醉魚草內(nèi)生細(xì)菌ZJ1的抑菌作用及其脂肽類抑菌代謝產(chǎn)物鑒定

任 璐， 劉曉峰， 周建波， 殷 輝， 張寶俊， 趙曉軍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 山西 太原 030031)

醉魚草(BuddlejalindleyanaFortune)屬馬錢科醉魚草屬，為多年生小灌木，因其全株有毒，搗碎投入河中能使活魚麻醉而得名[1]。醉魚草屬植物約有100種，中國分布50余種，其分布廣泛、生長迅速，是天然的中草藥，具有祛風(fēng)殺蟲和活血化瘀的功效。醉魚草的主要成分有黃酮類、三萜類、環(huán)烯醚萜苷類等，具有抗菌殺蟲、抗氧化等生物活性[2]，其提取物對蝗蟲、小菜蛾幼蟲、菜青蟲幼蟲、朱砂葉螨及線蟲均有一定殺蟲活性[3]。

生物防治因其對人類和環(huán)境友好彌補(bǔ)了化學(xué)農(nóng)藥的不足，成為目前非常有潛力的研究方向。植物內(nèi)生細(xì)菌作為生物農(nóng)藥的天然資源菌，其種類豐富且廣泛存在于幾乎所有高等植物中，通過與植物相互作用提高植物抗病性[4]。并且內(nèi)生細(xì)菌在生存和繁殖的過程中產(chǎn)生多種次生代謝物，這些物質(zhì)對于植物病害的防治起到積極作用。其中，芽胞桿菌Bacillus是一種革蘭陽性細(xì)菌，其生長繁殖迅速，可以有效定殖在植物根際，能產(chǎn)生多種活性代謝物質(zhì)，不僅具有較強(qiáng)的抗逆性，還對多種植物病害具有良好的防治效果[5-6]。

植物內(nèi)生細(xì)菌的主要抗病機(jī)制之一是產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抗菌物質(zhì)種類多樣為生物農(nóng)藥開發(fā)提供了豐富多樣的先導(dǎo)化合物。其中，目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗菌物質(zhì)主要包括脂溶性抗生素[7]、環(huán)脂肽類抗菌物質(zhì)[8-9]、抗菌蛋白[10-12]、嗜鐵素[13]、幾丁質(zhì)酶[14-15]、黃酮類物質(zhì)[16]、多肽類物質(zhì)以及有機(jī)酸類[17]等，其中脂肽類抗菌物質(zhì)和抗菌蛋白的報道較多。但在抗菌物質(zhì)種類鑒定和開發(fā)應(yīng)用方面，植物內(nèi)生細(xì)菌與其它微生物、植物活性成分以及生物醫(yī)藥開發(fā)等研究相比，還處于起步階段。

目前，關(guān)于醉魚草內(nèi)生細(xì)菌的研究還鮮有報道，鑒于此，本研究以醉魚草為研究對象，從醉魚草莖中篩選出1株對多種植物病原真菌具有良好抑菌作用的內(nèi)生細(xì)菌ZJ1，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。并在此基礎(chǔ)上，探討醉魚草內(nèi)生細(xì)菌ZJ1的抑菌特性、抗菌物質(zhì)種類及其生防機(jī)制，旨在為醉魚草內(nèi)生細(xì)菌田間應(yīng)用技術(shù)開發(fā)和后期市場化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 內(nèi)生細(xì)菌及植物病原真菌

內(nèi)生細(xì)菌ZJ1從醉魚草莖部分離獲得，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)；10種供試植物病原真菌，分別為番茄灰霉病菌(Bortytiscinerea)，番茄早疫病菌(Alternariasolani)，番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)，黃瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.cucumerinum)，胡蘿卜褐腐病菌(Leptosphaerialibanotis)，核桃腐爛病菌(Cytosporajugandis)，棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)，蘋果腐爛病菌(Valsamali)，桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)，西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物化學(xué)保護(hù)實驗室保存。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1抑菌活性測定

采用平板對峙法測定ZJ1菌株對10種供試病原菌的抑菌率。將供試病原菌接種于PDA平板中央，在距其20 mm四側(cè)對稱接種ZJ1菌株，每種病原菌重復(fù)3次。26℃倒置培養(yǎng)5 d后，觀察有無抑菌作用，測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率。

采用生長速率法測定ZJ1菌株發(fā)酵液的抑菌率。ZJ1菌株在160 r·min-1，28℃恒溫條件下，在LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)72 h后，12 000 r·min-1，4℃離心12 min，去除菌體得到發(fā)酵液，分別進(jìn)行121℃滅菌處理40 min和0.22 μm微孔濾膜過濾處理，然后1∶9(V∶V)分別與PDA混勻制備平板，接種病原菌，每試驗重復(fù)3次。26℃倒置培養(yǎng)5 d，根據(jù)以下公式計算抑菌率。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1代謝物物理性質(zhì)測定

1.3.1排油能力測定 取9 mL蒸餾水水平放置于培養(yǎng)皿中央，取1 mL柴油緩慢滴加到液體表面形成一層薄油膜，取10 μL的ZJ1菌株發(fā)酵液輕落于油膜中心，觀察是否有油膜被排擠向四周形成排油圈的現(xiàn)象。

1.3.2液滴坍塌測定 在水平放置的parafilm膜上面分別輕滴20 μL的ZJ1發(fā)酵液和蒸餾水，觀察二者與parafilm膜的接觸角，觀察是否有液滴坍塌現(xiàn)象產(chǎn)生，如有則表明其具有一定的表面活性。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1脂肽抗菌物質(zhì)的提取

將ZJ1菌株26℃培養(yǎng)活化36 h后，挑取一環(huán)單菌落接種于LB培養(yǎng)液中，28℃，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h得到內(nèi)生細(xì)菌ZJ1種子液。取ZJ1種子液按1% (V/V)的接種量接入BPY培養(yǎng)液中，在160 r·min-1，28℃黑暗條件下振蕩培養(yǎng)72 h，于12 000 r·min-1離心12 min，去除菌體得到上清液。

上清液中脂肽類代謝物的提取參照高振峰[18]的鹽酸沉淀、甲醇抽提法進(jìn)行，得到黃色晶體，將黃色晶體用無菌水溶解，0.22 μm濾膜過濾后得到脂肽粗提取物，并于—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 脂肽粗提物抑菌活性檢測

采用瓊脂擴(kuò)散法對脂肽粗提物抑菌活性進(jìn)行測定：取100 μL供試病原菌孢子懸浮液(孢子濃度為1.6×106cfu·min-1)涂布于PDA平板表面，表面干燥后每皿用打孔器打2孔，分別加入80 μL脂肽粗提物和無菌水，每試驗重復(fù)3次，于28℃恒溫培養(yǎng)7 d，測定其抑菌圈直徑。

1.6 脂肽粗提物的分離純化及鑒定

分別采用制備型中壓層析和制備型HPLC對脂肽粗提物進(jìn)行分離純化，采用瓊脂擴(kuò)散法測定各收集峰抑菌活性。篩選出活性峰后，采用液質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo Fisher，型號：LTQ XL)對活性峰中脂肽類物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。液相條件、洗脫程序及質(zhì)譜條件參考高振峰[18]的方法。

上述抑菌活性的檢測均以A.solani為靶標(biāo)菌。

1.7 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1發(fā)酵液抑菌機(jī)制的初步研究

1.7.1對病菌菌絲生長及形態(tài)的影響 利用正置顯微鏡對1.2抑菌活性測定中抑制率較高的B.cinerea菌絲形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.7.2對病菌細(xì)胞膜透性的影響 將B.cinerea接種于無菌的PD培養(yǎng)液中，160 r·min-1，28℃黑暗振蕩培養(yǎng)7 d后，12 000 r·min-1離心后棄上清液，用無菌水清洗菌體3～5次，分別稱取5 g置于濃度為2%，5%，10%，15%，20%，50%，100%(V/V)的ZJ1發(fā)酵液和無菌水混合液中，以無菌水為對照。160 r·min-1，28℃振蕩培養(yǎng)，每1～2 h取樣離心檢測上清液電導(dǎo)率值。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行各處理間差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1抑菌活性測定

ZJ1菌株對10種供試病原菌均有不同程度抑制作用，如圖1、表1數(shù)據(jù)所示，抑制率為52.63%～95.69%。其中ZJ1菌株對M.fructicola的抑制率最高，達(dá)到95.69%，其次是對B.cinerea和C.jugandis的抑制率較高，分別達(dá)到78.38%和77.39%，對F.oxysporumf.sp.niveum和F.oxysporumf.sp.cucumerinum的抑制率最低，為52.63%和54.27%，對于其他病原菌的抑菌率在60.55%～66.33%之間。

表1 ZJ1菌株對10種病原菌的抑制作用Table 1 The inhibition of strain ZJ1 on 10 kinds of pathogenic fungi

ZJ1菌株發(fā)酵液經(jīng)過兩種處理方式后對10種供試病原菌均有不同程度抑制作用。如表2所示,過濾后ZJ1代謝物對10種病原真菌的抑制作用有顯著差異，抑菌率在32.39%～94.68%之間。其中對M.fructicola的抑制率最高，為94.68%；其次對F.oxysporumf.sp.niveum，L.libanotis和C.jugandis3種病原菌的抑制率較高，分別為81.10%，82.55%和88.52%；而對F.oxysporumf.sp.lycopersici的抑制率最低，僅為32.39%。經(jīng)121℃高溫處理后發(fā)酵液的抑菌率僅為13.55%～50.55%，其中僅對C.jugandis的抑菌率為50.55%，對V.mali，M.fructicola和L.libanotis的抑制率較低，在20%～40%之間，對其余病原菌的抑制率均在20%以下。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1菌株代謝物物理性質(zhì)測定

2.2.1排油能力測定 滴加10 μLZJ1菌株發(fā)酵濾液后油膜緩慢向四周擴(kuò)散，油膜被擠向四周產(chǎn)生φ為45 mm的排油圈(圖2左)。

2.2.2液滴坍塌測定 蒸餾水液滴(左)與parafilm膜接觸面較小，成球狀；而ZJ1菌株發(fā)酵濾液液滴(右)接觸面較大，發(fā)生坍塌失去球狀(圖2右)，說明ZJ1菌株發(fā)酵濾液具有一定的表面活性。

圖1 ZJ1菌株對10種病原菌的抑制作用Fig.1 The inhibition of strain ZJ1 on 10 kinds of pathogenic fungi注：1～10分別為番茄灰霉病菌、番茄枯萎病菌、番茄早疫病菌、黃瓜枯萎病菌、胡蘿卜褐腐病菌、核桃腐爛病菌、棉花立枯病菌、蘋果腐爛病菌、桃褐腐病菌、西瓜枯萎病菌Note：1～10 represent B. cinerea，F(xiàn). oxysporum f.sp. lycopersici，A. solani，F(xiàn). oxysporum f.sp. cucumerinum，L. libanotis，C. jugandis，R. solani，V. mali，M. fructicola，F(xiàn). oxysporum f.sp.niveum，respectively

表2 ZJ1菌株發(fā)酵液對10種病原菌的抑制作用Table 2 The inhibition of fermentation broth of strain ZJ1 on 10 kinds of pathogenic fungi

圖2 菌株ZJ1代謝物排油能力和液滴坍塌測定Fig.2 The oil discharge capacity and droplet collapse of ZJ1 metabolite

2.3 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1脂肽抗菌物質(zhì)的分離、純化及鑒定

2.3.1ZJ1菌株脂肽粗提物抑菌活性 以A.solani為靶標(biāo)，如圖3所示，ZJ1菌株脂肽粗提物具有較好抑菌活性，可形成明顯抑菌圈，抑菌圈直徑為24.8 mm。

2.3.2ZJ1菌株脂肽粗提物分離、純化 如圖4，5所示，在明確菌株ZJ1脂肽粗提物的抑菌活性后使用中壓層析儀對其進(jìn)行分離純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在檢測波長為211 nm下，共檢測出7個吸收峰；抑菌活性測定發(fā)現(xiàn)，僅峰7具有較好的抑菌活性，抑菌圈直徑為21.6 mm，其余吸收峰均無抑菌活性。

圖3 ZJ1脂肽粗提物對番茄早疫病菌的抑菌效果Fig.3 Inhibitory effect of strain ZJ1 lipopeptide crude extracts on A. solani

圖4 ZJ1菌株脂肽物質(zhì)中壓層析活性峰HPLC純化圖譜Fig.4 The HPLC purification map of active peak purified by medium pressure chromatography of the lipopeptide of strain ZJ1

2.3.3ZJ1菌株脂肽物質(zhì)的質(zhì)譜鑒定 如圖6，7所示，使用LC-MS對活性峰峰7進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性峰峰7在保留時間3.90 min處具有較大吸收峰，且活性峰雜峰較少；對保留時間3.90 min下的質(zhì)譜圖進(jìn)行查看，菌株ZJ1在m /z值為1 030.00，1 044.10 和1 058.01 處有離子峰(簇)出現(xiàn)，且分子量之間相差為14(CH2)出現(xiàn)的3個離子峰同表面活性素(Surfactin)家族相似；另外，還發(fā)現(xiàn)菌株ZJ1在m /z值為1 453.85，1 467.35，1 481.55和1 495.49處同樣有離子峰(簇)出現(xiàn)，且分子量之間相差為14(CH2)出現(xiàn)的4個離子峰同泛革素(Fengycin)家族相似。

圖5 ZJ1菌株脂肽粗提物中壓層析各吸收峰對番茄早疫病菌抑菌效果Fig.5 The antifugnal activity of all absorption peak of lipopeptide purified by medium pressure chromatography of strain ZJ1 against A. solani

圖6 ZJ1菌株脂肽抗菌物質(zhì)LC檢測圖譜Fig.6 The LC detection map of antifugnal lipopeptide material of strain ZJ1

圖7 ZJ1菌株脂肽抗菌物質(zhì)保留時間3.90 min時MS圖譜Fig.7 The MS map of of antifugnal lipopeptide material of strain ZJ1 at the time of 3.90 min

2.4 拮抗細(xì)菌ZJ1發(fā)酵液抑菌機(jī)制初步研究

2.4.1對病菌菌絲生長及形態(tài)的影響 ZJ1菌株代謝物對B.cinerea菌絲生長形態(tài)影響明顯，處理后的B.cinerea產(chǎn)孢極少，菌絲生長異常，明顯斷裂且折疊分叉(圖8)。

圖8 ZJ1菌株發(fā)酵濾液對B. cinerea菌絲生長的影響Fig.8 Inhibiting effect of actinomycete strain ZJ1 on mycelium growth of B. cinerea注：圖中A為處理前B. cinerea菌絲生長形態(tài)，B為處理后B. cinerea菌絲生長形態(tài)Note:A represent mycelium growth morphology of B. cinerea;B represent mycelium growth of B. cinerea after treatment

2.4.2對病菌細(xì)胞膜透性的影響 如圖9所示，在不同時刻，對照組電導(dǎo)率(ms/cm)隨時間的推移未出現(xiàn)較大變化。不同濃度發(fā)酵液處理后電導(dǎo)率值雖略有波動但總體均逐漸呈現(xiàn)小幅上升趨勢，且上升幅度與發(fā)酵液的濃度呈正相關(guān)。在同一時刻，對照組與5%發(fā)酵液處理后菌體的電導(dǎo)率值較為相近，與其它濃度發(fā)酵液處理后的電導(dǎo)率有較大差異，且數(shù)值與濃度呈正相關(guān)。該結(jié)果表明ZJ1菌株代謝產(chǎn)物對B.cinerea的細(xì)胞膜透性會產(chǎn)生一定程度的影響，破壞程度會隨著發(fā)酵液濃度和時間的增加而加劇。

圖9 不同濃度的ZJ1菌株發(fā)酵濾液對B. cinerea細(xì)胞膜透性的影響Fig.9 The effect of different concentration of fermentation filtrate of ZJ1 on cell membrane permeability B. cinerea注：圖中2，5，10，15，20，50，100表示ZJ1菌株發(fā)酵液的體積分?jǐn)?shù)(V/V)，PD表示PD培養(yǎng)基對照Note:2,5,10,15,20,50 and 100 in the figure represent the volume fraction of ZJ1 fermentation broth(V/V)，PD represent PD medium control

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌對植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。李樂溪等[19]從大蒜(AlliumsativumL.)蒜瓣中分離得到對5種病原菌有較好抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌和放線菌19株；李玲玲等[20]從銀杏(Ginkgobiloba)莖葉中分離得到12株內(nèi)生真菌、3株內(nèi)生放線菌和4株內(nèi)生細(xì)菌，均對金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus有較強(qiáng)抑菌活性。本研究從醉魚草莖中分離并篩選出1株抑菌活性較強(qiáng)的內(nèi)生細(xì)菌ZJ1，對M.fructicola、B.cinerea和C.jugandis的抑制率較高，達(dá)到75%以上。ZJ1具有抑菌廣譜性和較強(qiáng)的抑菌活性，這與陳奕鵬[21]從香蕉(MusananaLour.)根部分離出的內(nèi)生細(xì)菌，蔣晶晶[22]分離得到的葡萄(Vitisvinifera)內(nèi)生細(xì)菌抑菌結(jié)果相似，均對多種植物病原真菌具有良好抑菌效果。對ZJ1菌株發(fā)酵液高溫處理后，發(fā)現(xiàn)抑菌率明顯降低，對M.fructicola，B.cinerea的抑菌率降到20%以下，說明高溫可以降低內(nèi)生細(xì)菌代謝物的活性。推測ZJ1菌株發(fā)酵液的抑菌成份中含有抗菌蛋白，但本研究未對抗菌蛋白進(jìn)行分離和鑒定，還需進(jìn)一步研究確定。

植物內(nèi)生細(xì)菌的抑菌機(jī)理之一就是利用自身產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)來發(fā)揮抗病作用，微生物在適宜培養(yǎng)條件下，可分泌脂肽、磷酯類、糖脂類等多種化合物的次生代謝產(chǎn)物，使其具有一定表面活性。黃華毅等[23]從棗樹根際土壤中分離獲得1株枯草芽孢桿菌STO-12，楊柯[24]從海蘆筍(SalicorniabigeloviiTon.)中分離得1株內(nèi)生細(xì)菌YK-HLS-11，發(fā)現(xiàn)其次生代謝產(chǎn)物均為脂肽類化合物。大量研究表明，芽孢桿菌在生長后期產(chǎn)生的主要抗菌物質(zhì)是脂肽類物質(zhì)。本試驗前期采用便捷、準(zhǔn)確的排油圈法和液滴坍塌法對ZJ1菌株的抗菌物質(zhì)進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果得到該菌株代謝物可產(chǎn)生較大排油圈，與水相比表面張力小，出現(xiàn)坍塌現(xiàn)象，說明該菌株含有表面活性成分，從而初步推測可含有大量脂肽類物質(zhì)。

為進(jìn)一步明確ZJ1菌株的抑菌物質(zhì)，采用制備型HPLC與質(zhì)譜分析對其進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，證實ZJ1菌株可產(chǎn)生表面活性素(Surfactin)和泛革素(Fengycin)。高振峰[18]從梓樹(CatalpaovataG. Don.)中分離得到1株產(chǎn)脂肽類化合物的內(nèi)生細(xì)菌ZSYB-1，鑒定其脂肽類代謝物主要為伊枯草菌素itruin A。目前發(fā)現(xiàn)的該類物質(zhì)主要有表面活性素(Surfactin A，B，C)、伊枯草菌素(Iturin A，C和桿菌抗霉素L，D，F(xiàn)等)和泛革素(Fengycin A，B和制磷脂菌素)[25]。脂肽類物質(zhì)具有較強(qiáng)的表面活性作用，植物體內(nèi)的芽孢桿菌通過改善表面張力來改變生長環(huán)境，以便于形成菌群快速移動，方便抑菌物質(zhì)的運(yùn)輸、儲存和在植物表面定殖，并且使其具有或強(qiáng)或弱的的抗菌活性。脂肽抗菌物質(zhì)與抗菌蛋白相比，具有較好的耐熱、耐酸堿和耐紫外特性，應(yīng)用潛力良好。本研究在ZJ1菌株抑菌物質(zhì)成分的基礎(chǔ)上，后續(xù)可對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定，以期推動開發(fā)環(huán)境友好型生物農(nóng)藥提供應(yīng)用依據(jù)。

內(nèi)生細(xì)菌的抑菌機(jī)理是在生長過程中所分泌的次生代謝物可以干擾、抑制另一種生物的生長發(fā)育而自身卻不受影響，其作用于細(xì)胞，破壞菌體細(xì)胞的完整性，還會阻礙能量物質(zhì)合成引起歧變，出現(xiàn)腫脹破裂造成原生質(zhì)泄露[26]。周金偉等[27]從煙草(NicotianatabacumL.)中分離的短短芽胞桿菌011主要是導(dǎo)致A.solani菌絲生長異常，抑制孢子萌發(fā)。寧爽[28]從植物莖、葉部分離的假單胞菌BTa14、Bar25的發(fā)酵液可導(dǎo)致蘋果斑點(diǎn)落葉病菌Alternariamali、蘋果輪紋病菌Physalosporapiricola等病原菌菌絲膨大、扭曲、畸形從而影響病菌生長。張麗[29]從印楝(AzadirachtaindicaA.Juss.)葉片和果實中篩選出的內(nèi)生放線菌YL-2的抑菌活性物質(zhì)對稻瘟病菌Magnaportheoryzae菌絲生長、病原孢子萌發(fā)抑制率可達(dá)90%以上。本試驗觀察B.cinerea經(jīng)ZJ1菌株發(fā)酵液處理后的生長形態(tài)，發(fā)現(xiàn)該菌株具有相似的抑菌機(jī)制。

細(xì)胞膜是病原菌的保護(hù)屏障，在遇到抑菌活性強(qiáng)的拮抗因子遭到破壞時，保護(hù)屏障便會打開，內(nèi)部電解質(zhì)外泄到培養(yǎng)液中，促使培養(yǎng)液中電導(dǎo)率上升[30]。陳忠軍等[31]從發(fā)酵食品中分離出2株乳桿菌，發(fā)現(xiàn)其抑菌物質(zhì)可破壞酵母細(xì)胞膜通透性。石玉星[32]從曼陀羅(DaturastramoniumLinn.)組織中分離出一株內(nèi)生細(xì)菌MY1，發(fā)現(xiàn)其可破壞谷瘟病菌的細(xì)胞膜通透性，使電導(dǎo)率上升。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)ZJ1菌株處理后，對B.cinerea的細(xì)胞膜透性產(chǎn)生了較大影響，使大分子物質(zhì)外滲到胞外，且這種破壞程度會隨著發(fā)酵濾液濃度和時間的增加而加劇。在后續(xù)的研究中，將繼續(xù)對其分泌抗菌物質(zhì)的種類、分子組成等進(jìn)行探索，以明確其抑菌機(jī)制。

4 結(jié)論

醉魚草內(nèi)生細(xì)菌ZJ1菌株及其發(fā)酵液對10種供試病原真菌均有良好的抑菌作用，對Moniliniafructicola的抑制率最高，達(dá)95.69%和94.68%。測定ZJ1菌株代謝物的物理特性發(fā)現(xiàn)其具有排油能力且出現(xiàn)液滴坍塌現(xiàn)象，推測ZJ1菌株代謝物中含有脂肽類化合物。對ZJ1菌株的脂肽類代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和鑒定，發(fā)現(xiàn)其含有表面活性素和泛革素。經(jīng)ZJ1菌株代謝物處理后的Botrytiscinerea，產(chǎn)孢極少或不能正常產(chǎn)孢，菌絲生長異常，發(fā)生斷裂。隨著處理時間延長，B.cinerea細(xì)胞膜通透性增大，滲透物質(zhì)流出，電導(dǎo)率上升。本研究結(jié)果為醉魚草內(nèi)生細(xì)菌ZJ1的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。