外泌體在心血管疾病中的研究進展

梁艷勝，劉文卉，盛其萍，劉平

（山東大學第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 濟南 250033）

《中國心血管疾病報告2018：最新摘要》中顯示心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）的發(fā)病率不斷增加，預計在未來十年內(nèi)將繼續(xù)呈上升趨勢；目前40%的居民死亡歸因于CVD，高于因癌癥或其他疾病引起的死亡率[1]。由此可見，我國CVD 的發(fā)展情況不容樂觀。近年來，隨著對外泌體研究的逐漸深入，外泌體在CVD中的抗炎、改善心室重構(gòu)、促進血管新生等作用受到越來越多學者的重視[2-4]。本文就外泌體在CVD中發(fā)病機制、診斷、治療的研究進展進行綜述。

1 外泌體概述

外泌體是一類大小約40～100 nm，具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的細胞外囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、miRNA、DNA 等生物分子。可由B淋巴細胞、血小板、少突膠質(zhì)細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和干細胞等多種細胞產(chǎn)生，廣泛分布在唾液、羊水、血液、尿液、母乳、腦脊液、淋巴液等多種體液中[5-6]。在不同的病理生理條件下不同的細胞會產(chǎn)生不同類型的外泌體，通過細胞間通訊發(fā)揮生物學功能。

2 外泌體與心血管疾病

2.1 動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥反應。氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）通過刺激巨噬細胞和內(nèi)皮細胞，在AS 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，用ox-LDL刺激小鼠和人的巨噬細胞，分離外泌體并進行鑒定，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-146a 可以通過減少細胞遷移、促進巨噬細胞在血管壁的包裹以及誘導氧化應激等方面加速AS 的發(fā)展[7-8]；采用ox-LDL 處理血管內(nèi)皮細胞時，可通過外泌體miR-155、miR-505、lncRNA-MALAT1 影響巨噬細胞轉(zhuǎn)化、誘導中性粒細胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）形成、觸發(fā)高脂血癥、炎癥反應等方面，加重AS 的發(fā)生[9-12]。但是也有很多外泌體在AS中發(fā)揮保護作用。Shan等[13]證實lncRNA-RNCR3 在內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞中表達，與Kruppel 樣因子 2（Kruppel like factor 2，KLF2）和 miR-185-5p形成反饋環(huán)，調(diào)節(jié)細胞功能，具有AS保護作用。Chen等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)抑制lncRNA-GAS5 可以抑制內(nèi)皮細胞的凋亡，也可以發(fā)揮抗AS的作用。由此可見，不同的外泌體既可以加重AS，也具有AS保護作用。

此外，還有很多細胞來源的外泌體通過核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑影響AS 的發(fā)生。Gao 等[15]從骨髓樹突狀細胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs）培養(yǎng)液中分離出外泌體，用這些外泌體刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），觀察到這些外泌體可以通過腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）介導的NF-κB 途徑增加內(nèi)皮炎癥；同時該課題組還在體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)ApoE小鼠注射BMDCs 分泌的外泌體12 周后，AS 病變明顯增加。但是，Li 等[16]發(fā)現(xiàn)經(jīng)低強度脈沖超聲（low intensity pulsed ultrasound，LIPUS）處理的 BMDCs 來源的外泌體miR-16 和miR-21，可以通過抑制NF-κB 信號通路而抑制TNF-α誘導的內(nèi)皮炎癥反應。也有學者發(fā)現(xiàn)血小板源性外泌體中miR-21、miR-25-3p、miR-223和miR-339的水平升高，可作用于NF-κB 信號通路，抑制促炎因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、細胞間粘附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和TNF-α的表達，減輕AS小鼠模型的血管內(nèi)皮細胞炎癥[17-18]。Shi等[2]在研究中指出人單核細胞系的細胞外囊泡中含有外泌體血清熱休克蛋白27（heatshock protein 27，HSP27），通過Toll樣受體4（tolllikereceptor4，TLR4）激活NF-κB，促進NF-κB依賴性的抗炎因子白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的釋放，減輕炎癥反應和AS 的發(fā)生?？偟膩碚f，外泌體也可以通過作用于NF-κB通路，影響抗炎因子和促炎因子的表達，從而影響AS的進展。

2.2 急性心肌梗死 急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，是心血管疾病患者死亡的主要原因。近年來的研究表明，外泌體在AMI 的診斷和治療方面具有重要作用。Su 等[19]對 6 例 AMI 和 6 例穩(wěn)定性冠心病患者 miRNAs 的差異表達分析中發(fā)現(xiàn)外泌體miR-3、miR-4、miR-507、miR-656 和miR-1915-3p在AMI標本中的表達明顯低于在穩(wěn)定性冠心病標本中的表達，說明外泌體miRNAs可能成為協(xié)助診斷AMI的指標。另外，多種干細胞來源的外泌體在AMI中的治療作用越來越受到廣大研究人員的重視：Zhang等[20]用左前降支結(jié)扎法構(gòu)建大鼠AMI模型，將低氧預適應的骨髓間充質(zhì)干細胞（bonemesenchymal stem cells，BMSCs）外泌體注射到大鼠心肌內(nèi)，發(fā)現(xiàn)AMI大鼠的miRNA-24水平上調(diào)，通過miRNA-24的上調(diào)可以抑制心肌細胞凋亡，縮小心肌梗死面積，改善心功能。Huang等[4]還發(fā)現(xiàn)如果采用AMI后第30分鐘心肌內(nèi)注射BMSCs 中分離出的外泌體聯(lián)合AMI 后第3 天進行BMSCs 移植的辦法，也可以減小心肌梗死面積，增加新血管形成，使心臟功能得到最大的改善。Ju 等[21]將心臟間充質(zhì)干細胞（cardiac mesenchymal stem cells，CMSCs）分泌的外泌體通過心肌內(nèi)注射的方式注射到小鼠心肌梗死邊緣區(qū)，證實心肌梗死后心肌內(nèi)注射CMSCs 分泌的外泌體可促進心肌細胞增殖和心臟血管生成，保護心功能。Pan 等[22]構(gòu)建大鼠AMI和缺氧誘導的H9C2 的體內(nèi)體外模型，發(fā)現(xiàn)來自miR-146a 修飾的脂肪干細胞（adipase derived stem cells，ADSCs）的外泌體通過下調(diào)早期生長反應因子1（early growth response 1，EGR1），能夠逆轉(zhuǎn)AMI 或缺氧誘導的TLR4/NF-κB信號的激活，抑制細胞凋亡、炎癥反應和心肌纖維化，減輕AMI誘導的心肌損傷。

2.3 心力衰竭 心力衰竭（heart failure，HF）是多種心血管疾病的終末狀態(tài)，病理上有心肌細胞肥大、心肌纖維化等表現(xiàn)。有研究表明外泌體可以影響HF的病理變化：Nie等[23]在慢性心力衰竭患者及心功能不全小鼠動物模型中均發(fā)現(xiàn)miR-217表達明顯增加，并證實miR-217通過調(diào)節(jié)磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）加劇了心肌肥大、纖維化和心功能不全。也有學者發(fā)現(xiàn)外泌體可能成為HF診斷的生物標志物：Wang等[24]在31例HF患者血漿中提取的外泌體及血管緊張素Ⅱ處理的心臟成纖維細胞中分泌的外泌體中均檢測到miR-425和miR-744表達下調(diào)。膠原蛋白和α-平滑肌肌動蛋白過表達時可以使miR-425 和miR-744 下調(diào)，進而導致心臟成纖維細胞纖維化，而在培養(yǎng)的心臟成纖維細胞中過表達miR-425或miR-744時可顯著抑制血管緊張素誘導的膠原形成和纖維化形成。由此推測，miR-425 和miR-744 的下調(diào)可能與心肌纖維化和HF 有關(guān)。還有研究人員發(fā)現(xiàn)外泌體在HF 中可能具有治療作用：Qiao 等[3]從HF 患者的外源性基質(zhì)細胞中分離出外泌體，發(fā)現(xiàn)這些外泌體在體外會破壞心肌細胞增殖及內(nèi)皮管形成的能力，在體內(nèi)會加重左心室重構(gòu)。進一步研究發(fā)現(xiàn)在這些外泌體中miR-21-5p 表達異常 ，miR-21-5p 可以通過抑制 PTEN 增強Akt 激酶活性，促進血管生成和心肌細胞存活。因此，恢復HF 患者體內(nèi)miR-21-5p 的表達可能有利于HF 患者的治療，這也為HF的治療提供了新的手段。

2.4 肺動脈高壓 肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）指肺動脈壓力升高超過一定界值的一種血流動力學和病理生理狀態(tài)，可導致右心衰竭和肺血管重構(gòu)。外泌體在PH中的作用與肺動脈內(nèi)皮細胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）和肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cell，PASMCs）增殖和抗凋亡有關(guān)。Zhang 等[25]將ADSCs 與野百合堿吡咯（Monocrotaline pyrrole，MCTP）處理的人PAECs 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ADSCs 源性外泌體可以促進MCTP處理的人PAECs的增殖。將ADSCs移植后，使用野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導的PH 大鼠模型中也觀察到了類似的結(jié)果。進一步研究表明，這些作用的產(chǎn)生可能與miR-191 調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2（bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2）有關(guān)。Zhao 等[26]用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導 PAECs 損傷后 ，將PAECs 與PASMCs 共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)LPS 可促進PAECs 釋放外泌體，并且外泌體的釋放與LPS濃度呈正相關(guān)，用LPS處理后的PAECs 來源的外泌體可以內(nèi)化到PASMCs 內(nèi)，促進PASMCs 增殖，誘導PASMCs 抵抗凋亡。也有外泌體在PH 的診斷中存在一定價值：Ferrer等[27]將內(nèi)皮細胞和PASMCs共培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，外泌體可以將翻譯控制腫瘤蛋白（translationally controlled tumor protein，TCTP）從內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移到PASMCs，表明內(nèi)皮源性TCTP具有促進增殖和抵抗凋亡的作用。同時還在PH 動物實驗模型和特發(fā)性PH 患者中均發(fā)現(xiàn)TCTP 水平升高，也說明TCTP可能成為PH發(fā)生發(fā)展的潛在生物標志物。當然，還有學者發(fā)現(xiàn)了干細胞來源外泌體在PH 中的治療作用：Zhang等[28]建立MCT誘導的大鼠PH模型和缺氧誘導的細胞損傷模型，用人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液中的外泌體進行干預處理，發(fā)現(xiàn)這些外泌體可能通過上調(diào)PH 大鼠和缺氧性肺血管細胞Wnt5a的表達，在體內(nèi)可明顯減輕PH大鼠右心室肥厚和肺血管重構(gòu)，在體外能顯著抑制缺氧誘導的PAECs 凋亡和PASMCs 的增殖，這為日后治療PH 提供了新的思路。

2.5 糖尿病性心肌病 2013 年進行的一項全國流行病學研究顯示中國成年人的總體糖尿病標準化患病率約為10.9%，患有糖尿病的成年人比沒有糖尿病的成年人具有更高的全因死亡率，CVD 引起的死亡率增加最為明顯[1]。部分糖尿病患者后期可能出現(xiàn)糖尿病性心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM），最終可能進展為HF、心律失常及心源性休克。

DCM 具有心肌微血管內(nèi)皮細胞（cardiacmicrovascularendothelialcells，CMECs）損傷、心肌細胞（cardiomyocyte，CM）功能障礙、心肌脂肪變性等特征。Hu 等[29]建立了內(nèi)皮特異性Mst1轉(zhuǎn)基因小鼠以及鏈脲佐菌素誘導的糖尿病模型。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠分離的CM 中Mst1 蛋白含量增加，心功能更差，胰島素抵抗更嚴重。在體外實驗中，CM 可攝取CMECs 來源的外泌體，也可以增加Mst1 蛋白含量，抑制高糖培養(yǎng)CM 的自噬，促進細胞凋亡。Mst1 還可以通過減少死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（death domain-associate protein，DAXX）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）之間的相互作用，增強Mst1 和DAXX 的結(jié)合，破壞GLUT4 的膜轉(zhuǎn)位，抑制葡萄糖攝取。由此可見，DCM 的發(fā)病機制可能與CMECs 釋放的富含Mst1 的外泌體在抑制CM 自噬、促進凋亡和抑制糖代謝等方面的作用有關(guān)。有些外泌體在DCM 中也存在預測作用：de Gonzalo-Calvo 等[30]在排除干擾因素的情況下分析了2型糖尿病患者血清中心肌細胞富集的miRNA水平，并與年齡及體重指數(shù)相同的志愿者、高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠模型血清和脂質(zhì)負載的HL-1 細胞外泌體中的miRNA 進行分析 ，發(fā)現(xiàn) miR-1 和 miR-133a 水平較高 ，推測 miR-1 和miR-133a可能是心肌脂肪變性的獨立預測因子。也有一些學者發(fā)現(xiàn)了干細胞源性外泌體在DCM 中的治療作用：Lin等[31]在動物實驗中將大鼠分為對照組、糖尿病對照組和BMSCs 外泌體組。與糖尿病對照組比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)BMSCs 來源的外泌體處理后，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和Smad 2 mRNA 表達水平降低，TGF-β1 和Smad2 蛋白的表達下調(diào)，左心室膠原水平明顯降低。推測BMSCs來源的外泌體可能通過抑制TGF-β1/Smad2信號通路改善糖尿病心肌損傷和纖維化。

2.6 心房顫動 心房顫動（atrial fibrillation，AF）是一種常見的心律失常，可出現(xiàn)HF、腦卒中等嚴重并發(fā)癥。目前外泌體和AF 的研究相對較少，主要集中在AF 的診斷方面。Wang 等[32]對持續(xù)性AF 和竇性心律患者血漿外泌體miRNAs的表達水平進行高通量測序并對AF的危險因素進行分析時發(fā)現(xiàn)：單因素Logistic 分析顯示miR-142-5p、miR-223-3p、miR-483-5p與AF相關(guān)，多因素Logistic分析顯示miR-483-5p與AF獨立相關(guān)。Mun等[33]從室上性心動過速患者、陣發(fā)性AF 和持續(xù)性AF 患者血清中分離外泌體進行檢測，還發(fā)現(xiàn)在持續(xù)性AF患者中miRNA-103a、miRNA-107、miRNA-320d、miRNA-486 和miRNA-let-7b 的表達水平較高。可以發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體miRNAs 水平可能成為診斷AF 的生物標志物。Liu等[34]還在研究中發(fā)現(xiàn)ADSCs 來源的外泌體miR-320d 通過下調(diào)STAT3，可以抑制AF心肌細胞凋亡。這對于外泌體指導AF的治療提供了幫助，而外泌體在AF 中是否還有其他治療作用可能需要進一步的探索。

3 展望

自外泌體發(fā)現(xiàn)以來，其在CVD中的作用就引起了許多學者的關(guān)注。外泌體通過在細胞間的通訊作用，已經(jīng)在多種CVD的發(fā)病機制、診斷、治療中體現(xiàn)了其價值。但是，外泌體在CVD的研究依舊處于初級階段，還有很多問題需要進一步解決，未來的發(fā)展方向可能集中于以下幾個方面：①外泌體的提取、純化方法及過程較為復雜，且價格昂貴，在很多中心尚不能開展，需要進一步解決。②探討外泌體在lncRNA-miRNA-蛋白及信號通路中的作用，進一步了解外泌體在CVD中的發(fā)病機制。③探索外泌體在CVD 中作為疾病診斷或評估疾病預后的生物標志物的作用。④不同干細胞來源外泌體在CVD中的治療作用已被發(fā)現(xiàn)，但是如何靶向輸送仍需要進一步研究。