常量法和微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

趙玉榮，陳翠霞，張黎民，李幸凡，王文鑫

（中國(guó)石油大學(xué)（華東） 化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580）

實(shí)驗(yàn)教學(xué)在化學(xué)和生物學(xué)科教學(xué)中承擔(dān)著不可替代的作用，是學(xué)生從事科研工作的基礎(chǔ)。綜合性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)有利于將傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)“以教師為中心”的模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤耙詫W(xué)生為中心”的模式。綜合實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展有助于提高學(xué)生查閱文獻(xiàn)和歸納總結(jié)的能力，是提高學(xué)生創(chuàng)新能力的重要途徑之一[1-2]。蛋白質(zhì)是組成人體細(xì)胞的基本成分，機(jī)體的重要生命活動(dòng)都需要蛋白質(zhì)的參與，它是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者[3-4]。蛋白質(zhì)測(cè)定是指通過(guò)物理或化學(xué)方法對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，是生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中最常用的基本分析方法之一。測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法包括凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法（Bradford 法）等。其中，Bradford 法因具有靈敏度高、測(cè)定快速簡(jiǎn)便和干擾物少等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注[5-11]?；贐radford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)是生物化學(xué)本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要組成部分，但實(shí)驗(yàn)一般基于一種方法進(jìn)行，往往導(dǎo)致兩方面問(wèn)題：一方面，學(xué)生不能很好地掌握常量法和微量法的區(qū)別；另一方面，單一儀器的應(yīng)用很難解決多分組實(shí)驗(yàn)擁擠等資源緊張的問(wèn)題?；诖?，本文設(shè)計(jì)了利用紫外分光光度計(jì)（常量法）和多功能酶標(biāo)儀（微量法）同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定的綜合性實(shí)驗(yàn)。這種方法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合時(shí)產(chǎn)生復(fù)合物導(dǎo)致染料的顏色發(fā)生變化的原理設(shè)計(jì)的，如圖1 所示。

圖1 Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理示意圖

染料考馬斯亮蘭G-250（二甲花青亮藍(lán)）的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465 nm，在酸性條件下其可與蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香氨基酸結(jié)合，形成復(fù)合物時(shí)，溶液呈現(xiàn)淺藍(lán)色，導(dǎo)致染料的最大吸收峰的位置變?yōu)?95 nm。在一定范圍內(nèi)，595 nm 處測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，因此可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[5-11]。

紫外分光光度計(jì)[12]和多功能酶標(biāo)儀[13-15]都是測(cè)量吸光度的儀器，但原理存在一定差異。紫外分光光度計(jì)在測(cè)量過(guò)程中可以通過(guò)設(shè)置特定波長(zhǎng)的單色光直接作用于樣品（見(jiàn)圖2(a)），進(jìn)而測(cè)得其在特定波長(zhǎng)的吸光度；而多功能酶標(biāo)儀則首先通過(guò)一定波段的濾光片獲得目標(biāo)波段，經(jīng)過(guò)光路改變器改變?nèi)肷涔獾姆较?，從頂部垂直照射在樣品上（?jiàn)圖2(b)），進(jìn)而測(cè)得樣品的吸光度。另外，兩種測(cè)量方法使用的樣品池不同，紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度一般用常量石英比色皿樣品池，而多功能酶標(biāo)儀則使用微量孔板（如96 孔板或384 孔板），使用移液槍將樣品轉(zhuǎn)移到孔板中。由于測(cè)量樣品的體積不同，上述兩種方法分別被稱為常量法和微量法。相比于紫外分光光度計(jì)，多功能酶標(biāo)儀根據(jù)用途的特殊性限定了范圍和設(shè)置界面，快速且簡(jiǎn)便。同時(shí)，多功能酶標(biāo)儀可同時(shí)在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)幾十組樣品，工作效率大大提高，這可保證不同樣品在相同靜置時(shí)間和儀器狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)定。

圖2 紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀的工作原理

本實(shí)驗(yàn)首先配制了不同濃度的蛋白溶液并進(jìn)行了吸光度測(cè)定，在此基礎(chǔ)上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，隨后對(duì)未知樣品進(jìn)行測(cè)定，將其吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程即可求得未知樣品中的蛋白含量。在此基礎(chǔ)上，考察了SDS 對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的影響并分析了原因。實(shí)驗(yàn)中，將學(xué)生分為兩組，在測(cè)量蛋白質(zhì)含量和SDS 干擾時(shí)僅選擇一種儀器進(jìn)行試驗(yàn)即可。這樣，每組學(xué)生均可使用兩種儀器進(jìn)行吸光度測(cè)定，有助于拓寬學(xué)生的知識(shí)面。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，一方面，有助于學(xué)生同時(shí)掌握常量法和微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，了解上述兩種儀器工作原理、操作流程和使用方法，為今后從事科研工作奠定基礎(chǔ)。另一方面，由于多功能酶標(biāo)儀和紫外分光光度計(jì)的配合使用，將大大提高多分組實(shí)驗(yàn)的測(cè)量效率，同時(shí)有助于學(xué)生學(xué)習(xí)和使用移液槍等常用工具，非常適合作為綜合性實(shí)驗(yàn)向本科生開(kāi)設(shè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

（1）掌握考馬斯亮藍(lán)染色法定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理與方法。

（2）熟練紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀的使用和操作方法。

（3）了解紫外分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀測(cè)量方法的異同點(diǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)藥品：牛血清蛋白BSA（純度98%，Sigma）；考馬斯亮藍(lán)G-250（99.9%，Sigma）；乙醇（99%，上海國(guó)藥）；85%的磷酸溶液（上海國(guó)藥）；SDS（98%，Sigma）。

實(shí)驗(yàn)儀器：紫外光分光光度計(jì)/多功能酶標(biāo)儀；漩渦混合器；容量瓶；量筒；電子分析天平；EP 管/96孔板；試管架；移液槍?zhuān)灰淮涡詷岊^。

1.3 溶液配制

（1）配制1 mg/mL BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱量BSA 100 mg，用超純水溶解并稀釋至100 mL。

（2）配制0.01%（w/w）的考馬斯亮蘭G-250 染料溶液：稱量100 mg 的考馬斯亮蘭，先溶于50 mL 95%的乙醇，再加入85%的磷酸溶液120 mL，用超純水稀釋至1 000 mL。

（3）不同濃度的樣品液：取1 mg/mL 的BSA 母液，用超純水稀釋到所需濃度。

（4）配制SDS 100 μg/mL 的SDS 溶液：稱量SDS粉末10 mg，加入超純水溶解并稀釋至100 mL。

表1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度-標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制所需樣品的組分

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1）常量法和微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

（1）取9 支試管，按表1 分別編號(hào)后依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白（或未知蛋白）、去離子水和考馬斯亮蘭染料溶液，加完后立即在漩渦混合器上混合。

（2）上述混合后的樣品室溫下靜置3 min，兩組同學(xué)分別使用紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在595 nm 處的吸光度A595（使用紫外分光光度計(jì)時(shí)，選擇石英比色皿為樣品池，以第一管為空白，加入一定體積的溶液；使用酶標(biāo)儀時(shí)，取96 孔板，依次按照編號(hào)用移液槍移取樣品200 μL 至對(duì)應(yīng)孔中，每個(gè)樣品平行測(cè)定5 組求平均值）。

（3）分別以蛋白濃度和A595為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)作圖并進(jìn)行直線擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（Y=aX+b）。

（4）測(cè)量未知蛋白樣品的吸光度A595，將測(cè)量值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求得未知樣品中的蛋白含量。

2）SDS 干擾試驗(yàn)。

（1）取7 支試管，分別編號(hào)后按表2 劑量依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白、SDS、超純水和考馬斯亮蘭染料溶液。每支試管加完后，立即在漩渦混合器上混合。

（2）將上述溶液混合后靜置3 min，使用紫外分光光度計(jì)或多功能酶標(biāo)儀（本文僅使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量），測(cè)量595 nm 處吸光度A595。分別以A595和SDS 濃度為縱、橫坐標(biāo)作圖，繪制SDS 干擾試驗(yàn)的曲線，在此基礎(chǔ)上分析其干擾機(jī)理。

表2 測(cè)定SDS 干擾實(shí)驗(yàn)曲線的樣品編號(hào)及不同成分的含量

圖3 通過(guò)常量法（紫外分光光度計(jì)）測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與討論

2.1 常量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

首先利用常量法測(cè)定了蛋白質(zhì)含量，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量了表1 中不同濃度的BSA 溶液與染料作用后在595 nm 處的吸光度值，作為縱坐標(biāo)，BSA 濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行擬合，如圖3 所示。通過(guò)擬合曲線得到相關(guān)系數(shù)R2為0.996 72，相關(guān)性好，可用于進(jìn)一步標(biāo)定和計(jì)算未知蛋白質(zhì)的濃度。此時(shí)，本文進(jìn)一步對(duì)未知蛋白1 和2 進(jìn)行測(cè)定，其在595 nm 處的吸光度值分別為0.543 和0.760，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出未知蛋白濃度為12.62 μg/mL 和18.63 μg/mL。

2.2 微量法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

隨后利用微量法測(cè)定了蛋白質(zhì)的含量，通過(guò)酶標(biāo)儀同時(shí)測(cè)量了表1 不同濃度的BSA 溶液與染料作用后在595 nm 處的吸光度值（每組樣品平行測(cè)定5 個(gè)孔求平均值），以其為縱坐標(biāo)，BSA 濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行作圖，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行擬合，如圖4 所示。通過(guò)擬合曲線得到相關(guān)系數(shù)R2為0.998 08，相關(guān)性好，可用于進(jìn)一步標(biāo)定和計(jì)算未知蛋白質(zhì)的濃度。此時(shí)，進(jìn)一步對(duì)未知蛋白 1 和 2 進(jìn)行了吸光度測(cè)定，其在595 nm 處的吸光度值分別為0.323 和0.430，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出未知蛋白濃度為 14.70 μg/mL 和20.15 μg/mL，與通過(guò)常量法測(cè)得的數(shù)據(jù)相比，更接近未知蛋白的實(shí)際濃度15 μg/mL 和20 μg/mL，這主要是由于多功能酶標(biāo)儀在測(cè)量過(guò)程中使用孔板，每次可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，每個(gè)樣品可平行測(cè)定多組，保證了同樣的儀器狀態(tài)和樣品放置時(shí)間，一定程度上提高了測(cè)量的準(zhǔn)確度，且大大提升了測(cè)量效率。但由于孔板的利用，也會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)增加。

上述結(jié)果表明，盡管常量法和微量法均可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定，但兩種方法的測(cè)量原理、所需樣品量、測(cè)量效率以及測(cè)量準(zhǔn)確度均存在差異，研究中需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。當(dāng)需要測(cè)量的樣品數(shù)量多，體積小時(shí)，應(yīng)該選擇多功能酶標(biāo)儀利用微量法進(jìn)行測(cè)定；而當(dāng)樣品數(shù)量較少，樣品體積較多時(shí)，可選擇紫外分光光度計(jì)用常量法進(jìn)行測(cè)定。如果樣品數(shù)量和體積居中，可以依據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)量準(zhǔn)確度和實(shí)驗(yàn)成本等因素的要求選擇其中一種方法進(jìn)行測(cè)試或選取兩種方法平行驗(yàn)證。

圖4 通過(guò)微量法（酶標(biāo)儀）測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 SDS 對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的干擾

盡管Bradford 法具有很多優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定缺點(diǎn)，如一些物質(zhì)存在會(huì)干擾測(cè)量的準(zhǔn)確性，這些物質(zhì)主要包括去污劑、Triton X-100 和SDS 等，本部分考察了SDS 對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的干擾。利用常量法對(duì)表2的樣品進(jìn)行了測(cè)定，分別以吸光度和SDS 濃度為縱、橫坐標(biāo)進(jìn)行作圖，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 SDS 對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的干擾曲線

從上圖可以看出，SDS 可顯著干擾蛋白質(zhì)含量測(cè)定，測(cè)量結(jié)果表明：吸光度隨SDS 濃度的增加出現(xiàn)了先減小后增大的現(xiàn)象，造成上述結(jié)果的主要原因是，SDS 可以有效斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)，當(dāng)SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合后會(huì)形成蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物，導(dǎo)致蛋白質(zhì)帶上大量的負(fù)電荷，阻礙染料與堿性氨基酸和芳香族氨基酸的有效結(jié)合，導(dǎo)致吸光度降低。而當(dāng)SDS 加入蛋白質(zhì)溶液后，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，又會(huì)使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)更加伸展，使原來(lái)一些包裹在結(jié)構(gòu)中未與染料結(jié)合的堿性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出來(lái)，促進(jìn)染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，因此導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)先增加后減小的情況。

3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式與內(nèi)容拓展

本實(shí)驗(yàn)將常量法和微量法結(jié)合用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，分析了兩種方法的異同點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，考察了SDS 對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的干擾，發(fā)現(xiàn)隨著SDS 含量的增加，蛋白濃度出現(xiàn)了先增加后減小的情況，這主要是由于靜電作用和蛋白質(zhì)變性兩方面的因素造成。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，可實(shí)現(xiàn)如下目標(biāo)：

（1）學(xué)生可掌握Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法和原理，即染料單體與復(fù)合物顏色不同，分別在465 nm 和595 nm 處存在吸收。

（2）學(xué)生可掌握紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀的使用方法和原理，了解常量法和微量法測(cè)定的異同點(diǎn)。同時(shí)紫外分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀的綜合運(yùn)用可提高測(cè)量效率，解決本科實(shí)驗(yàn)室人數(shù)多、大型實(shí)驗(yàn)儀器相對(duì)較少的問(wèn)題。

（3）處理數(shù)據(jù)的過(guò)程中，學(xué)生可掌握利用Origin處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的方法，提高學(xué)生的數(shù)據(jù)處理能力。而針對(duì)測(cè)量結(jié)果，特別是SDS 干擾實(shí)驗(yàn)，有助于學(xué)生理解氨基酸的電性和蛋白質(zhì)變性等生物化學(xué)中的重要概念和知識(shí)點(diǎn)，提高學(xué)生分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。

（4）由于不同分組之間需要協(xié)調(diào)紫外分光光度計(jì)和多功能酶標(biāo)儀的使用，該實(shí)驗(yàn)需要學(xué)生協(xié)作完成，這可有效提高學(xué)生的合作和溝通能力，為今后的科研工作奠定良好的基礎(chǔ)。