液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定血清生長(zhǎng)激素

余利星，翟 睿，楚占營(yíng)，3，金有訓(xùn)，武利慶，米 薇，龔曉云，謝 潔，江 游，戴新華，方 向，俞曉平

(1.中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018；2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，質(zhì)譜儀器工程技術(shù)研究中心，前沿計(jì)量科學(xué)中心，北京 100029；3.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237)

臨床體外診斷生物標(biāo)志物中，蛋白質(zhì)類(lèi)標(biāo)志物約占10%～15%[1]。目前，針對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法有時(shí)間分辨熒光免疫分析法[2-3]、酶聯(lián)免疫吸附法[4]、LC-MS/MS法[5-6]、免疫散射比濁法[7]和毛細(xì)管電泳結(jié)合紫外、質(zhì)譜技術(shù)[8]等，其中基于抗原-抗體反應(yīng)的免疫分析法是臨床蛋白質(zhì)定量分析應(yīng)用最廣泛的方法[9-11]。然而，由于存在抗體特異性差異、蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)差異、基質(zhì)干擾、假陽(yáng)性結(jié)果等問(wèn)題，很難得到準(zhǔn)確可靠的蛋白質(zhì)定量分析數(shù)據(jù)，造成不同國(guó)家、不同實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)定量分析結(jié)果不可比對(duì)，臨床診斷準(zhǔn)確性無(wú)法保證[12-13]。因此，建立高準(zhǔn)確度的蛋白質(zhì)定量分析方法是必要的。

同位素稀釋質(zhì)譜法(isotope dilution mass spectrometry，IDMS)具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，已成為蛋白質(zhì)質(zhì)譜定量分析的首選方法[14-16]。該方法將已知質(zhì)量的同位素標(biāo)記肽段或蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)加入待測(cè)樣本中，通過(guò)質(zhì)譜儀測(cè)定同位素豐度比例，從而計(jì)算目標(biāo)蛋白質(zhì)含量。然而，以同位素標(biāo)記肽段為內(nèi)標(biāo)的方法，由于標(biāo)記肽段添加時(shí)間較晚，且理化性質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)相差較大，由蛋白質(zhì)降解、酶切不完全以及蛋白樣品損失帶來(lái)的定量誤差無(wú)法避免[17]。因此，以同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)的方法是更可靠的。

內(nèi)分泌疾病是內(nèi)分泌腺或內(nèi)分泌組織本身的分泌功能和(或)結(jié)構(gòu)異常時(shí)發(fā)生的癥候群，目前已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的慢性疾病。臨床上，內(nèi)分泌疾病的預(yù)防、診斷和治療主要依賴(lài)相應(yīng)診斷標(biāo)志物的準(zhǔn)確測(cè)量[18]。人生長(zhǎng)激素(human growth hormone，hGH)是由人體腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)類(lèi)激素，由191個(gè)氨基酸構(gòu)成，其主要生理功能是促進(jìn)組織生長(zhǎng)、全身蛋白質(zhì)合成、脂肪分解等，是肢端肥大癥、巨人癥、侏儒癥等疾病臨床診斷的重要指標(biāo)[19-22]。人血清中生長(zhǎng)激素正常值為：成年男性<2 μg/L、成年女性<10 μg/L，兒童<20 μg/L[23]。目前，hGH的檢測(cè)方法主要是基于抗原-抗體反應(yīng)原理的免疫分析方法[24-25]，然而由于受到抗體特異性、測(cè)量準(zhǔn)確性和重復(fù)性的限制，該方法的重復(fù)性不理想，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)法滿(mǎn)足人們對(duì)蛋白質(zhì)高準(zhǔn)確度測(cè)量的需求。

由于血清中成分復(fù)雜，hGH含量極低，并且存在大量高豐度蛋白質(zhì)的信號(hào)干擾[26-28]，使得血清中hGH的直接分析存在困難。在質(zhì)譜分析前，發(fā)展有效的分離純化方法是血清中生長(zhǎng)激素準(zhǔn)確定量分析的關(guān)鍵。本研究擬以同位素標(biāo)記的人生長(zhǎng)激素為內(nèi)標(biāo)，建立一種基于離線二維高效液相色譜分離蛋白質(zhì)酶切樣品的方法。該方法通過(guò)應(yīng)用高低pH流動(dòng)相實(shí)現(xiàn)不同性質(zhì)血清酶切肽段的有效分離，從而降低血清樣品的復(fù)雜程度，提高h(yuǎn)GH定量肽段的質(zhì)譜響應(yīng)。最后，結(jié)合高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法(HPLC-IDMS)準(zhǔn)確定量分析血清中hGH含量，其流程圖示于圖1，并應(yīng)用建立的方法參加國(guó)際比對(duì)(CCQM-P164)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，配有G1311C四元泵、G1314F紫外檢測(cè)器和液相色譜系統(tǒng)化學(xué)工作站；Agilent 1200/API 5500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司/美國(guó)AB Sciex公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及Analyst數(shù)據(jù)處理軟件；ME235S分析天平：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)產(chǎn)品；VORTEX GENIE2混勻儀：美國(guó) Scientific Industries公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó) Millipore公司產(chǎn)品；真空離心濃縮儀：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

人生長(zhǎng)激素標(biāo)準(zhǔn)品(WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品)：英國(guó)NIBSC公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇(DTT，純度≥99%)、胰蛋白酶(純度≥99%)、乙腈(色譜純)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；空白血清：美國(guó)NIST公司產(chǎn)品；國(guó)際比對(duì)人生長(zhǎng)激素標(biāo)準(zhǔn)品(6.57 μg/g)、國(guó)際比對(duì)同位素標(biāo)記人生長(zhǎng)激素標(biāo)準(zhǔn)品(8.30 μg/g)、國(guó)際比對(duì)空白血清、國(guó)際比對(duì)樣品：由德國(guó)聯(lián)邦物理技術(shù)研究院提供；Tris-堿(Tris-Base，純度≥99%)：福州Phygene公司產(chǎn)品；Tris-酸(Tris-HCl，純度>99.5%)：上海索寶生物科技有限公司產(chǎn)品；甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、乙酸：均為L(zhǎng)C-MS級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher科技有限公司產(chǎn)品；氨水(NH3·H2O，濃度25%)：東莞泰鑫化工有限公司產(chǎn)品；hGH定量特異性肽段(T2、T11和T12)及其標(biāo)記肽段：吉爾生化有限公司產(chǎn)品；模擬樣品(理論含量12.00 ng/g)：空白血清添加已知質(zhì)量生長(zhǎng)激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

圖1 血清中hGH的測(cè)定流程Fig.1 Chart of method flow of hGH in serum

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品制備 使用空白血清稀釋生長(zhǎng)激素(hGH)標(biāo)準(zhǔn)品和同位素標(biāo)記生長(zhǎng)激素(L-hGH)標(biāo)準(zhǔn)品，輕輕混勻1 h，分裝后保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.2.2校準(zhǔn)樣品和血清樣品的制備 將500 μL空白血清與1.2.1節(jié)配制的hGH和L-hGH標(biāo)準(zhǔn)品混合，制成校準(zhǔn)樣品。其中，校準(zhǔn)樣品1為含有11.95 ng/g hGH標(biāo)準(zhǔn)品和11.60 ng/g L-hGH的血清溶液，用于模擬樣品的分析；校準(zhǔn)樣品2為含有17.29 ng/g hGH標(biāo)準(zhǔn)品和17.32 ng/g L-hGH的血清溶液，用于國(guó)際比對(duì)樣品的分析。

將500 μL血清樣品(模擬樣品或國(guó)際比對(duì)樣品)與上述配制的L-hGH標(biāo)準(zhǔn)品混合制備待分析的血清樣品，待分析的血清模擬樣品中L-hGH的添加質(zhì)量與hGH的理論質(zhì)量相等。

1.2.3胰蛋白酶酶切 稱(chēng)取302.5 mg Tris-Base和395 mg Tris-HCl溶于1 mL純水中，配制Tris溶液；稱(chēng)取12 mg胰蛋白酶溶于1.8 mL 50 mmol/L HAc中，配制胰蛋白酶溶液。取65 μL Tris溶液至校準(zhǔn)品和樣品中，混勻后逐滴加入50 μL胰蛋白酶溶液(pH值為8.2±0.2)，然后每隔30 min逐滴加入100 μL乙腈溶液，共11次，從30 min起，每隔60 min滴加50 μL胰蛋白酶溶液，共5次[16]。將校準(zhǔn)品和樣品在37 ℃環(huán)境中孵育16 h。

在校準(zhǔn)品與樣品中加入3.2 mg DTT，于37 ℃輕搖1 h，以17 860 r/min離心10 min，吸取上清液。加1 mL水-乙腈溶液(50∶50，V/V)于沉淀中使其溶解，以17 860 r/min離心10 min后，合并上清液，然后將上清液置于真空離心濃縮儀中濃縮干燥。加入400 μL去離子水至濃縮干燥的校準(zhǔn)品與樣品中，渦旋，加入100 μL 16% TFA溶液，渦旋。以3 960 r/min離心10 min，吸取上清液，加入300 μL去離子水洗滌沉淀，以3 960 r/min離心10 min后，合并上清液，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1離線二維高效液相色譜條件 一維液相色譜條件：Jupiter Proteo色譜柱(RP-C12，9 nm，4 μm，250 mm×10 mm)；流動(dòng)相：A為含0.1%TFA的水溶液，B為含0.1%TFA的乙腈，流速2 mL/min；洗脫梯度：0～1 min(0～1%B)，1～5 min(1%B)，5～80 min(1%～80%B)，80～90 min(80%B)，90～90.5 min(80%～1%B)，90.5～120.5 min(1%B)。

二維液相色譜條件：Jupiter C4色譜柱(30 nm，5 μm，250 mm×10 mm)；流動(dòng)相：A為含0.05% FA的水溶液，使用NH3·H2O溶液(濃度25%)調(diào)至pH 8.0±0.1，B為含0.05%FA的乙腈，使用NH3·H2O溶液(濃度25%)調(diào)至pH 8.0±0.1。使用500 μL流動(dòng)相A復(fù)溶一維液相分離得到的干燥餾分。復(fù)溶后上樣，流速2 mL/min，洗脫梯度為0～5 min(0%B)，5～80 min(0%～60%B)，80～85 min(60%B)，85～85.5 min(60%～0%B)，85.5～115.5 min(0%B)。

1.3.2高效液相色譜條件 色譜柱：Aeris Peptide XB-C18色譜柱(250 mm×2.1 mm×3.6 μm，Phenomenex)；進(jìn)樣體積20 μL；流速200 μL/min；流動(dòng)相：A為含0.1%FA的水溶液， B為含0.1%FA的乙腈；洗脫梯度：0～6 min(100%～98%A)，6～15 min(98%～91%A)，15～60 min(91%～70%A)。

1.3.3質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，噴霧電壓4.2 kV，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。T11和T11*、T12和T12*的碰撞能量為20 eV，去簇電壓為50 V；T2和T2*的碰撞能量為22 eV，去簇電壓為50 V。監(jiān)測(cè)離子：T2為m/z490.4→719.4，T2*為m/z496.23→729.32；T11為m/z681.5→875.5，T11*為m/z689.3→887.4；T12為m/z387.4→531.4，T12*為m/z392.19→539.23。

2 結(jié)果與討論

2.1 一維色譜分離(C12色譜柱)

血清樣品經(jīng)酶切處理后產(chǎn)生大量肽段，樣品成分極其復(fù)雜，質(zhì)譜分析中高豐度蛋白質(zhì)的酶切肽段將嚴(yán)重抑制hGH定量肽段的質(zhì)譜信號(hào)。為了降低血清酶切樣品復(fù)雜程度，提高低豐度蛋白質(zhì)的定量準(zhǔn)確性，需建立新的有效分離純化方法，以實(shí)現(xiàn)hGH定量肽段的收集和分析。首先，化學(xué)合成用于生長(zhǎng)激素準(zhǔn)確定量分析的特征肽段T2(LFDNAMLR, Mr=979.15)、T11(DLEEGIQTLMGR, Mr=1361.52)、T12(LEDGSPR, Mr=772.8)及相應(yīng)的同位素標(biāo)記肽段T2*、T11*和T12* [16]。然后，在低pH值流動(dòng)相條件下，進(jìn)樣合成肽段純品(100 μg/L)。經(jīng)高效液相色譜分離檢測(cè)后，T2和T2*、T11和T11*、T12和T12*的保留時(shí)間分別為38～39、41.5～42.5、25～26 min，示于圖2。因此，在低pH值流動(dòng)相條件下，血清樣品酶切后經(jīng)第一次高效液相色譜分離時(shí)(圖3)，餾分收集器收集38～39 min時(shí)的餾分(含有肽段T2和T2*)，41.5～42.5 min時(shí)的餾分(含有肽段T11和T11*)和25～26 min時(shí)的餾分(含有肽段T12和T12*)，將收集的餾分濃縮干燥，加入200 μL乙腈-水溶液(80∶20,V/V)，復(fù)溶后濃縮干燥，用于第二次高效液相色譜分離(高pH值流動(dòng)相)。

注：1.肽段T12，25.547 min；2.肽段T2，38.315 min；3.肽段T11，41.943 min圖2 T2、T11和T12肽段經(jīng)高效液相色譜(低pH值流動(dòng)相)分離的色譜圖Fig.2 Chromatogram of peptide T2, T11 and T12 separated by high performance liquid chromatography (low pH mobile phase)

注：a.模擬樣品；b.國(guó)際比對(duì)樣品圖3 血清樣品酶切后經(jīng)高效液相色譜(低pH值流動(dòng)相)分離的色譜圖Fig.3 Chromatograms of a digested serum sample separated by high performance liquid chromatography (low pH mobile phase)

2.2 二維色譜分離(C4色譜柱)

為進(jìn)一步分離純化血清酶切樣品，降低定量分析時(shí)雜質(zhì)肽段的質(zhì)譜信號(hào)干擾，目標(biāo)餾分需再次經(jīng)過(guò)高效液相色譜分離(高pH值流動(dòng)相)。使用C4色譜柱在高pH值流動(dòng)相分離后收集含有肽段T2、T11和T12的餾分。首先，在高pH值流動(dòng)相條件下，將濃度為100 μg/L的T2、T11和T12肽段及相應(yīng)的同位素標(biāo)記肽段進(jìn)樣到色譜系統(tǒng)。在C4色譜柱上，T2和T2*、T11和T11*、T12和T12*的保留時(shí)間分別為55.3～56.3、51～52、20.5～21.5 min，示于圖4。在高pH值流動(dòng)相條件下，血清酶切樣品經(jīng)高效液相分離，其色譜圖示于圖5。餾分收集器收集55.3～56.3 min時(shí)的餾分(含有肽段T2和T2*)，51～52 min時(shí)的餾分(含有肽段T11和T11*)和20.5～21.5 min時(shí)的餾分(含有肽段T12和T12*)，分別加入100 μL FA-H2O溶液(5∶95,V/V)，真空濃縮干燥后用于后續(xù)質(zhì)譜定量分析。血清酶切樣品經(jīng)不同pH值流動(dòng)相的色譜純化后，有效分離了不同性質(zhì)的肽段，同時(shí)去除了大量雜質(zhì)肽段，降低了樣品的復(fù)雜程度，顯著提高了hGH定量肽段的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度。建立的基于離線二維高效液相色譜分離純化新方法是血清中生長(zhǎng)激素準(zhǔn)確定量分析的前提。

注：1.肽段T12，20.722 min；2.肽段T11，51.367 min；3.肽段T2，55.700 min圖4 T2、T11和T12肽段經(jīng)高效液相色譜(高pH流動(dòng)相)分離的色譜圖Fig.4 Chromatogram of peptide T2, T11 and T12 separated by high performance liquid chromatography (high pH mobile phase)

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定量分析

為提高質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確度，使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)流動(dòng)相A分別溶解T2、T11和T12肽段，混合后將濃度為10 ng/L的肽段溶液進(jìn)樣液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)。經(jīng)分析，T2和T2*、T11和T11*、T12和T12*的保留時(shí)間分別為35.7～36.2、49.75～50.25、13.4～13.9 min，示于圖6。

理論上，蛋白質(zhì)與其定量肽段的物質(zhì)的量之比為1∶1，采用不同特異性肽段定量蛋白質(zhì)應(yīng)得到一致的分析結(jié)果。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，選用T2、T11和T12肽段定量分析血清中生長(zhǎng)激素含量，結(jié)果分別為7.57、7.67、7.43 ng/g。因此，無(wú)論在理論上還是實(shí)際測(cè)量中，3條肽段的定量結(jié)果是一致的。

注：a.模擬樣品；b.國(guó)際比對(duì)樣品圖5 血清樣品酶切后經(jīng)高效液相色譜(高pH值流動(dòng)相)分離的色譜圖Fig.5 Chromatogram of a digested serum sample separated by high performance liquid chromatography (high pH mobile phase)

圖6 T2，T11和T12肽段經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析的色譜圖Fig.6 Chromatogram of peptide T2, T11, and T12 analyzed by HPLC-MS

使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)流動(dòng)相A復(fù)溶模擬樣品(12.00 ng/L)分離后肽段，相同條件下進(jìn)樣液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)試3次，結(jié)果示于圖7。血清中hGH含量根據(jù)式(1)計(jì)算：

(1)

其中，m1：hGH標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液的質(zhì)量；m2：配制hGH儲(chǔ)存液時(shí)，添加空白血清的質(zhì)量；m5：配制校準(zhǔn)品時(shí)，添加hGH工作液的質(zhì)量；m6：配制校準(zhǔn)品時(shí)，添加同位素標(biāo)記hGH工作液的質(zhì)量；m7：配制校準(zhǔn)品時(shí)，添加空白血清的質(zhì)量；m8：待測(cè)樣品的質(zhì)量；m9：待測(cè)樣品中添加同位素標(biāo)記hGH的質(zhì)量；c1：hGH標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液的濃度；c8：待測(cè)樣品的濃度；A1：校準(zhǔn)樣品中，定量肽段與同位素標(biāo)記定量肽段的峰面積比；A2：待測(cè)樣品中，定量肽段與同位素標(biāo)記定量肽段的峰面積比。

定量分析模擬樣品時(shí)，分別根據(jù)T2和T12肽段定量hGH含量得到分析結(jié)果，列于表1。在該方法建立過(guò)程中，雖然T12肽段定量分析結(jié)果(平均值11.84 ng/g)更接近理論值12.00 ng/g，但由于質(zhì)譜分析中T12肽段附近有與其保留時(shí)間相似的雜質(zhì)肽段干擾定量準(zhǔn)確度，因此在國(guó)際比對(duì)樣品定量分析時(shí)(圖8)，選擇T2肽段和T11肽段的定量分析結(jié)果，列于表2。

注：a.肽段T12和T12*；b.肽段T2和T2*；c.肽段T11和T11*；實(shí)線表示標(biāo)記肽段，虛線表示非標(biāo)記肽段圖7 經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析的模擬樣品色譜圖Fig.7 Chromatograms of simulated samples analyzed by HPLC-MS

表1 HPLC-IDMS法定量分析血清模擬樣品中hGH含量Table 1 Quantitative analysis of hGH content in simulated serum samples by HPLC-IDMS

注：a.肽段T12和T12*；b.肽段T2和T2*；c.肽段T11和T11* ；實(shí)線表示標(biāo)記肽段，虛線表示非標(biāo)記肽段圖8 經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析的國(guó)際比對(duì)樣品色譜圖Fig.8 Chromatograms of international comparative samples analyzed by HPLC-MS

表2 HPLC-IDMS法定量分析國(guó)際比對(duì)樣品中hGH含量Table 2 Quantitative analysis of hGH in serum from international comparison by HPLC-IDMS

2.4 不確定度計(jì)算

2.4.1A類(lèi)不確定度評(píng)估 A類(lèi)不確定度評(píng)估應(yīng)用同一樣品重復(fù)測(cè)量3次，量值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度表示。對(duì)于同一特征肽段，通過(guò)極差法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算示于式(2)：

(2)

其中，xmax和xmin分別表示最大和最小測(cè)量值，dn為自由度。平均值不確定度的計(jì)算示于式(3)：

(3)

因此，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算示于式(4)：

(4)

同樣，用于定量分析的另一條特異性肽段的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc2參照上述公式計(jì)算。

因此，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平均值計(jì)算示于式(5)，合成相對(duì)不確定度計(jì)算示于式(6)：

(5)

(6)

其中，uc,aver代表蛋白質(zhì)濃度量值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度；uc1和uc2分別代表2條肽段各自定值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度；uc(aver,rel)代表合成相對(duì)不確定度。最后，擴(kuò)展不確定度的計(jì)算示于式(7)：

Uexp(rel)=k·uc(aver,rel)(k= 2)

(7)

按照上述公式計(jì)算，模擬樣品和國(guó)際比對(duì)樣品中hGH含量分別為(11.45±2.33) ng/g和(12.84±1.46 ) ng/g。

2.4.2B類(lèi)不確定度評(píng)估 B類(lèi)不確定度是由稱(chēng)量和hGH標(biāo)準(zhǔn)品引起的不確定度。使用ME235S型天平稱(chēng)量樣品，天平的不精確度(0.01 mg)用于計(jì)算每次稱(chēng)量不確定度。樣品不確定度估算列于表3。因此，每次稱(chēng)量不確定度的計(jì)算示于式(8)：

(8)

hGH標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)不確定度為2.1%，包含因子為2(由德國(guó)聯(lián)邦物理技術(shù)研究院提供)。

基于以上計(jì)算模型，每次稱(chēng)量和hGH標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度系數(shù)計(jì)算示于式(9)：

(9)

所有不確定度分量整合為B類(lèi)不確定度，計(jì)算示于式(10)：

(10)

因此，B類(lèi)合成不確定的計(jì)算示于式(11)。式中：cmi表示δf/δxi，靈敏系數(shù)；umi表示稱(chēng)量的不確定度。

按照以上公式計(jì)算，國(guó)際比對(duì)樣品中稱(chēng)量引起的不確定度為0.001 803。

(11)

表3 樣品不確定度估算Table 3 Uncertainty budget of sample (Type B)

3 結(jié)論

本研究以同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)為內(nèi)標(biāo)，建立了離線二維高效液相色譜分離新策略，有效分離純化了生長(zhǎng)激素的特異性肽段，提高質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)合HPLC-IDMS法準(zhǔn)確測(cè)量血清中生長(zhǎng)激素含量。本研究提交的國(guó)際比對(duì)樣品的定值結(jié)果(12.84±1.46 ) ng/g已覆蓋了比對(duì)樣品中生長(zhǎng)激素理論值的劃線結(jié)果(尚未公布定值結(jié)果)。該方法避免了免疫法中抗體特異性差異、結(jié)合效率差異、假陽(yáng)性結(jié)果等問(wèn)題，也避免了同位素標(biāo)記肽段添加方法中蛋白質(zhì)酶切引起的定量誤差問(wèn)題，提高了復(fù)雜基質(zhì)中低豐度蛋白質(zhì)定量分析的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，為推動(dòng)蛋白質(zhì)準(zhǔn)確定量分析積累了經(jīng)驗(yàn)，也為蛋白質(zhì)類(lèi)生物大分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制奠定了基礎(chǔ)。