穩(wěn)定同位素比技術(shù)用于橄欖油的摻假鑒定

馬玉華，唐方東，劉佳煜，忻智煒，曾友石，杜 林，劉 衛(wèi)

(1.中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所，上海 201800；2.上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，上海 201203)

橄欖油富含不飽和脂肪酸(油酸占55%～83%)、角鯊烯、多酚以及維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有抗氧化、調(diào)節(jié)膽固醇、預(yù)防癌癥、美容的功效和調(diào)整人體生理機(jī)能的作用，享有“植物油皇后”、“液體黃金”等眾多美譽(yù)。近年來(lái)，橄欖油因其獨(dú)特的風(fēng)味和對(duì)人體的保健價(jià)值，受到廣大消費(fèi)者的青睞，在市場(chǎng)上的銷售價(jià)格也較高，一般為大豆油的5倍左右。由于橄欖油產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，市面上的橄欖油摻假、以次充好、產(chǎn)地冒用等違法行為屢禁不止。

傳統(tǒng)鑒定方法一般都是針對(duì)橄欖油中特征組分和特征峰進(jìn)行鑒別，存在一定的局限性，如檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、不適用于痕量摻雜分析、不能對(duì)橄欖油進(jìn)行產(chǎn)地溯源等[1-5]。有研究表明，應(yīng)用色譜主成分分析鑒定法，當(dāng)橄欖油與大豆油摻假比例達(dá)到6∶4時(shí)，才能測(cè)出油酸含量不滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[6]。因此，需要一種更有效、可量化的鑒定方法用于我國(guó)橄欖油進(jìn)口和銷售的市場(chǎng)監(jiān)督。

穩(wěn)定同位素比技術(shù)利用穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀測(cè)定物質(zhì)中碳、氫、氧、氮、硫等不同元素的同位素比值，具有靈敏度高、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，是摻假鑒定和產(chǎn)地溯源的主要研究方法之一，廣泛應(yīng)用于地質(zhì)學(xué)、水文學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域[7-11]。國(guó)外同位素比技術(shù)在橄欖油品質(zhì)鑒定的應(yīng)用廣泛[12-14]，同位素比的組成信息判別標(biāo)準(zhǔn)還被用于法律案件的參考[15]。目前，同位素比技術(shù)在我國(guó)橄欖油標(biāo)準(zhǔn)體系中的應(yīng)用尚處于空白，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究處于起步階段。已發(fā)表的文獻(xiàn)[15-19]對(duì)植物油的碳穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行了分析，而對(duì)植物油中氫穩(wěn)定同位素的研究較少。吳玉鑾等[20]測(cè)定了大豆油、花生油、玉米油、調(diào)和油的δ13C和δD；靳欣欣等[21]研究了對(duì)大豆油、玉米油摻雜芝麻油后，樣品油中的氫、碳同位素。目前，尚未見(jiàn)利用氫穩(wěn)定同位素技術(shù)進(jìn)行橄欖油摻偽鑒別的報(bào)道。

同位素比技術(shù)在植物油品質(zhì)鑒定應(yīng)用中，C、H兩種元素的研究最為廣泛。植物中的碳同位素豐度比組成與植物光合作用途徑有關(guān)，同時(shí)受植物生長(zhǎng)環(huán)境氣候條件的影響。一般可分為C3、C4、CAM植物，不同種類植物的δ13C值差異較大，油橄欖屬于C3植物。因此，碳同位素比技術(shù)可以有效鑒定C4植物的植物油(如玉米油)對(duì)橄欖油的摻假，但無(wú)法有效鑒定同屬于C3植物的植物油(如大豆油)對(duì)橄欖油的摻假，需要結(jié)合其他同位素豐度比的信息綜合分析。植物體內(nèi)的氫同位素豐度比組成受當(dāng)?shù)厮臈l件和氣候條件的影響。因此，植物體內(nèi)的氫同位素豐度比與地域密切相關(guān)，可以用于橄欖油的產(chǎn)地溯源。

為考察橄欖油中氫、碳穩(wěn)定同位素比值與其他植物油的差異，以及為同位素比技術(shù)用于橄欖油鑒定提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，本工作擬以市場(chǎng)上銷售的7種植物油為研究對(duì)象進(jìn)行氫、碳穩(wěn)定同位素比值檢驗(yàn)，并對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Flash EA 2000型元素分析儀、MAT-253型穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀、ConFlo IV型連續(xù)流接口裝置、1～10 μL F3單道可變量程移液槍：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)樣品IAEA-600(δ13CPDB=-27.771±0.043‰)、IAEA-CH-7(δDV-SMOW=-100.3±2.0‰)：美國(guó)NIST公司產(chǎn)品。

1.2 樣品采集

市面上銷售的7種植物油：包括7個(gè)品牌的橄欖油、4個(gè)品牌的花生油、5個(gè)品牌的玉米油、4個(gè)品牌的大豆油、3個(gè)品牌的葵花籽油、4個(gè)品牌的菜籽油和2個(gè)品牌的野山茶油。每種植物油取10 mL裝入棕色玻璃瓶中，密封，置于4 ℃下冷藏。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1氫穩(wěn)定同位素比分析 元素分析儀條件的設(shè)定：載氣(氦氣)吹掃流量180 mL/min，高溫裂解爐溫度1 400 ℃，色譜柱溫度85 ℃，參考?xì)?氫氣)流速100 mL/min，Disable Oxygen Injection點(diǎn)亮，不注入氧氣；接口裝置ConFlo IV條件設(shè)定：He稀釋壓力60 kPa。

1.3.2碳穩(wěn)定同位素比分析 元素分析儀條件的設(shè)定：載氣(氦氣)吹掃流量180 mL/min，高溫裂解爐溫度1 000 ℃，色譜柱溫度85 ℃，參考?xì)?CO2)流速100 mL/min，氧氣設(shè)為175 mL/min，注入2～4 s；接口裝置ConFlo IV條件設(shè)定：He稀釋壓力60 kPa。

測(cè)試精度δ13C≤0.06‰，δD≤0.4‰。

1.4 氫碳同位素比值檢測(cè)

1.4.1植物油樣品δD、δ13C的測(cè)量 在1.3節(jié)條件下對(duì)橄欖油及其他6種植物油樣本和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量5次，采用Isodat 3.0軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4.2同位素比值的表示及換算方法 同位素比值用δ(單位為‰)表示，δD、δ13C的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)分別為維也那標(biāo)準(zhǔn)平均海洋水(V-SMOW)和美國(guó)南卡羅萊納州白堊系Pee Dee組擬箭石化石(PDB)。計(jì)算公式示于式(1)：

(1)

式中，R為重同位素與輕同位素的豐度比，即D/H和13C/12C。

1.5 數(shù)據(jù)校正與分析

用IAEA-600和IAEA-CH-7兩種標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)樣本的δD、δ13C測(cè)量值進(jìn)行校正得到真實(shí)值，校正公式示于式(2)：

(2)

用SPSS軟件對(duì)橄欖油和其他6種植物油樣本檢測(cè)所得的δD、δ13C數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)對(duì)橄欖油的δD、δ13C進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 橄欖油與其他6種植物油的δD特征

采用元素分析儀-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀(EA-IRMS)檢測(cè)1 400 ℃下植物油中氫穩(wěn)定同位素比值，示于圖1，譜峰分別為參考?xì)釮2(Ref H2)、樣品中氫元素轉(zhuǎn)化的H2(Samp H2)。橄欖油與其他6種植物油的29份樣本中δD的箱式圖示于圖2。7種植物油中，δD均值由高到低依次為：橄欖油>豆油>葵花籽油>玉米油>菜籽油>野山茶油>花生油，其中橄欖油樣本中δD均值(-131.58±8.96)‰最高，花生油樣本中δD均值(-225.97±1.58)‰最低，詳細(xì)數(shù)據(jù)列于表1。其中，變異系數(shù)CV>5%的樣本有橄欖油和菜籽油，分析發(fā)現(xiàn)2種樣本中出現(xiàn)異常值。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，歐洲原產(chǎn)橄欖油的δD范圍為-165‰～125‰[22-23]，G品牌橄欖油不在此范圍內(nèi)，示于圖3，可能存在產(chǎn)地冒用現(xiàn)象，或摻雜有精制橄欖油而非標(biāo)稱的特級(jí)初榨橄欖油。菜籽油中A品牌原料產(chǎn)地為西班牙，且生產(chǎn)工藝為萃取而非其他品牌的榨取。去除異常值后，橄欖油和菜籽油的δD均值分別為(-134.07±7.08)‰和(-197.76±7.35)‰，變異系數(shù)分別為5.28%和3.72%。

圖1 植物油樣本中氫穩(wěn)定同位素比譜圖Fig.1 Hydrogen stable isotope ratio chromatogram of vegetable oils

圖2 不同品種植物油中δD值Fig.2 δD values of different kinds of vegetable oils

表1 橄欖油與其他6種植物油中δD值Table 1 δD values of olive oil and other six kinds of vegetable oils

圖3 橄欖油樣本中δD值與文獻(xiàn)調(diào)研歐洲原產(chǎn)橄欖油δD值對(duì)比Fig.3 Comparison of δD values in olive oil samples with literature δD values of European olive oil

7種植物油樣本中碳穩(wěn)定同位素比值總體有顯著差異(P<0.05)，橄欖油與花生油、玉米油、豆油、葵花籽油、菜籽油、野山茶油的δD均值分別相差91.90‰、56.49‰、41.53‰、50.71‰、63.69‰、90.72‰，存在顯著差異(P<0.05，近似于0)。因此，δD測(cè)量適用于鑒定其他種類植物油摻假橄欖油。

2.2 橄欖油與其他6種植物油的δ13C特征

采用元素分析儀-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀檢測(cè)1 000 ℃下植物油中碳穩(wěn)定同位素比值，示于圖4，譜峰分別為參考?xì)釩O2(Ref CO2)、樣品中碳元素轉(zhuǎn)化的CO2(Samp CO2)。橄欖油與其他6種植物油的29份樣本中δ13C的箱式圖示于圖5。7種植物油中，δ13C均值由高到低依次為：玉米油>橄欖油>葵花籽油>野山茶油>菜籽油>花生油>豆油，其中玉米油呈現(xiàn)典型C4植物特征，δ13C均值(-15.92±0.51)‰最高，其余6種植物油(包括橄欖油)呈現(xiàn)典型C3植物特征，豆油樣本中δ13C均值(-30.87±0.21)‰最低，詳細(xì)數(shù)據(jù)列于表2，變異系數(shù)CV均低于2%。

圖4 植物油樣本中碳穩(wěn)定同位素比譜圖Fig.4 Carbon stable isotope ratio chromatogram of vegetable oils

7種植物油樣本中碳穩(wěn)定同位素比值總體上有顯著差異(P<0.05)。橄欖油與花生油、玉米油、豆油、葵花籽油、菜籽油、野山茶油的δ13C均值分別相差0.97‰、13.16‰、1.79‰、0.35‰、0.73‰、0.50‰。其中，橄欖油與花生油、玉米油、豆油、菜籽油的碳穩(wěn)定同位素比值具有顯著差異(P<0.05)，與葵花籽油(P=0.20)和野山茶油(P=0.12)的差異不顯著。因此，δ13C測(cè)量適用于鑒定C4植物的植物油摻假橄欖油的情況，但不適用于鑒定某些同為C3植物的植物油摻假橄欖油的情況，需要結(jié)合其他穩(wěn)定同位素比值分析。

圖5 不同品種植物油中δ13C值Fig.5 δ13C values of different kinds of vegetable oils

表2 橄欖油與其他6種植物油中δ13C值Table 2 δ13C values of olive oil and other six kinds of vegetable oils

2.3 橄欖油的δD和δ13C相關(guān)性分析

為研究橄欖油中δD和δ13C的相關(guān)性，對(duì)2.1節(jié)和2.2節(jié)中得到的δD和δ13C進(jìn)行相關(guān)性分析，示于圖6。結(jié)果表明，橄欖油樣本中δD與δ13C相關(guān)(Pearson’sr=0.904)。該結(jié)果可以用于單一穩(wěn)定同位素比分析的補(bǔ)充。

圖6 橄欖油樣本中δD和δ13C的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of δD and δ13C of olive oil samples

2.4 橄欖油摻雜豆油、玉米油的模擬分析

在本次測(cè)量的6種植物油中，豆油和玉米油顏色清淡、無(wú)明顯異味，常被用來(lái)?yè)郊匍蠙煊?。為分析氫、碳穩(wěn)定同位素比對(duì)橄欖油中分別摻雜豆油和玉米油的鑒別效果，對(duì)摻雜比例為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～90%的情況進(jìn)行模擬。由于植物油的主要成分是甘油三酯[24]，因此可以假設(shè)橄欖油和豆油、玉米油中氫、碳總含量相同。用2.1節(jié)和2.2節(jié)分析得到的橄欖油、豆油和玉米油的δD和δ13C，換算成D/H和13C/12C后，對(duì)不同摻雜比例橄欖油的氫、碳同位素比進(jìn)行計(jì)算模擬，示于式(3)，式(4)：

Rsample=(1+δ)Rstandard

(3)

其中，D/HV-SMOW取值為(155.76±0.05)×10-6，13C/12CPDB取值為(11 237.2±90)×10-6。

(4)

式中，R為樣品中氫穩(wěn)定同位素比D/H或碳穩(wěn)定同位素比13C/12C；M為橄欖油的質(zhì)量；m為摻入油(豆油或玉米油)的質(zhì)量。

模擬結(jié)果示于圖7，圖中陰影部分為橄欖油本身穩(wěn)定同位素比的范圍，點(diǎn)線圖為計(jì)算得到的摻假油穩(wěn)定同位素比。

從圖7a可以看出，氫穩(wěn)定同位素比分析在豆油、玉米油分別摻雜橄欖油鑒定方面均適用，豆油摻雜比例為質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%以上、玉米油摻雜比例為質(zhì)量分?jǐn)?shù)約25%以上時(shí)，摻假油的D/H比值超出橄欖油本身氫穩(wěn)定同位素比范圍。從圖7b可以看出，碳穩(wěn)定同位素比分析適用于玉米油摻雜橄欖油鑒定，摻雜比例為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%以上時(shí)，摻假油的13C/12C比值超出橄欖油本身碳同位素比范圍，不適用豆油摻雜鑒定，摻雜橄欖油后摻假油的13C/12C比值與橄欖油本身碳同位素?zé)o明顯差別。氫、碳穩(wěn)定同位素比相結(jié)合能檢測(cè)出玉米油摻假10%、豆油摻假30%以上的情況。

注：a.氫穩(wěn)定同位素比；b.碳穩(wěn)定同位素比圖7 摻假橄欖油的穩(wěn)定同位素比模擬分析Fig.7 Simulation analysis of adulterated olive oils

3 結(jié)論

本工作研究了市場(chǎng)上銷售的橄欖油與其他6種植物油中氫、碳穩(wěn)定同位素比值特征，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明：橄欖油中δD范圍為-146.78‰～-125.30‰，δ13C范圍為-29.72‰～-28.59‰，與其他品類植物油中氫穩(wěn)定同位素比值差異顯著(P<0.05)，與除葵花籽油、野山茶油外的植物油中碳穩(wěn)定同位素比值差異顯著(P<0.05)，且橄欖油中氫、碳穩(wěn)定同位素比值具有較強(qiáng)相關(guān)性(Pearson’sr=0.904)。同時(shí)，以理論計(jì)算模擬大豆油和玉米油對(duì)橄欖油進(jìn)行摻假，計(jì)算結(jié)果表明，氫、碳穩(wěn)定同位素比結(jié)合分析能檢測(cè)出玉米油摻假10%、豆油摻假30%以上的情況。同位素比技術(shù)能夠?qū)﹂蠙煊蛽郊龠M(jìn)行鑒定，且理論檢測(cè)限較低，實(shí)際檢測(cè)限有待進(jìn)一步驗(yàn)證。