GC-MS/MS法測定乳油和可溶液劑型液體農(nóng)藥制劑中3種高風(fēng)險吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑

唐祥凱，馮德建，李懷平，史謝飛，許 洋，陳 璐，吳 微

(中國測試技術(shù)研究院，茶葉標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610021)

吡咯烷酮類有機(jī)溶劑，如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、1-乙基-2-吡咯烷酮(NEP)和2-吡咯烷酮(PYR)等溶解性好、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性均佳，且具有黏度低、無腐蝕、揮發(fā)性低和可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于鋰電、醫(yī)藥、農(nóng)藥、顏料、清洗劑、絕緣材料等行業(yè)[1-3]。在液體型農(nóng)藥制劑生產(chǎn)中，吡咯烷酮類有機(jī)溶劑主要用作溶劑或助溶劑，根據(jù)農(nóng)藥劑型及有效成分的不同，含量在1%～99%之間不等[4-5]。已有研究表明[6-7]，吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑具有致癌性、致畸性、致突變性、干擾內(nèi)分泌、繁殖損傷等風(fēng)險，鑒于此，各個國家對吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑制定了嚴(yán)格的管理規(guī)定或標(biāo)準(zhǔn)。2014年，美國環(huán)保署(EPA)將NEP從可使用農(nóng)藥助劑清單(即正面助劑清單)中刪除[8]；2012年，西班牙公布的植物保護(hù)產(chǎn)品中將NMP、NEP、PYR列入不可接受的助劑名單[9]；印尼規(guī)定家用農(nóng)藥中NMP含量不得大于25 mg/kg[10]。我國農(nóng)藥助劑管理工作起步較晚，2015年7月，原農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所發(fā)布了《農(nóng)藥助劑禁限用名單》的征求意見稿，擬規(guī)定農(nóng)藥制劑中NMP、NEP、PYR含量不得超過5%，但至今未正式出臺。這些有害助劑在農(nóng)藥施用過程中全部進(jìn)入環(huán)境，并長時間殘留在大氣圈、水圈等循環(huán)系統(tǒng)中，不僅污染環(huán)境，而且危害人畜安全，其毒害作用不低于甚至遠(yuǎn)大于農(nóng)藥有效成分本身[11]。

目前，對于農(nóng)藥制劑中吡咯烷酮類助劑的檢測僅有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3,12-13]，未見采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法同時測定NMP、NEP、 PYR 3種農(nóng)藥助劑的報道。與傳統(tǒng)的單四極桿質(zhì)譜相比，串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式具有更強(qiáng)的抗基質(zhì)干擾能力和定性、定量準(zhǔn)確性，且靈敏度更高，適合復(fù)雜基質(zhì)樣品的成分分析。

本研究選取具有代表性的乳油和可溶液劑型農(nóng)藥制劑為研究對象，擬建立GC-MS/MS法同時測定乳油和可溶液劑型液體農(nóng)藥制劑中3種高風(fēng)險吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑，并考察方法的溶劑效應(yīng)、基質(zhì)效應(yīng)、準(zhǔn)確度和精密度，旨用于實(shí)際農(nóng)藥制劑樣品的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

7890B-7000C型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電子轟擊源(EI)，G4567A 自動進(jìn)樣器和Mass Hunter工作站)、VF-WAXms毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)：美國Agilent公司產(chǎn)品；5810R型高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；BP 211D型電子天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

甲醇：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；N-甲基吡咯烷酮：分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；1-乙基-2-吡咯烷酮：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；2-吡咯烷酮：分析純，成都市科龍化工試劑廠產(chǎn)品。

聯(lián)苯菊酯(25 g/L乳油)、啶蟲脒(5%乳油)、高效氯氟氰菊酯(2.5%乳油)、氟啶脲(50 g/L乳油)、丁子香酚(0.3%可溶液劑)、桉油精(5%可溶液劑)、藜蘆堿(0.5%可溶液劑)、春雷霉素(2%可溶液劑)等市售農(nóng)藥制劑樣品：購自四川農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)品綜合市場。

對照品單標(biāo)儲備溶液的配制：分別稱取9.64 mgN-甲基吡咯烷酮，9.48 mg 1-乙基-2-吡咯烷酮和9.32 mg 2-吡咯烷酮于10 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑，配制成對照品單標(biāo)儲備溶液，于4 ℃避光保存。

對照品混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取適量N-甲基吡咯烷酮、1-乙基-2-吡咯烷酮和2-吡咯烷酮(精確至0.01 mg)于100 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑，配制成5 000 mg/L對照品混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4 ℃避光保存。

對照品混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：精確吸取適量對照品混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，以甲醇為溶劑，配制成不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

稱取0.1 g農(nóng)藥制劑樣品(精確至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，加入5 mL甲醇溶液，渦旋振蕩提取2 min，用甲醇定容至刻度，混勻，吸取5 mL提取液，于20 ℃下以8 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm尼龍濾膜，待GC-MS/MS分析。提取時，根據(jù)樣品中農(nóng)藥助劑的含量適當(dāng)調(diào)整提取溶劑用量。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 Agilent VF-WAXms毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：60 ℃保持2 min，以10 ℃/min升溫至150 ℃，再以25 ℃/min升溫至230 ℃，保持25 min；進(jìn)樣口溫度230 ℃，分流進(jìn)樣(分流比50∶1)，進(jìn)樣量1 μL；載氣：氦氣(≥99.999%)，恒流模式，流速1.0 mL/min。

1.4.2質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度230 ℃；碰撞氣：氮?dú)?≥99.999%)，流速1.5 mL/min；淬滅氣：氦氣(≥99.999%)，流速2.25 mL/min；溶劑延遲10.0 min；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。3種農(nóng)藥助劑的保留時間和特征離子列于表1。

表1 3種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑名稱、CAS號、GC-MS/MS參數(shù)Table 1 Chemical abstract service (CAS) numbers and GC-MS/MS parameters of three pyrrolidone pesticide adjuvants

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑選擇

由于農(nóng)藥制劑中含有的有效成分等其他物質(zhì)會對農(nóng)藥助劑成分的分離和檢測造成一定干擾，因此在檢測農(nóng)藥助劑時，樣品需溶解和稀釋后才能進(jìn)行分析。助劑分析常用的溶劑有甲醇[13-14]、乙腈[15-16]、丙酮[12,17]和乙酸乙酯[18-19]等，本實(shí)驗(yàn)分別用4種溶劑配制20.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一條件下進(jìn)行6次重復(fù)測定，通過對比目標(biāo)化合物在相同濃度下的響應(yīng)值以考察溶劑效應(yīng)，結(jié)果示于圖1。由圖1可知，采用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時，3種助劑響應(yīng)值最高。綜合考慮提取溶劑的溶解性、揮發(fā)性、毒性以及與目標(biāo)物的分離度后，最終選擇甲醇作為提取和稀釋溶劑。

注：EC表示乳油；SL表示可溶液劑圖1 溶劑效應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)對吡咯烷酮響應(yīng)值的影響(n=6)Fig.1 Effect of solvent and matrix effect on the peak of pyrrolidones (n=6)

2.2 基質(zhì)效應(yīng)考察

分別以聯(lián)苯菊酯(25 g/L乳油)、啶蟲脒(5%乳油)、高效氯氟氰菊酯(2.5%乳油)3種乳油型基質(zhì)空白溶液，丁子香酚(0.3%可溶液劑)、桉油精(5%可溶液劑)、藜蘆堿(0.5%可溶液劑)3種可溶液劑型基質(zhì)空白溶液配制成20.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一條件下對上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次重復(fù)測定，對比目標(biāo)化合物在相同濃度下的響應(yīng)值，考察基質(zhì)效應(yīng)對3種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑測定的影響，結(jié)果示于圖1。由圖1可知，采用空白基質(zhì)溶液配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對吡咯烷酮有輕微的抑制作用，且同劑型和不同劑型樣品間的結(jié)果差異較小。在實(shí)際樣品測定中，采用溶劑直接配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在滿足回收率要求的前提下，可進(jìn)一步減少前處理步驟，使方法更加簡便、快速，可操作性更強(qiáng)。

2.3 色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

農(nóng)藥助劑分析中常用的色譜柱有弱極性的HP-5MS柱[20-21]，中等極性的DB-624柱[22]和VF-1701ms柱[13,17]，強(qiáng)極性的VF-WAXms柱[12]，本實(shí)驗(yàn)逐一進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)使用弱極性的HP-5MS柱時，因吡咯烷酮極性較強(qiáng)，導(dǎo)致目標(biāo)化合物出峰時間過早，化合物分離不完全；使用中等極性的DB-624柱時，2-吡咯烷酮和1-乙基-2-吡咯烷酮不能有效分離，且2-吡咯烷酮保留性質(zhì)不佳，峰拖尾嚴(yán)重；VF-1701ms柱和VF-WAXms柱分離效果較好，3種目標(biāo)化合物均能實(shí)現(xiàn)完全分離，且VF-WAXms柱在分流模式下峰形尖銳對稱。因此本實(shí)驗(yàn)選擇VF-WAXms柱作為分析柱。

對3種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑進(jìn)行質(zhì)譜全掃描，選擇3～4個特征離子作為母離子，在10 eV碰撞能下進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，選擇碎片強(qiáng)度較大的二級碎片離子組成離子對，利用儀器的自動優(yōu)化MRM功能確定定量和定性離子對以及最優(yōu)碰撞能量，3種農(nóng)藥助劑的色譜、質(zhì)譜參數(shù)列于表1，典型的MRM色譜圖示于圖2。

圖2 3種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑典型的MRM色譜圖Fig.2 Typical MRM chromatogram ofthree pyrrolidone pesticide adjuvants

2.4 線性關(guān)系和定量限

配制1.0～40.0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4節(jié)條件分析，以各農(nóng)藥助劑的定量離子對峰面積y與對應(yīng)的質(zhì)量濃度x(mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果列于表2。由表2可知，3種農(nóng)藥助劑在1.0～40.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。以信噪比約為10時，空白樣品添加濃度計算方法的定量限為3.1～6.8 mg/kg，遠(yuǎn)低于《農(nóng)藥助劑禁限用名單》(征求意見稿)的限量要求(≤5%)，可滿足乳油和可溶液劑型液體農(nóng)藥制劑中3種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑含量的測定和質(zhì)量監(jiān)管要求。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

分別稱取24份0.1 g啶蟲脒(5%乳油)和丁子香酚(0.3%可溶液劑)樣品(精確至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，添加1.0 mL NMP、NEP和PYR濃度分別為0.31、0.33、0.68 mg/L的對照品混合標(biāo)準(zhǔn)使用液(LOQ水平添加)，添加0.5 mL(0.05%水平添加)、1.0 mL(0.1%水平添加)、2.0 mL(0.2%水平添加)NMP、NEP和PYR濃度為100.0 mg/L的對照品混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，每個水平重復(fù)測定6次，3種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑LOQ水平添加色譜圖示于圖3，準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果列于表3。由表3可知，3種農(nóng)藥助劑在啶蟲脒(5%乳油)樣品中加標(biāo)回收率為98.2%～108.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～2.6%，在丁子香酚(0.3%可溶液劑)樣品中加標(biāo)回收率為98.1%～111.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～3.4%，能夠滿足乳油和可溶液劑型液體農(nóng)藥制劑中助劑常量分析水平的準(zhǔn)確度和精密度要求。

2.6 與文獻(xiàn)報道檢測方法的比較

農(nóng)藥制劑樣品基質(zhì)較復(fù)雜，需進(jìn)行前處理以減少基質(zhì)干擾。已有文獻(xiàn)[3，12-13]報道采用固相萃取小柱凈化消除部分干擾物和不凈化直接將樣品稀釋后分析的方法，在進(jìn)行定量分析時，有采用溶劑直接配制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3,12]和空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線法[13]。將本研究與已報道的檢測方法進(jìn)行比較，選取氟啶脲(50 g/L乳油)和春雷霉素(2%可溶液劑)樣品，分別按照文獻(xiàn)報道方法和本方法進(jìn)行測定，考察0.05%、0.1%、0.2%質(zhì)量濃度添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表4。由表4可知，4種檢測方法在3個質(zhì)量濃度加標(biāo)情況下的回收率為88.3%～110.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～7.7%，均能滿足農(nóng)藥制劑中助劑常量分析水平的回收率要求。但本方法采用樣品直接稀釋進(jìn)樣，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析，操作更簡便，且靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均優(yōu)于文獻(xiàn)報道方法。

表2 3種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients and limits of quantification of the three pyrrolidone pesticide adjuvants

圖3 3種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑在乳油型(a)和可溶液劑型(b)樣品中LOQ水平添加色譜圖Fig.3 Chromatograms of LOQ levels of three pyrrolidone pesticideadded in EC (a) and SL (b) samples

表3 3種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑在乳油型和可溶液劑型樣品中回收率和精密度Table 3 Recoveries and RSDs for the three pyrrolidone pesticide adjuvants in EC and SL samples

表4 4種測試方法的樣品測試結(jié)果、加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Sample results, recoveries and RSDs of four methods

2.7 實(shí)際樣品檢測

采用本方法檢測市場上的94份乳油型和27份可溶液劑型農(nóng)藥制劑樣品中的3種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑，結(jié)果列于表5。由表5可知，6份乳油型農(nóng)藥制劑檢出N-甲基吡咯烷酮，含量為0.022%～11.328%，1份乳油型和1份可溶液劑型農(nóng)藥制劑檢出2-吡咯烷酮，含量為0.018%～0.023%。其中，咪鮮胺(450 g/L乳油)樣品N-甲基吡咯烷酮含量為11.328%，已超過《農(nóng)藥助劑禁限用名單》(征求意見稿)相關(guān)限量要求(≤5%)，存在一定風(fēng)險，應(yīng)引起相關(guān)管理部門重視。

表5 至少檢出1種吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑的農(nóng)藥制劑樣品的檢測結(jié)果Table 5 Results for pesticide formulations revealed at least one of the three pyrrolidone pesticide adjuvants

3 結(jié)論

本文建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測乳油和可溶液劑型液體農(nóng)藥制劑中3種高風(fēng)險吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑。與文獻(xiàn)報道的檢測方法相比，本方法的抗基質(zhì)干擾能力更強(qiáng)、定性定量分析更準(zhǔn)確、靈敏度更高。采用直接稀釋進(jìn)樣，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，簡化了操作步驟，增加了方法的靈敏性、準(zhǔn)確性和適用性，能夠滿足乳油和可溶液劑型液體農(nóng)藥制劑中3種高風(fēng)險吡咯烷酮類農(nóng)藥助劑同時測定的需要。