基丁酸(γ-ABA)、α-氨基丁酸(α-ABA)、β-氨基丁酸(β-ABA)、半胱氨酸(Cys)、丙氨酸(Ala)、茶氨酸(Thea)、蛋氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Giy)、胱氨酸(Cys2)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、瓜氨酸(Cit)、精氨酸(Arg)、肌氨酸(Sar)、1-甲基-L-組氨酸(1-M-His)、3-甲基-L-組氨酸(3-M-His)、賴氨酸(Lys)、羥賴氨酸(Hy-Lys)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Lle)、鳥氨酸(Orn)、羥脯氨酸(Hy-Pro)、色氨酸(Trp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、纈氨酸(Val)、組氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)均購自源葉生物科技有限公司(中國，上海)，色譜純甲醇、色譜純乙腈、甲酸銨(中國，安譜實驗科技股份有限公司)。

1.3 游離氨基酸組分測定方法

參考陳思肜等[11]的方法，按照AQC柱前衍生法測定33種游離氨基酸組分。稱取樣品0.050 g，加5 mL超純水渦旋混合，超聲30 min后，冷凍離心5 min(10 000 r·min–1，4 ℃)，上清液過 0.22 μm 微孔濾膜后取10 μL與硼酸鹽緩沖溶液70 μL (pH 8.8)在內(nèi)襯管中混合，加入AQC試劑20 μL，渦旋混合后55 ℃烘箱衍生10 min，冷卻后使用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(UHPLC-MS/MS)測定。色譜條件為柱溫40 ℃；流速0.3 mL·min–1；流動相A：甲酸銨溶液(10 mmol·L–1，pH 6.0)；流動相 B：乙腈。梯度洗脫程序：0～12 min，5% B～20% B；12～16 min，20% B～35% B；16～18 min，35% B～90% B；18～19 min，90% B～5% B；19～23 min，5% B。進樣量1 uL。質(zhì)譜條件為電噴霧電離(ESI)源；正離子模式為多反應檢測模式；電噴霧電壓4500 V，氣簾氣壓力30 psi，輔助氣溫度550 ℃，噴霧氣壓力55 psi，輔助加熱氣壓力55 psi。

1.4 數(shù)據(jù)分析

樣品中氨基酸含量以干基計，水分含量測定方法參考GB 5009.3-2016。用Excel表對數(shù)據(jù)進行初步處理，采用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，所有處理在P<0.05水平下比較氨基酸之間的含量差異。圖表采用PRISM 8.0繪制。對氨基酸定量結(jié)果標準化后使用TBtools軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金線蓮游離氨基酸總含量分析

由圖1可知，隨著光照時間的延長，處理組游離氨基酸總量呈先增加后減少的變化趨勢。處理組在第7天時，L組含量顯著降低，M組和H組含量與CK組無顯著性差異；第14天時，各處理組含量均有不同程度的增加，H組含量顯著高于CK組；第21天各處理組含量均顯著下降，分別為第14天時含量的64.1%、76.6%、63.6%；第28天到56天，處理組游離氨基酸含量呈波動下降趨勢，均顯著低于CK組。

圖1 不同強度藍光對金線蓮游離氨基酸含量的影響Fig. 1 The effect of different intensities of blue light on the amount of free amino acids in Anoectochilus roxburghii

2.2 游離氨基酸組分的變化

將不同處理時間的游離氨基酸組分含量匯總制成熱圖(圖2)，可以看出絕大多數(shù)游離氨基酸組分在第14天含量最高，呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢。

圖2 金線蓮藍光脅迫下游離氨基酸組分及含量變化熱圖Fig. 2 Heat map of free amino acid composition and content change in Anoectochilus roxburghii under blue light stress

在金線蓮中共檢測出22種游離氨基酸組分。其中天冬酰胺含量最高，未進行脅迫處理時的含量為62.44 mg·g–1；其次是天冬氨酸，含量為 33.87 mg·g–1；第 3是 γ-氨基丁酸，含量為 4.12 mg·g–1；第 4和第5位是谷氨酰胺和精氨酸，含量分別為 3.19 mg·g–1和2.90 mg·g–1。這5種游離氨基酸含量遠高于其他游離氨基酸組分。根據(jù)游離氨基酸組分的變化情況分為三類：(A) 僅在藍光脅迫第14天時含量最高，如脯氨酸、精氨酸、色氨酸、纈氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸；(B)在脅迫第7天和第14天含量上升的游離氨基酸，如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、丙氨酸和組氨酸；(C)在CK組和脅迫第7、14天含量一直維持高含量的游離氨基酸，如絲氨酸、肌氨酸、賴氨酸、γ-氨基丁酸和天冬氨酸(圖2)。

2.3 金線蓮中氨基酸含量間的相關性分析

由表1可知，天冬酰胺與谷氨酰胺的相關性系數(shù)最高，達 0.87，兩者呈極顯著正相關，天冬酰胺與其他游離氨基酸組分同樣呈極顯著正相關，相關性從大到小依次為γ-氨基丁酸、肌氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、賴氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸和鳥氨酸；天冬氨酸與γ-氨基丁酸相關性系數(shù)最高，為 0.88；蛋氨酸與天冬酰胺、天冬氨酸、瓜氨酸、肌氨酸和賴氨酸呈極顯著負相關。綜上所述，高含量的氨基酸作為藍光脅迫下金線蓮游離氨基酸含量變化的主要指標呈現(xiàn)顯著正相關。

表1 金線蓮中游離氨基酸含量間的相關性Table 1 Correlationam ong the content of free aminoacids in Anoectochilus roxburghii

2.4 主成分分析

對不同脅迫時間下金線蓮游離氨基酸組分進行主成分分析，計算主成分特征值、方差貢獻率和累積方差貢獻率，結(jié)果如表2、表3。金線蓮中游離氨基酸前 5個主成分的累計方差貢獻率達87.153%，累計貢獻率大于85%則認為這5個因子對金線蓮中游離氨基酸的評價起主導作用[12]。第1主成分特征值為11.052，方差貢獻率為50.237%，代表金線蓮中 22種游離氨基酸組分含量全部檢測結(jié)果50.237%的信息，而由旋轉(zhuǎn)后的主成分因子載荷矩陣可知，第1主成分中蘇氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、肌氨酸、組氨酸、天冬酰胺和酪氨酸的系數(shù)占比大于 0.8，故將其作為金線蓮特征氨基酸進一步分析。

表2 主成分分析特征值及方差貢獻率Table 2 Principal component analysis eigenvalues and variance contribution rate

表3 主成分矩陣Table 3 Principal component matrix

以上8種特征游離氨基酸中，天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、蘇氨酸和組氨酸均含量較高，其在CK中的百分含量依次為：55.2%、2.8%、0.3%、0.2%、0.1%，它們在脅迫第14天后含量達到最高(相較CK組增加幅度分別為11.2%、66.8%、90.1%、47.2%、49.0%)，但藍光強度與氨基酸增幅間未見顯著正相關；而纈氨酸和酪氨酸含量上升幅度與藍光強度間確存在顯著呈正相關(相關系數(shù)分別為0.45和0.44)，第14天高強度藍光處理組較CK組的提高幅度分別高達97.5%和85.3%，但兩種氨基酸在金線蓮中絕對含量較低，分別為0.1%和0.07%；對肌氨酸而言，短期的藍光脅迫可小幅促進其含量上升(24.0%～34.1%)。

2.5 聚類分析

對不同時間下金線蓮的游離氨基酸含量進行聚類分析(Ward法，歐氏距離)，結(jié)果如圖3。在距離10處將處理組分為3類，第42天和56天的金線蓮聚為一類，游離氨基酸組分含量最低；第 21天和28天的金線蓮聚為一類，含量為中等；CK組、第7天和第14天的金線蓮聚為一類，游離氨基酸組分含量最高。

圖3 不同時間藍光脅迫金線蓮游離氨基酸含量聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of free amino acid content of Anoectochilus roxburghii at different times of blue light stress

3 討論

氨基酸作為蛋白質(zhì)的組成部分，在生物的物質(zhì)合成、信號傳遞和應激反應中起重要作用[13]。本實驗采用 AQC柱前衍生法測定不同強度藍光脅迫下金線蓮游離氨基酸組分，相比前人的研究[9—10,14]，在金線蓮中額外檢測到 γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、瓜氨酸、肌氨酸和鳥氨酸等6種氨基酸。Koppitz等[15]發(fā)現(xiàn)天冬酰胺因其高 N/C比值作為植物N代謝中主要的運輸和儲存化合物。金線蓮在藍光脅迫初期，天冬酰胺含量顯著增加，這與 Leap等[16]的研究一致，但隨著時間延長，含量逐漸下降，這可能是因為植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的合成積累加強，天冬酰胺被大量消耗[17]。γ-氨基丁酸是一種應激指標[18]，在植物遭受非生物脅迫時快速積累，金線蓮 γ-氨基丁酸含量在脅迫前期顯著增加，這與Xing等[19]的研究一致。蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸以天冬氨酸為底物，通過Asp家族氨基酸途徑合成[20]，精氨酸和酪氨酸分別通過天冬氨酸-精氨酸琥珀酸合酶和天冬氨酸-預苯酸轉(zhuǎn)氨酶途徑合成[21]。以上游離氨基酸組分均在金線蓮藍光脅迫第14天時含量增加，推測是由于作為底物的天冬氨酸濃度上升導致，證明藍光脅迫對這些氨基酸的合成有促進作用。

4 結(jié)論

本實驗在金線蓮中檢測到22種游離氨基酸，其中天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、肌氨酸、組氨酸和酪氨酸為金線蓮特征氨基酸；短期藍光脅迫能促進多種游離氨基酸合成，在光密度30 μmol·m–2·s–1白光基礎上補充 180 μmol·m–2·s–1藍光時脅迫14 d時效果最好，是一種具有較高開發(fā)價值的栽培手段。