淡竹葉浸出物提取方法的建立及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

魯云，李燕珍，林碧珊，王壽富，魏梅，孫冬梅，梁志毅

廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

淡竹葉始載于《滇南本草》[1]，《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2015年版記載淡竹葉為禾本科植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.的干燥莖葉，其性寒，味苦，具有清熱瀉火、除煩止渴、利尿通淋等功效[2]，主要分布于我國(guó)廣東、湖南、廣西、福建、浙江、安徽等地[3]。有相關(guān)文獻(xiàn)記載，淡竹葉的化學(xué)成分主要以黃酮類為主，此外，還有揮發(fā)油類、三萜類、酚酸、多糖、氨基酸等[4-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，淡竹葉有解熱、利尿、鎮(zhèn)痛、抗菌等作用[7]，除作藥用外，淡竹葉還可應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域[8]。隨著淡竹葉的廣泛應(yīng)用，如何控制淡竹葉浸出物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)成為亟待解決的問題。目前，除2010年版《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》有收載“淡竹葉的浸出物檢查”外(其采用熱浸法70%乙醇作溶劑提取，并要求浸出物得率不得少于9.0%)，歷版《中國(guó)藥典》與其他各地中藥飲片炮制規(guī)范對(duì)淡竹葉藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)均未有浸出物的相關(guān)記載[9]。因此，淡竹葉浸出物的最佳提取方法以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚無(wú)明確參考依據(jù)。

本研究對(duì)淡竹葉浸出物得率、異葒草苷含量、日當(dāng)藥黃素含量、特征圖譜總峰面積及過濾速度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，優(yōu)選淡竹葉的浸出物提取方法，建立淡竹葉浸出物質(zhì)量控制指標(biāo)，為其他藥材浸出物的提取及其浸出物質(zhì)量控制指標(biāo)的建立提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 儀器

H-class型超高效液相色譜儀、光電二極管陣列檢測(cè)器(PDA)、Empower工作站(沃特世公司)；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)；ME204E型萬(wàn)分之一天平(Mettler Toledo公司)；DHG-9147A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

異葒草苷對(duì)照品(批號(hào)：111974-201401，純度：94.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；日當(dāng)藥黃素對(duì)照品(批號(hào)：18082822，純度：99.7%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；乙醇(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，默克股份有限公司)；水(Milli-Q Direct超純水)。

12批淡竹葉藥材來源信息見表1，經(jīng)過廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為禾本科植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.的干燥莖葉，且符合《中國(guó)藥典》2015年版要求。

表1 淡竹葉樣品信息

2 方法

2.1 浸出物提取方法

2.1.1冷浸法 取淡竹葉藥材供試品約4 g，精密稱定，共12份，分別以水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇為溶劑(每種溶劑平行測(cè)定3份)，按照《中國(guó)藥典》2015年版通則2201項(xiàng)下冷浸法測(cè)定，依次計(jì)算浸出物得率，并記錄過濾速度快慢。

2.1.2熱浸法 取淡竹葉藥材供試品約4 g，精密稱定，共12份，分別以水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇為溶劑(每種溶劑平行測(cè)定3份)，按照《中國(guó)藥典》2015年版通則2201項(xiàng)下熱浸法測(cè)定，依次計(jì)算浸出物得率，并記錄過濾速度快慢。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～2 min，10%A；2～3 min，10%～16%A；3～7.5 min，16%A；7.5～16 min，16%～52%A)；柱溫：40 ℃；流速：0.25 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取異葒草苷對(duì)照品、日當(dāng)藥黃素對(duì)照品適量，精密稱定，加60%乙醇制成含異葒草苷19.776 μg·mL-1、日當(dāng)藥黃素16.130 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取本品粉末(過四號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率：500 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。另取2.1項(xiàng)下冷浸法與熱浸法續(xù)濾液適量，濾過，取續(xù)濾液備用。

2.5 專屬性試驗(yàn)

吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液及供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定。結(jié)果表明，陰性對(duì)照溶液在對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)位置無(wú)吸收，陰性對(duì)照無(wú)干擾，方法專屬性良好，見圖1。

注：A.對(duì)照品溶液；B.陰性對(duì)照溶液；C.供試品溶液；2.異葒草苷；3.日當(dāng)藥黃素。圖1 淡竹葉對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液、供試品溶液HPLC圖

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取質(zhì)量濃度為102.037 μg·mL-1的異葒草苷對(duì)照品母液以及質(zhì)量濃度為102.292 2 μg·mL-1的日當(dāng)藥黃素對(duì)照品母液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度。分別將稀釋后不同濃度的對(duì)照品溶液及對(duì)照品母液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：異葒草苷Y1=10.952X1-0.752 7(r1=0.999 8)，質(zhì)量濃度為1.020 4～102.037 0 μg·mL-1；日當(dāng)藥黃素Y2=10.192X2-0.157 1，(r2=0.999 9)，質(zhì)量濃度為1.022 9～102.292 2 μg·mL-1。表明異葒草苷、日當(dāng)藥黃素在以上范圍內(nèi)進(jìn)樣質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

取S1樣品粉末1.0 g，按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算峰1、異葒草苷、日當(dāng)藥黃素、峰4峰面積的RSD分別為1.93%、0.10%、0.45%、0.52%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取S1樣品粉末1.0 g，平行6份，按2.4項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算峰1、異葒草苷、日當(dāng)藥黃素、峰4峰面積的RSD分別為1.93%、2.02%、1.96%、2.48%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S1樣品粉末1.0 g，按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 后按2.2項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算峰1、異葒草苷、日當(dāng)藥黃素、峰4峰面積的RSD分別為0.40%、1.70%、4.26%、1.22%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知指標(biāo)成分含量的淡竹葉藥材，精密稱定，每組3份，按對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量分別為0.5∶1、1∶1、1.5∶1加入異葒草苷、日當(dāng)藥黃素對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2，回收率均為99.48%～105.22%，表明回收率良好。

表2 異葒草苷、日當(dāng)藥黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3 結(jié)果

3.1 不同提取方法對(duì)淡竹葉浸出物得率及特征圖譜的影響

3.1.1不同提取方法浸出物的HPLC圖譜比較 不同提取方式及不同提取溶劑下的浸出物色譜圖見圖2，4個(gè)特征峰基本一致，但各峰的峰面積存在較大的差異。

注：1.淡竹葉藥材；2.冷浸法-水；3.冷浸法-50%乙醇；4.冷浸法-75%乙醇；5.冷浸法-95%乙醇；6.熱浸法-水；7.熱浸法-50%乙醇；8.熱浸法-75%乙醇；9.熱浸法-95%乙醇。圖2 不同提取方法浸出物與淡竹葉藥材(S11)HPLC 圖譜比較

3.1.2不同提取方法浸出物的HPLC 圖譜相似度分析 以淡竹葉藥材特征圖譜作為對(duì)照?qǐng)D譜，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)分析各提取方法浸出物圖譜與藥材圖譜的相似度。

結(jié)果顯示，在水、95%乙醇提取下，浸出物圖譜與藥材圖譜之間的相似度為0.849～0.986，相對(duì)較低。而50%乙醇、75%乙醇提取下，其圖譜與藥材圖譜之間相似度在0.998以上，相似度較高，說明50%乙醇、75%乙醇適用于提取淡竹葉藥材中的有效成分。

3.1.3不同提取方法對(duì)浸出物中各評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響 取 S1樣品，按2.1和2.4項(xiàng)下所得的樣品，計(jì)算干燥品水溶性與醇溶性浸出物得率、異葒草苷含量、日當(dāng)藥黃素含量，計(jì)算特征圖譜4個(gè)特征峰的總峰面積，根據(jù)過濾速度依次評(píng)分為2、4、4、5，結(jié)果見表3。

表3的結(jié)果顯示，相同提取溶劑下，浸出物得率，浸出物中異葒草苷含量、日當(dāng)藥黃素含量，4個(gè)特征峰的總峰面積，熱浸法均高于冷浸法。相同的提取方式下，冷浸法浸出物得率順序?yàn)?0%乙醇>水>75%乙醇>95%乙醇。熱浸法浸出物得率順序?yàn)?0%乙醇>水>75%乙醇>95%乙醇；根據(jù)以上2個(gè)成分含量及總峰面積結(jié)果可知，50%乙醇和75%乙醇提取下，2種成分的含量和總峰面積比水和95%乙醇提取的高。

3.1.4提取方法的綜合評(píng)價(jià) 浸出物得率能反映藥材的提取程度，是評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量的手段之一。異葒草苷、日當(dāng)藥黃素均為淡竹葉中含量較高的黃酮類成分，異葒草苷具有較強(qiáng)的抑菌等作用，日當(dāng)藥黃素是一種強(qiáng)的抗氧化劑，具有改善血液循環(huán)等功能，2種成分的含量可以體現(xiàn)成分在藥材中的質(zhì)量水平[10-12]，特征圖譜可較全面反映藥材的質(zhì)量[5]。在實(shí)際操作過程中，不同提取方式及不同提取溶劑的過濾速度存在較大差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性造成影響。故以浸出物得率、2個(gè)成分含量、特征峰總峰面積及過濾速度作為浸出物提取方法優(yōu)化的關(guān)鍵因素，每個(gè)關(guān)鍵因素均設(shè)為100%，并按照浸出物得率大小、成分含量高低、總峰面積大小、過濾速度得分，依次計(jì)算實(shí)際占比。通過層次分析法將浸出物得率、異葒草苷含量、日當(dāng)藥黃素含量、總峰面積、過濾速度的權(quán)重比例設(shè)定為3、2、2、2、1，計(jì)算不同溶劑下淡竹葉浸出物提取方法的綜合分值，結(jié)果見表4。

冷浸法中水的浸出物得率占比=冷浸法中水的浸出物得率/(冷浸法浸出物得率之和+熱浸法浸出物得率之和)×100%

(1)

表3 淡竹葉不同提取方法浸出物中各指標(biāo)結(jié)果

表4 淡竹葉不同提取方法浸出物的綜合評(píng)分結(jié)果

加權(quán)評(píng)分=浸出物得率加權(quán)系數(shù)×占比

(2)

總得分=浸出物得率加權(quán)評(píng)分+異葒草苷含量加權(quán)評(píng)分+日當(dāng)藥黃色素含量加權(quán)評(píng)分+總峰面積加權(quán)評(píng)分+過濾速度加權(quán)評(píng)分

(3)

以上關(guān)鍵因素加權(quán)總得分結(jié)果顯示，熱浸法明顯優(yōu)于冷浸法，熱浸法50%乙醇提取下淡竹葉浸出物總得分最高，綜合評(píng)分為173.4，故確定淡竹葉浸出物的提取方法為熱浸法50%乙醇提取。

3.2 淡竹葉浸出物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

按照優(yōu)選的淡竹葉浸出物提取方法，對(duì)來源于主產(chǎn)區(qū)的12批淡竹葉藥材進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定 3次。結(jié)果見表5。

表5 12批淡竹葉浸出物得率

表5結(jié)果顯示，來自6個(gè)不同產(chǎn)地的淡竹葉其浸出物得率無(wú)較大差異。12批淡竹葉藥材浸出物得率的均值為(15.78±3.04)%，波動(dòng)范圍為10.40%～20.04%。取淡竹葉浸出物范圍為均值加減1倍標(biāo)準(zhǔn)差，即12.73%～18.82%，12批淡竹葉浸出物中有2批不在此范圍內(nèi)；取浸出物得率范圍為均值加減2倍標(biāo)準(zhǔn)差，即9.69%～21.87%，12批淡竹葉的浸出物均在此范圍內(nèi)；取浸出物得率范圍為均值加減3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即6.64%～24.91%，范圍較大?？紤]此12批藥材的代表性及藥材質(zhì)量的波動(dòng)性，為嚴(yán)格控制淡竹葉藥材的浸出物，結(jié)合12批淡竹葉浸出物的波動(dòng)范圍，最終確定淡竹葉浸出物得率為9.69%～21.87%。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用水和不同體積分?jǐn)?shù)乙醇為溶劑，通過冷浸、熱浸2種方式進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同的提取條件下，浸出物中各指標(biāo)結(jié)果均存在明顯差異。水提取的浸出物得率高，但指標(biāo)成分的含量及特征峰總峰面積均最低，且過濾速度極慢、不易操作。95%乙醇提取的浸出物得率最低，提取出的有效成分較少，不利于藥材質(zhì)量控制。相比于75%乙醇提取，50%乙醇提取所得的浸出物得率、日當(dāng)藥黃素的含量及特征峰總峰面積高，且過濾速度均較快，故確定最佳提取條件為熱浸法50%乙醇溶液提取。在此基礎(chǔ)上，本次實(shí)驗(yàn)共測(cè)定了12批淡竹葉藥材的浸出物得率，并根據(jù)12批淡竹葉浸出物得率制訂了淡竹葉藥材的浸出物范圍。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地藥材的浸出物得率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，淡竹葉藥材的浸出物得率為9.69%～21.87%。

中藥包含的成分復(fù)雜多樣，除了對(duì)其主要成分進(jìn)行含量測(cè)定外，還要通過指紋圖譜或特征圖譜等進(jìn)行多組分的研究分析，從而更能體現(xiàn)藥材質(zhì)量的整體性。通過浸出物得率并結(jié)合浸出物的指標(biāo)成分含量及特征圖譜進(jìn)行綜合分析，為淡竹葉浸出物的提取方法提供參考。