不同規(guī)格青皮飲片指紋圖譜△

陳芳，梁月儀，童培珍，王利偉，劉曉霞，孫冬梅，李國衛(wèi)

廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244

青皮始載于《珍珠囊》，其味苦、辛，性溫，具有疏肝破氣、消積化滯的功效，用于治療胸脅脹痛、疝氣疼痛、乳癖、乳癰、食積氣滯、脘腹脹痛等病癥[1]?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版規(guī)定，青皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco 及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮。其中收載了“個青皮”與“四花青皮”2種規(guī)格，5—6月收集自落的幼果，曬干，習(xí)稱“個青皮”；7—8月采收未成熟的果實，在果皮上縱剖成4瓣至基部，除盡瓤瓣，曬干，習(xí)稱“四花青皮”[2]。青皮的主要成分有揮發(fā)油類、黃酮類、生物堿類，其中黃酮類成分包括橙皮苷、橘皮素、川陳皮素等，是青皮的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[3-7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，青皮具有調(diào)節(jié)腸胃功能、去痰平喘、利膽、治療乳腺增生等作用[8-11]。

2種規(guī)格的青皮在功能主治和成分組成上略有不同。個青皮以破氣化滯為主，四花青皮以調(diào)肝理氣為主。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道[12]，個青皮與四花青皮在橙皮苷、辛弗林、N-甲基酪胺、揮發(fā)油的含量上均有差異，多種因素對不同生長發(fā)育階段活性成分的積累具有一定影響。本研究對比分析了2種規(guī)格青皮的指紋圖譜，為不同規(guī)格青皮的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Vanquish型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；ME204E型萬分之一分析天平、XP26型百萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS28型恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)。

1.2 試藥

對照品辛弗林(批號：110727-201608，純度：99.9%)、橙皮苷(批號：116721-201617，純度：96.1%)為中國食品藥品檢定研究院提供；對照品蕓香柚皮苷(批號：14259-46-2，純度≥98%)、川陳皮素(批號：150921，純度≥98%)、橘皮素(批號：151021，純度≥98%)為成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供；甲醇為分析純；乙腈、甲酸為色譜純；水為超純水。

11批四花青皮飲片和11批個青皮飲片經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco 及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮，存放于廣東一方制藥有限公司，見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈為流動相A，以0.1%甲酸水為流動相B，梯度洗脫(0～2 min，1%～8%A；2～5 min，8%～13%A；5～12 min，13%～19%A；12～13 min，19%～22%A；13～20 min，22%～35%A；20～21 min，35%～51%A；21～30 min，51%～54%A)；檢測波長：275 nm；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取蕓香柚皮苷、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素、辛弗林對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇制成各含蕓香柚皮苷84.7 μg·mL-1、橙皮苷78.5 μg·mL-1、橘皮素88.85 μg·mL-1、川陳皮素85.7 μg·mL-1、辛弗林85.3 μg·mL-1的混合對照品溶液。

表1 青皮飲片樣品信息

2.3 供試品溶液的制備

取本品細(xì)粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用10%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1專屬性試驗 取青皮飲片(S01)供試品溶液、對照品溶液、空白溶劑(10%甲醇)依次進(jìn)樣檢測，考察實驗方法的專屬性。結(jié)果表明，樣品中各個色譜峰不受空白溶劑的干擾，其中辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的保留時間與對照品色譜峰的保留時間一致，表明該方法具有良好的專屬性。見圖1。

注：A.混合對照品溶液；B.空白試劑；C.供試品溶液；1.辛弗林；3.蕓香柚皮苷；4.橙皮苷；6.川陳皮素；7.橘皮素；圖2～3同。圖1 個青皮飲片指紋圖譜專屬性考察UPLC圖

2.4.2精密度試驗 取同一青皮飲片供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以橙皮苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.04%～3.25%、0.48%～2.48%，表明分析方法精密度良好。

2.4.3重復(fù)性試驗 平行制備6份青皮飲片(S01)供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，以橙皮苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.02%～1.36%、0.53%～1.79%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗 取青皮飲片(S01)供試品溶液，分別于制備后0、2、6、11、15、18 h，按2.1項下色譜條件測定，以橙皮苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0.04%～2.75%、0.42%～2.95%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及分析

2.5.1共有模式及共有峰的確定 按2.3項下方法制備供試品溶液，根據(jù)已建立的特征圖譜方法對各批次供試品溶液進(jìn)行測定，通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012 版)，以平均數(shù)法得到青皮飲片指紋圖譜共有模式，匹配到7個穩(wěn)定的共有峰，且分離度較好，具有指紋圖譜特征性，可初步擬定為青皮飲片的指標(biāo)成分群。因此，確定這7個峰為青皮飲片的共有峰。在15.73 min處的為橙皮苷色譜峰，橙皮苷峰分布正態(tài)，達(dá)到基線分離，且峰面積較大，所以確定為參照峰。以4號峰橙皮苷峰為參照峰，不同規(guī)格青皮飲片各批的共有峰的相對保留時間、相對峰面積見表2～3，指紋圖譜的疊加圖見圖2～3。

2.5.2不同規(guī)格的青皮指紋圖譜相似度評價 采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)，以青皮飲片生成的共有模式作為參照圖譜，分別計算個青皮、四花青皮相似度，結(jié)果見表4。各批次個青皮的相似度為0.927～1.000、四花青皮的相似度為0.953～1.000，表明個青皮、四花青皮質(zhì)量穩(wěn)定，成分組成差異小。

表2 青皮飲片樣品 UPLC 指紋圖譜分析結(jié)果(相對保留時間)

表3 青皮飲片樣品 UPLC 指紋圖譜分析結(jié)果(相對峰面積)

圖2 個青皮飲片樣品UPLC指紋圖譜疊加

圖3 四花青皮飲片樣品UPLC指紋圖譜疊加

2.5.3不同規(guī)格青皮飲片各特征峰峰面積差異分析 運用SPSS 20.0軟件對不同規(guī)格青皮飲片各特征峰峰面積進(jìn)行獨立樣本檢驗，各特征峰峰面積見表5，檢驗結(jié)果見表6，顯示峰1、峰5、峰6、峰7峰面積差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明不同規(guī)格青皮飲片其成分的組成基本上是一致的，但是成分含量比例存在差異。

3 討論

本實驗的樣品分別采自浙江、湖南、湖北、江西4個產(chǎn)地，個青皮與四花青皮都具有7個特征峰，相似度均大于0.85，說明不同規(guī)格青皮飲片其成分的組成基本上是一致的。說明不同生長期的青皮，遺傳因子相同，生長期不同即環(huán)境因子、氣候因子、光照不同，其所含主要化學(xué)成分種類相近。藥用植物是中藥資源的主體，次生代謝產(chǎn)物為其主要活性成分，不同生長時期，其代謝主要活性成分含量比例不同。個青皮與四花青皮成分含量存在差異，與產(chǎn)地、生長時期、采收期、加工方法等因素有關(guān)，有待深入研究。

在有關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用二極管陣列檢測器(DAD)對青皮供試品溶液進(jìn)行紫外掃描(190～400 nm)，分別比較230、284、275、320 nm波長下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)275 nm波長下整體性峰形較好、吸收強、色譜峰數(shù)較多且各峰之間的分離度較好，能夠全面反映青皮的物質(zhì)基礎(chǔ)。故選者275 nm作為指紋圖譜最佳波長[13]。同時考察了不同流動相(乙腈-0.5%冰乙酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液、0.1%甲酸溶液)，選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相并對洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到較好的峰形及分離效果。同時對不同柱溫、不同色譜柱等色譜條件進(jìn)行篩選優(yōu)化，最終確定2.1項下色譜條件。此外，對樣品的提取溶媒、提取方式、提取時間和溶媒用量進(jìn)行考察，確定供試品溶液的制備方法。建立的方法簡單、高效，可用于青皮飲片的質(zhì)量評價。

表5 青皮飲片各特征峰峰面積

表6 不同規(guī)格青皮飲片各特征峰峰面積獨立樣本檢驗

本實驗采用UPLC建立青皮指紋圖譜，對共有峰進(jìn)行指認(rèn)，對不同規(guī)格青皮指紋圖譜特征峰進(jìn)行差異分析。采用對照品指認(rèn)了峰1為辛弗林，峰3為蕓香柚皮苷、峰4為橙皮苷、峰6為川陳皮素、峰7為橘皮素，峰3、4、6、7為黃酮類成分；采用獨立樣本檢驗，結(jié)果顯示，不同規(guī)格青皮飲片其峰1、5、7峰面積差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，個青皮中辛弗林、川陳皮素、橘皮素峰面積均高于四花青皮，表明不同規(guī)格的青皮在辛弗林、川陳皮素、橘皮素等成分的含量存在差異。文獻(xiàn)研究報道，從幼果期到成熟期，青皮中辛弗林的含量均呈現(xiàn)遞減的變化趨勢，總黃酮的含量隨果實成熟度的增加呈現(xiàn)降低的趨勢[12，14-15]。本研究結(jié)果顯示，個青皮中辛弗林高于四花青皮，與文獻(xiàn)報道一致。這些說明青皮的生長發(fā)育時期，物質(zhì)形成不是簡單的從少到多，而是隨著生長發(fā)育，有些成分減少，有些成分增加。這與其在植物體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化過程相關(guān)，多種因素對不同生長發(fā)育階段物質(zhì)成分的積累具有一定影響。個青皮、四花青皮有效物質(zhì)含量存在差異，與其臨床應(yīng)用有所側(cè)重相一致。因此，建議在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中個青皮、四花青皮可建立相同的含量測定指標(biāo)，但標(biāo)準(zhǔn)范圍應(yīng)當(dāng)不同，以期有針對性地控制不同規(guī)格青皮質(zhì)量。