滇重樓地上部分總皂苷HPLC指紋圖譜△

蔣維，李小輝，萬(wàn)近福，*，梅雙喜，付小云

1.昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院/云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111；4.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111

重樓Paridis Rhizoma是百合科重樓屬植物，以云南、四川、貴州、福建等地的種類(lèi)和資源最為豐富，主要有滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz、七葉一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara、多葉重樓P.polyphyllaSm.var.polyphylla、華重樓P.polyphyllavar.chinensis(Franch.) Hara、狹葉重樓P.polyphyllavar.stenophyllaFranch.、花葉重樓P.marmorataStearn等多個(gè)品種。重樓作為傳統(tǒng)中藥材，藥用歷史悠久，一直以根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛和涼肝定驚的功效?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版收載的品種為滇重樓和七葉一枝花[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，重樓主要活性成分為甾體皂苷類(lèi)化合物，具有較強(qiáng)的抗腫瘤、修復(fù)胃黏膜損傷、誘導(dǎo)血小板聚集和子宮平滑肌收縮的活性。重樓每年都可再生的地上部分一直被認(rèn)為是非藥用部位而被丟棄，至今未被開(kāi)發(fā)利用。為了充分利用重樓地上部分植物資源，已有學(xué)者對(duì)重樓地上部位開(kāi)展了化學(xué)成分及藥理作用研究，證明了皂苷類(lèi)成分是重樓地上部分的主要活性成分[3-4]，地上部分比根莖含有更多的皂苷元，尤其是C-22內(nèi)酯和紐替皂苷元(nuatigenin)只在地上部分檢測(cè)到。但重樓地上部分和根莖中均含有《中國(guó)藥典》2020年版重樓“含量測(cè)定”項(xiàng)下的重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅶ等成分，說(shuō)明其皂苷類(lèi)成分相似但不完全相同，具有開(kāi)發(fā)價(jià)值[5]。為了更好地開(kāi)發(fā)和利用重樓地上部分，本研究采用高效液相色譜法(HPLC)建立滇重樓地上部分總皂苷的指紋圖譜，并進(jìn)行滇重樓地上部分、地下部分特征圖譜比對(duì)，為重樓地上部分總皂苷的有效質(zhì)量控制及重樓地上部分的開(kāi)發(fā)利用和深入研究提供參考。

1 材料

1.1 試藥

干燥滇重樓地上部分由云南白藥武定種植基地提供，由云南白藥集團(tuán)趙庭周高級(jí)工程師鑒定，為滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz。

滇重樓地上部分總皂苷為自制，包括3批中試實(shí)驗(yàn)制備樣品(批號(hào)分別為20190805、20190812、20190819，編號(hào)分別為S1～S3)和3批放大實(shí)驗(yàn)制備樣品(批號(hào)分別為20190616-1、20190616-2、20190616-3，編號(hào)分別為S4～S5)；對(duì)照品重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ(批號(hào)：11590-201604)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于94.0%；對(duì)照品重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷PA、重樓皂苷H為實(shí)驗(yàn)室自制，標(biāo)定純度>99.2%。

柱色譜洗脫試劑三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇為工業(yè)純重蒸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；顯色劑用10%硫酸乙醇溶液；水為自制超純水；乙腈(色譜純，Merck公司)；甲醇、無(wú)水乙醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀，包括LC-20AT型四元泵、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣儀、CTO-20A型柱溫箱、SPDM20A型紫外檢測(cè)器(美國(guó)賽默飛世爾公司)；AG-285型電子分析天平[Mettler-Toledo(上海)有限公司]；SK8200HP型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；超純水器(美國(guó)Millipore公司)；VG Auto Spec-3000型質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)；DRX-400型核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)。

柱色譜硅膠(80～100、200～300目)和薄層色譜硅膠G板、HPD-100型大孔樹(shù)脂(青島海洋化工有限公司)；十八烷基鍵合硅膠Rp-C18(40～63 μm，Merck公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷制備

重樓藥材(粉碎、過(guò)篩)粗粉用60%乙醇回流提取3次(共14倍量)，離心得到提取液，提取液50 ℃減壓濃縮得到濃縮液，濃縮液再用HPD-100型大孔樹(shù)脂柱色譜純化(先后用40%、85%乙醇洗脫)，收集85%流分減壓濃縮、真空干燥，即得。

2.2 色譜條件

采用Ecosil HPLC C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)進(jìn)行分離，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)溶液，梯度洗脫(0～10 min，40%A；10～30 min，40%～50%A；30～32 min，50%～40%A；32～35 min，40%A)；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；柱溫為31 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)時(shí)間為35 min。

2.3 溶液的制備

2.3.1混合對(duì)照品溶液 取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷PA、重樓皂苷H對(duì)照品適量，加甲醇制成含重樓皂苷Ⅰ 72.97 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅱ 82.92 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅲ 75.30 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅳ 72.40 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅴ 64.70 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅵ 61.30 μg·mL-1、重樓皂苷Ⅶ 66.30 μg·mL-1、重樓皂苷PA 68.50 μg·mL-1、重樓皂苷H 72.40 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3.2供試品溶液 取各批次總皂苷試藥約0.15 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加85%乙醇水使溶解、定容，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液S1(批號(hào)：20190805)，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)特征圖譜，選擇出峰穩(wěn)定、峰面積較大、響應(yīng)值最高的重樓皂苷Ⅶ為參照峰，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.26%，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.81%，表明本方法精密度良好。

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品S1(批號(hào)：20190805)6份，按2.3.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，記錄特征圖譜，以重樓皂苷Ⅶ為參照峰，計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果表明，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.31%，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.02%，表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液S1(批號(hào)：20190805)分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)行檢測(cè)，記錄特征圖譜，以重樓皂苷Ⅶ為參照峰，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.97%，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.22%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立

將6批重樓地上部分總皂苷樣品分別按2.3.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得到各樣品的HPLC特征圖譜。將6批樣品的特征圖譜以CDF格式依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)，以S1樣品圖譜為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.10 min，對(duì)色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正后，自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜(R)，見(jiàn)圖1。共標(biāo)定8個(gè)共有峰，6批所測(cè)供試品色譜圖與對(duì)照?qǐng)D譜相似度均大于0.99。結(jié)果表明，不同批次的重樓地上部分總皂苷的化學(xué)組成十分相似。

圖1 6批重樓地上部分總皂苷特征圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜(R)

2.6 特征圖譜中未知化合物分離鑒定

2.6.1化合物分離 取3批中試重樓地上部分總皂苷各200 g，共600 g，85%乙醇水溶解，1200 g硅膠拌樣。粗分劃段：試藥用硅膠柱色譜(乙酸乙酯-乙醇，100∶1～10∶1)梯度洗脫，得到目標(biāo)峰化合物含量較高的G、F組分；G組分用硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇，20∶1～5∶1，)梯度洗脫，再經(jīng)中壓Rp-C18柱色譜(75%～100%甲醇)洗脫，得到2個(gè)亞組分，再分別重結(jié)晶、濾過(guò)結(jié)晶、收集母液再重結(jié)晶得化合物cld01(3 g)和化合物cld03(1.5 g)；F組分用硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇，20∶1～5∶1，)梯度洗脫，再用中壓Rp-C18柱色譜(75%～100%甲醇)，得到1個(gè)亞組分，經(jīng)重結(jié)晶、濾過(guò)結(jié)晶、收集母液再重結(jié)晶得化合物cld02(100 mg)。

2.6.2結(jié)構(gòu)鑒定cld01：白色針狀結(jié)晶(甲醇)。ESI-MSmz：883[M-H]-，929[M+HCOO]-；分子式為C45H72O17。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.31(1H，brd，J=5.0 Hz，H-6)，4.45(lH，dd，J=5.5，5.0 Hz，H-16)，3.85(1H，m，H-3)，3.51(2H，m，H-26)，2.28(lH，q，J=7.0 Hz，H-20)，1.23(3H，d，J=7.0 Hz，Me-21)，0.97(3H，s，Me-18)，0.95(3H，s，Me-19)，0.69(3H，d，J=5.5 Hz，Me-27)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：37.6(C-1)，30.2(C-2)，78.1(C-3)，39.3(C-4)，142.0(C-5)，122.1(C-6)，32.4(C-7)，32.3(C-8)，50.1(C-9)，37.0(C-10)，21.3(C-11)，32.1(C-12)，45.1(C-13)，53.1(C-14)，31.8(C-15)，90.1(C-16)，90.0(C-17)，17.3(C-18)，19.7(C-19)，44.9(C-20)，9.2(C-21)，110.5(C-22)，32.1(C-23)，29.0(C-24)，30.5(C-25)，66.9(C-26)，17.4(C-27)；glc：102.5，75.6，76.5，77.7，77.2，61.5；rha′：102.4，73.4，73.0，80.0，68.3，18.6；rha″：103.1，72.6，72.9，74.0，70.4，17.9。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，故鑒定化合物cld01為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷{(diào)pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→4)]-β-D-glucopyran oside}[6]，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

cld01：R1=OH，R2=S1cld02：R1=OH，R2=S2cld03：R1=H，R2=S1S1 =α-L-rha-(1→4)-α-L-rha-(1→4)-β-D-glc-S2 =α-L-rha-(1→4)-β-D-glc-圖2 化合物cld01～cld03結(jié)構(gòu)

cld02：白色無(wú)定型粉末。ESI-MSmz：761[M+Na]+，分子式為C39H62O13。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.84(2H，s，H-16)，4.39(1H，d，J=8.0 Hz，H-17OH)，3.97(2H，ddt，J=18.5，9.5，6.5 Hz，H-26)，3.85～3.71(2H，m，H-3)，2.21(1H，q，J=7.0 Hz，H-20)，1.20(3H，d，J=7.0 Hz，Me-21)，0.97(3H，s，Me-18)，0.95(3H，s，Me-19)，0.69(3H，d，J=5.5 Hz，Me-27)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：37.9(C-1)，30.4(C-2)，78.0(C-3)，39.6(C-4)，141.9(C-5)，122.0(C-6)，32.5(C-7)，31.7(C-8)，51.0(C-9)，37.6(C-10)，21.5(C-11)，32.1(C-12)，45.7(C-13)，53.6(C-14)，31.3(C-15)，90.4(C-16)，91.0(C-17)，17.5(C-18)，19.8(C-19)，45.0(C-20)，9.2(C-21)，110.5(C-22)，32.5(C-23)，29.4(C-24)，30.7(C-25)，67.0(C-26)，17.8(C-27)；glc：102.4，75.2，76.7，79.0，77.0，61.9；rha：102.9，72.4，72.9，73.9，70.6，18.0。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，故鑒定化合物cld02為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷[pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranoside)][7]，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

cld03：白色針狀結(jié)晶(甲醇)。ESI-MSm/z：867[M-H]-，913[M+HCOO]-，分子式為C45H72O16。1H-NMR(500 MHz，MeOD)δ：5.37(1H，dt，J=5.5，2.0 Hz，H-6)，5.17(1H，d，J=2.0 Hz，H-17)，4.84(1H，d，J=12.0 Hz，H-8)，4.57(1H，s，H-6)，4.39(2H，t，J=7.0 Hz，H-16)，3.95～3.89(1H，m，H-2)，2.30～2.20(1H，m，H-1)，1.20(3H，d，J=7.0 Hz，Me-21)，0.97(3H，s，Me-18)，0.95(3H，s，Me-19)，0.69(3H，d，J=5.5 Hz，Me-27)；3C-NMR(125MHz，MeOD)δ：37.9(C-1)，29.8(C-2)，76.7(C-3)，38.5(C-4)，141.9(C-5)，122.5(C-6)，32.5(C-7)，31.3(C-8)，51.5(C-9)，38.0(C-10)，21.9(C-11)，39.5(C-12)，40.9(C-13)，57.5(C-14)，32.6(C-15)，80.3(C-16)，61.9(C-17)，16.4(C-18)，19.7(C-19)，41.4(C-20)，14.9(C-21)，110.0(C-22)，31.3(C-23)，28.5(C-24)，30.5(C-25)，66.1(C-26)，17.5(C-27)；glc：102.5，75.3，76.7，78.9，77.0，61.9；rha′：102.4，72.9，73.7，80.6，67.9，19.7；rha″：103.2，72.9，73.0，73.9，70.4，18.5。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，故鑒定化合物cld03為薯蕷皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷{(diào)diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→4)]-β-D-glucopyrano side)}[8]，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

2.6.3共有峰的歸屬及指認(rèn) 分別取供試品溶液(S1)、9個(gè)重樓皂苷混合對(duì)照品溶液和分離得到的cld01～cld033個(gè)單體化合物加甲醇溶解制成的3個(gè)對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，見(jiàn)圖3～4。參照12個(gè)對(duì)照品的色譜行為及其二極管陣列(DAD)檢測(cè)紫外光譜圖，在圖3上對(duì)各色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，確認(rèn)了7個(gè)成分，即重樓皂苷Ⅶ(2號(hào)峰)、重樓皂苷PA(3號(hào)峰)、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(4號(hào)峰)，偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(5號(hào)峰)、重樓皂苷Ⅱ(6號(hào)峰)、重樓皂苷Ⅳ(7號(hào)峰)、薯蕷皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(8號(hào)峰)。

圖3 供試品溶液(S1)HPLC圖

注：A.混合對(duì)照品；B～D.cldo1～cldo3；1.重樓皂苷Ⅶ；2.重樓皂苷PA；3.重樓皂苷H；4.重樓皂苷Ⅵ；5.重樓皂苷Ⅱ；6.重樓皂苷Ⅳ；7.重樓皂苷Ⅲ；8.重樓皂苷Ⅰ；9.重樓皂苷Ⅴ。圖4 9個(gè)重樓皂苷混合對(duì)照品及cld01、cld02、cld03 HPLC圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同流動(dòng)相體系(甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液體系)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，乙腈-水體系分離效果最好，分析時(shí)采用梯度洗脫并對(duì)不同的梯度程序進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)還考察了29、30、31 ℃ 3個(gè)不同柱溫，結(jié)果表明，柱溫為31 ℃時(shí)，分離效果最佳。最后分析條件確定為2.2項(xiàng)下色譜條件，峰分離度較好，保留時(shí)間適中。

在筆者前期對(duì)滇重樓地上部分總皂苷提取、純化工藝研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)首次建立了滇重樓地上部分總皂苷的指紋圖譜，為滇重樓地上部分總皂苷的質(zhì)量控制、制備和利用提供參考。