超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉和茶湯中茚蟲威對(duì)映體及7種降解產(chǎn)物

鐘 青，黎洪霞，羅逢健，陳宗懋，張新忠

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究中心，浙江 杭州 310008；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院， 北京 100081; 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008)

我國(guó)是茶葉的起源地，也是世界第一茶葉生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)。茶葉是一種綠色健康飲料，其品質(zhì)和質(zhì)量安全關(guān)系著茶產(chǎn)業(yè)的長(zhǎng)期可持續(xù)發(fā)展。茶葉生長(zhǎng)喜濕熱環(huán)境，容易發(fā)生病蟲害，噴施化學(xué)農(nóng)藥是防治茶樹病蟲害最快、最有效的方法。茚蟲威結(jié)構(gòu)獨(dú)特新穎、蒸氣壓低(2.5×10-5mPa，25 ℃)、水溶解度小(0.20 mg/L，20 ℃)、殺蟲效果好且用量低，是一種對(duì)茶樹鱗翅目害蟲假眼小綠葉蟬等有很好的防治效果，且對(duì)天敵安全的噁二嗪類手性結(jié)構(gòu)農(nóng)藥[1]。茚蟲威通過(guò)在昆蟲體內(nèi)代謝為一種N-去甲氧羰基代謝物(DCJW，IN-JT333)，從而不可逆地阻斷Na+通道，逐漸使目標(biāo)害蟲神經(jīng)麻痹，影響攝食等活動(dòng)直至死亡[2]。2013年我國(guó)對(duì)茶葉中茚蟲威的最大殘留限量(MRL)規(guī)定為5 mg/kg，并促成國(guó)際食品法典委員會(huì)CAC制定此MRL值，使歐盟的MRL值從0.05 mg/kg修訂為5 mg/kg。近年來(lái)提倡使用茶園水溶性農(nóng)藥，茚蟲威作為有機(jī)磷類高毒農(nóng)藥、新煙堿類高水溶解度農(nóng)藥的替代品，越來(lái)越廣泛地用于茶園害蟲的防治[1,3-4]。

隨著科學(xué)研究的不斷深入，農(nóng)產(chǎn)品和食品中農(nóng)藥代謝降解產(chǎn)物受到關(guān)注。國(guó)際農(nóng)藥殘留聯(lián)席會(huì)議JMPR的評(píng)估報(bào)告[5]將茚蟲威殘留物定義為茚蟲威-S體和茚蟲威-R體的總量，同時(shí)給出了一些代謝降解產(chǎn)物，除IN-JT333外，還有羥基化代謝物、噁二嗪開環(huán)代謝物等[6]。關(guān)于茚蟲威殘留的研究，前期主要集中在其外消旋體的檢測(cè)方法，包括氣相色譜法[7-9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]、液相色譜法[13-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-22]等。2007年以來(lái)，逐漸有采用不同固定相制成的色譜柱對(duì)不同樣品基質(zhì)中的茚蟲威對(duì)映體進(jìn)行手性分析的報(bào)道[23-26]，如采用萬(wàn)古霉素晶體代謝物柱[27]、(S)-α-甲基苯基氨基甲酸修飾的直鏈淀粉柱[28]、直鏈淀粉-三-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(Chiralpak AD-RH)柱[29]和纖維素-三-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(Chiralcel OD-H)柱[30]等。本課題組前期建立了茶葉等基質(zhì)中茚蟲威對(duì)映體的殘留分析方法[23]，并用于田間實(shí)際樣品分析，發(fā)現(xiàn)茶鮮葉中茚蟲威對(duì)映體之間存在降解差異[26]。但這些研究均只關(guān)注茚蟲威母體，很少涉及其降解產(chǎn)物。

本工作擬采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法分析鮮葉、綠茶、紅茶、綠茶茶湯和紅茶茶湯中茚蟲威手性對(duì)映體及其7種降解產(chǎn)物，希望為研究茚蟲威對(duì)映體在茶葉生長(zhǎng)加工沖泡過(guò)程中的降解代謝及在其他農(nóng)產(chǎn)品中的代謝分析提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與設(shè)備

UPLC/Quattra Premier XE超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧電離(ESI)源，MassLynx 4.1質(zhì)譜工作站；Lux?3 μm Cellulose-1、Lux?3 μm Cellulose-2(3 μm×150 mm×2 mm)手性色譜柱：Strata-X 33 u PRP (polymeric reversed phase)SPE柱(500 mg/6 mL)：美國(guó)Phenomenex公司產(chǎn)品；BondElut C18 SPE柱(500 mg/6 mL)：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；3K-5冷凍高速離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI Labortechnik A G公司產(chǎn)品；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Vortex Genie2型渦旋振蕩器：美國(guó)Scientific公司產(chǎn)品；T-18高速均質(zhì)勻漿器：德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；DFT-200手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；電子分析天平(0.000 1 g)：瑞士Mettler-Toledo公司產(chǎn)品；Filter Unit濾膜(0.22 μm)：天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品；2 mL進(jìn)樣瓶：美國(guó)Agilent公司有限產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉：均為分析純，上海試四赫維化工有限公司產(chǎn)品；石墨化炭黑(Graphitized carbon black，GCB)填料(120～140目)：天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品；十八烷基鍵合硅膠(Octadecylsilane, C18)填料：40～60 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品；丙酮：色譜純，美國(guó)Honey Well公司產(chǎn)品；甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；甲酸、乙酸銨：色譜純，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；純凈水：杭州娃哈哈有限公司產(chǎn)品；茚蟲威標(biāo)準(zhǔn)品(R∶S=1∶1，純度98%)：德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；IN-JT333、IN-MK638、IN-MF014、IN-KG433、IN-MN470、IN-MK643和IN-JU873純品：純度均大于95%，委托合成制備。

1.3 樣品提取凈化

1.3.1鮮葉、茶葉 稱取經(jīng)食品粉碎機(jī)磨碎后的5.00 g鮮葉(或2.00 g綠茶或紅茶)于50 mL離心管中，加入5 mL純凈水，充分渦旋混勻后靜置20 min，再加入10 mL乙腈，渦旋混勻后靜置2 h，然后加入5 g NaCl，以17 400 r/min均質(zhì)1 min，渦旋混勻振蕩5 min，以5 000 r/min離心5 min。吸取7 mL上層有機(jī)相溶液，加入裝有0.525 g C18和0.087 5 g GCB的10 mL離心管中，渦旋振蕩凈化1 min，以5 000 r/min離心5 min，吸取5.0 mL過(guò)膜后的上清液于50 mL雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)濃縮近干后，加入1.0 mL甲醇-水溶液(9∶1，V/V)定容，超聲輔助溶解，過(guò)0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶中，待UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3.2茶湯 按照茶水比1∶50的標(biāo)準(zhǔn)用沸水沖泡茶葉，10 min后濾紙抽濾，獲得茶湯。先用5 mL甲醇、5 mL水依次預(yù)淋洗活化PRP柱，吸取100 mL茶湯樣品上樣，待過(guò)柱完畢后，加入5 mL甲醇-水溶液(4∶6，V/V)清洗PRP柱，棄去流出的上樣液和清洗液，緩速氣流吹干PRP柱2 min，再用20 mL甲醇洗脫柱內(nèi)待測(cè)目標(biāo)物，接收洗脫液至100 mL雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮近干后，加入1.0 mL甲醇-水溶液(9∶1，V/V)定容，超聲輔助溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，待UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 Lux?3 μm Cellulose-2色譜柱(3 μm×150 mm×2 mm)；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.30 mL/min；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-甲醇溶液，B為5 mmol/L乙酸銨水溶液；梯度洗脫程序：0～4.5 min(70%～80%A)，4.5～5.2 min(80%～98%A)，5.2～9.2 min(98%A)，9.2～9.4 min(98%～70%A)，9.4%～12 min(70%A)。茚蟲威對(duì)映體及其降解產(chǎn)物的保留時(shí)間列于表1。

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧電離正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(ESI+-MRM)；毛細(xì)管電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣(N2)溫度350 ℃，流速750 L/h；錐孔反吹氣(N2)流速50 L/h；碰撞氣(Ar)流速0.25 mL/min；電子倍增器電壓700 V；二級(jí)母離子駐留時(shí)間0.040 s。茚蟲威對(duì)映體及其降解產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別稱取一定量的茚蟲威及其降解產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配制成200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃保存。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇-水溶液(9∶1，V/V)稀釋成20 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用1.3節(jié)方法處理后得到的茶鮮葉、紅茶、綠茶、紅茶茶湯和綠茶茶湯基質(zhì)以及甲醇-水(9∶1，V/V)溶劑配制成10、5.0、2.50、1.0、0.50、0.25、0.10、0.050、0.025和0.01 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(對(duì)映單體濃度為一半)，UPLC-MS/MS分析。每個(gè)濃度測(cè)定3次，以濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)(y)，得到茚蟲威對(duì)映體及降解產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性相關(guān)系數(shù)。

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect)：

ME=(A/B-1)× 100%

式中：A為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，B為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。若ME大于0，說(shuō)明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；若ME小于0，說(shuō)明存在基質(zhì)減弱效應(yīng)。

1.6 添加回收率、精密度與方法定量限

稱取(量取)經(jīng)測(cè)定不含茚蟲威及其降解產(chǎn)物的茶鮮葉、綠茶、紅茶、綠茶茶湯、紅茶茶湯空白樣品，分別添加0.005、0.050、0.50 mg/kg 3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻后放置2 h以更接近實(shí)際樣品中農(nóng)藥殘留情況，然后按照1.3節(jié)方法加入水和乙腈進(jìn)行提取凈化，每個(gè)濃度重復(fù)6次；同時(shí)將處理得到的空白茶鮮葉、綠茶、紅茶、綠茶湯和紅茶湯樣品溶液加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后定容，配制成相應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算添加回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限和定量限。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1茶鮮葉和茶葉提取條件的優(yōu)化 提取溶劑的酸堿性直接影響樣品中殘留化合物的提取效果。參考前期方法[22,26]進(jìn)行提取時(shí)，發(fā)現(xiàn)IN-JT333等化合物的回收率無(wú)法滿足需要。因此，分別稱取5.0 g茶鮮葉，加入1.0 mL 1 mg/L茚蟲威及其降解產(chǎn)物混合標(biāo)樣，渦旋靜置1 h，對(duì)比4種提取方式的提取效果，即A：加入5 mL 2%甲酸-水溶液，渦旋浸泡20 min，再加入10 mL 5%氨水-乙腈提??；B：加入5 mL純水，渦旋浸泡20 min，再加入10 mL 5%氨水-乙腈提取；C：加入5 mL純水，渦旋浸泡20 min，再加入10 mL乙腈提??；D：加入5 mL純水，渦旋浸泡20 min，再加入10 mL 2%甲酸-乙腈提取。按照1.3節(jié)方法凈化后，各化合物的提取回收率示于圖1。結(jié)果表明，雖然5%氨水-乙腈提取液相對(duì)更干凈，但對(duì)IN-JT333、IN-JU873和INKG433的回收率較低；乙腈和酸化乙腈都能得到較好的回收率，但是酸化乙腈提取重復(fù)間偏差較大，因此選擇方案C。本實(shí)驗(yàn)最終采用5.0 mL水和10.0 mL乙腈提取5.0 g茶鮮葉，茚蟲威對(duì)映體及其降解產(chǎn)物的回收率和精密度均能滿足要求，同時(shí)也適用于茶葉的提取。

圖1 4種不同提取溶劑提取鮮葉中茚蟲威及其降解產(chǎn)物的對(duì)比結(jié)果Fig.1 Comparation results to indoxacarb and its metabolites extracted by four kinds of extractants

2.1.2茶湯富集凈化條件的優(yōu)化 參考前期方法[22]選擇固相萃取柱和上樣量，選擇茚蟲威、IN-JT333和IN-MK638三種極性不同的化合物，采用Bond-Elut C18-SPE柱和PRP-SPE柱，上樣25、50、100 mL茶湯進(jìn)行對(duì)比研究，回收率結(jié)果列于表2。雖然C18柱對(duì)茚蟲威的保留富集較好，但是對(duì)IN-JT333和IN-MK638的保留富集較差，尤其是IN-MK638的回收率無(wú)法滿足要求。從上樣量變化帶來(lái)的結(jié)果看，C18柱吸附能力不足。PRP柱采用高聚合物填料，能夠增強(qiáng)對(duì)IN-MK638等弱極性化合物的吸附富集，從而提高回收率，滿足殘留分析要求。因此，最終選擇PRP柱對(duì)100 mL茶湯中的茚蟲威及其降解產(chǎn)物進(jìn)行富集凈化，最大限度提高富集倍數(shù)和方法靈敏度。

2.1.3PRP柱凈化洗脫溶劑的優(yōu)化 將茶湯樣品上樣至PRP柱之后，柱內(nèi)吸附較多咖啡堿、色素等雜質(zhì)，如果上樣后采用甲醇直接洗脫，會(huì)帶來(lái)很多共流出雜質(zhì)，影響待測(cè)物響應(yīng)。因此在不影響目標(biāo)物質(zhì)的情況下，將一部分咖啡堿、色素等雜質(zhì)先淋洗下來(lái)，再洗脫目標(biāo)化合物，從而降低基質(zhì)效應(yīng)，減少雜質(zhì)影響。將茚蟲威、IN-JT333和IN-MK638的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、茶湯分別上樣至PRP柱，依次吸取5 mL不同比例(0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，V/V)的甲醇-水溶液進(jìn)行洗脫，測(cè)定過(guò)柱后各部分洗脫液中的目標(biāo)物濃度，繪制洗脫曲線，示于圖2。茶湯過(guò)柱后在不同比例洗脫溶劑下的顏色對(duì)比示于圖3。結(jié)果表明，大部分水溶性色素在前期水比例較高的淋洗中被洗脫下來(lái)；隨著甲醇比例的升高，IN-MK638最先被洗脫下來(lái)，當(dāng)甲醇-水溶液比例上升至5∶5時(shí)開始有檢出，在6∶4時(shí)全部流出，之后在8∶2開始有茚蟲威洗脫，最后是IN-JT333被洗脫下來(lái)，在純甲醇時(shí)被全部洗脫下來(lái)。因此，既要盡量去除樣品中咖啡堿、色素等雜質(zhì)，又要避免目標(biāo)物損失，最終確定上樣后最佳清洗溶劑為5 mL甲醇-水溶液(4∶6，V/V)，然后用甲醇洗脫待測(cè)目標(biāo)化合物。

表2 不同SPE柱和不同上樣量時(shí)，3種代表性化合物的回收率Table 2 Recoveries of indoxacarb, IN-JT333, IN-MK638 with different SPE columns and different sample volumes

圖2 不同比例甲醇-水溶液洗脫下茚蟲威及其兩種降解產(chǎn)物在PRP柱上的流出曲線Fig.2 Elution curves of indoxacarb and its metabolites on PRP column by MeOH-H2O with different ratios

圖3 不同比例甲醇-水溶液洗脫P(yáng)RP柱上茶湯樣品的凈化效果Fig.3 Purification effect of tea infusion sample on PRP column by MeOH-H2O with different ratios

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在前期研究[23]中，雖然采用Lux?3 μm Cellulose-1柱實(shí)現(xiàn)了對(duì)茚蟲威對(duì)映體的拆分，也明確了乙腈拆分效果不如甲醇。但是本研究中發(fā)現(xiàn)Lux?3 μm Cellulose-1柱很難實(shí)現(xiàn)對(duì)IN-JT333對(duì)映體的拆分。通過(guò)重新對(duì)比其他手性柱的效果，發(fā)現(xiàn)Lux?3 μm Cellulose-2既能實(shí)現(xiàn)對(duì)茚蟲威對(duì)映體的拆分，又能實(shí)現(xiàn)對(duì)IN-JT333對(duì)映體的拆分和對(duì)IN-JU873對(duì)映體的基本并肩峰分離；兩種色譜柱上茚蟲威的2個(gè)對(duì)映體流出順序不同，在Lux?3 μm Cellulose-1柱上茚蟲威-R體比茚蟲威-S體先洗脫出來(lái)，而在Lux?3 μm Cellulose-2柱上則相反，這主要是由兩種色譜柱填料中苯環(huán)取代基及位置不同而造成的選擇性分離差別。最終選擇Lux?3 μm Cellulose-2柱實(shí)現(xiàn)對(duì)茚蟲威對(duì)映體及其降解產(chǎn)物的分離。

采用UPLC-ESI+-MS/MS對(duì)茚蟲威及其7種降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，優(yōu)化錐孔電壓和噴霧電壓，分別得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜子離子掃描，得到碎片離子信息，優(yōu)化碰撞裂解能量，20 eV碰撞能量下茚蟲威及其7種降解產(chǎn)物的ESI+-MS/MS質(zhì)譜圖示于圖4，最終優(yōu)化后二級(jí)質(zhì)譜條件列于表1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、靈敏度和基質(zhì)效應(yīng)

在2.1和2.2節(jié)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定茚蟲威對(duì)映體及降解產(chǎn)物在0.01、0.025、0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、2.5、5.0、10 mg/L(對(duì)映單體濃度為一半)濃度范圍的進(jìn)樣溶劑、茶鮮葉、紅茶、綠茶、紅茶茶湯和綠茶茶湯基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)，列于表3。結(jié)果表明，在上述各種基質(zhì)中，茚蟲威對(duì)映體及其降解產(chǎn)物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.999 1以上，能夠滿足檢測(cè)要求。

茶葉等樣品經(jīng)過(guò)凈化后，還會(huì)存在一定的基質(zhì)減弱效應(yīng)，因此需要采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)法定量分析。UPLC-MS/MS測(cè)定茚蟲威對(duì)映體及其降解產(chǎn)物的典型色譜圖示于圖5。

2.4 回收率和精密度

按照1.6節(jié)方法對(duì)茶鮮葉、綠茶、紅茶、綠茶茶湯、紅茶茶湯中茚蟲威對(duì)映體及降解產(chǎn)物進(jìn)行低、中、高濃度水平下6次平行添加回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果列于表4。結(jié)果表明，在0.005、0.05、0.50 mg/kg(茶湯中為0.5、5、50 μg/L)添加濃度下，茚蟲威-S體和茚蟲威-R體、IN-JT333-1和IN-JT333-2、IN-JU873-1和IN-JU873-2在茶鮮葉中的平均添加回收率為94.5%～108.4%，RSD為1.6%～8.2%；在綠茶中的平均添加回收率為90.0%～105.3%，RSD為0.4%～16.4%；在紅茶中的平均添加回收率為77.6%～101.3%，RSD為1.0%～15.4%；在綠茶湯中平均添加回收率為76.9%～100.2%，RSD為1.3%～15.8%；在紅茶湯中平均添加回收率為86.4%～101.4%，RSD為3.1%～7.9%。

注：a.Indoxacarb;b.IN-JT333;c.IN-JU873;d.IN-KG433;e.IN-MF014;f.IN-MK638;g.IN-MK643;h.IN-MN470圖4 20 eV下茚蟲威及其降解產(chǎn)物母離子的UPLC-MS/MS二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 MS/MS spectra for parent ions of indoxacarb and its metabolites at 20 eV

在0.01、0.10、1.0 mg/kg(茶湯中為1、10、100 μg/L)添加濃度下，IN-MK638、IN-KG433、IN-MN470、IN-MK643和IN-MF014在茶鮮葉中的平均添加回收率為96.0%～106.3%，RSD為0.8%～3.4%；在綠茶中的平均添加回收率為92.3%～104.7%，RSD為2.7%～9.5%；在紅茶中的平均添加回收率為89.6%～99.1%，RSD為1.1%～15.7%；在綠茶湯中平均添加回收率為91.6%～102.9%，RSD為0.9%～9.6%；在紅茶湯中平均添加回收率為89.4%～101.5%，RSD為2.4%～8.0%。

2.5 方法檢出限與定量限

按照最低添加濃度水平下的響應(yīng)，計(jì)算信噪比S/N=3時(shí)，所得各化合物在茶鮮葉、紅茶、綠茶和茶湯等不同基質(zhì)中的檢出限均小于0.002 mg/kg，以滿足回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差要求下的最低添加濃度水平來(lái)定義方法定量限(LOQ)。茚蟲威-S體和茚蟲威-R體、IN-JT333-1和IN-JT333-2、IN-JU873-1和IN-JU873-2在鮮葉、綠茶和紅茶中LOQ為0.005 mg/kg，在綠茶湯和紅茶湯中LOQ為0.5 μg/L；IN-MK638、IN-MF014、IN-KG433、IN-MN470和IN-MK643在茶鮮葉、綠茶和紅茶中LOQ為0.01 mg/kg，在綠茶湯和紅茶湯中LOQ為1 μg/L。

表3 UPLC-MS/MS測(cè)定不同基質(zhì)溶液中茚蟲威對(duì)映體及其降解產(chǎn)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Linear regression equations, correlation coefficients (R2) and matrix effects (MEs) of indoxacarb enantiomers and its metabolites in different matrix by UPLC-MS/MS

注：a.IN-MF014;b.IN-JT333;c.IN-MK638;d.Indoxacarb;e.IN-MK643;f.IN-JU873;g.IN-MN470;h.IN-KG433圖5 茚蟲威對(duì)映體及其降解產(chǎn)物(0.10 mg/L)的UPLC-MS/MS色譜圖Fig.5 Chromatograms of indoxacarb and its metabolites (0.10 mg/L) by UPLC-MS/MS

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

利用本方法對(duì)茶園茶葉噴施100 g/hm2劑量茚蟲威S富集體(3S+1R)后，采集噴藥后2 h、2天、5天、7天、10天和14天的茶鮮葉樣品，冷凍干燥后粉碎，進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)保留時(shí)間和質(zhì)譜離子對(duì)比對(duì)定性，在樣品中檢出有茚蟲威-S體、茚蟲威-R體以及IN-JT333-1、IN-MF014和 IN-KG433 3種降解產(chǎn)物，用基質(zhì)外標(biāo)法定量得出樣品中上述化合物殘留量分別為0.027～2.92 mg/kg、0.007～0.89 mg/kg、0.009～0.050 mg/kg、

3 結(jié)論

本研究通過(guò)優(yōu)化提取凈化條件，采用乙腈-水溶液提取鮮葉、紅茶和綠茶樣品，C18與GCB分散固相萃取凈化，濃縮后用甲醇-水溶液定容；對(duì)茶湯采用PRP柱富集凈化淋洗，甲醇洗脫接收，濃縮近干后甲醇-水溶液定容，使用Lux?3 μm Cellulose-2柱對(duì)茚蟲威對(duì)映體及7種降解產(chǎn)物進(jìn)行色譜分離，UPLC-MS/MS基質(zhì)外標(biāo)法定量，檢測(cè)茶鮮葉、綠茶、紅茶、綠茶湯和紅茶湯等基質(zhì)中茚蟲威對(duì)映體及其7種降解產(chǎn)物的殘留。不同基質(zhì)中所有化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，平均添加回收率為76.9%～108.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于16.4%，方法的定量限不高于0.01 mg/kg(1 μg/L)。本方法能夠滿足殘留分析要求，為茶鮮葉、茶葉和茶湯中茚蟲威對(duì)映體及其降解產(chǎn)物的研究檢測(cè)提供方法參考。

表4 UPLC-MS/MS測(cè)定不同樣品中茚蟲威對(duì)映體及其降解產(chǎn)物的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of indoxacarb and its metabolites in different samples by UPLC-MS/MS