劉水永恒,齊 迪,張 萌,王 浩
隨著環(huán)境污染的日益嚴重,癌癥已成為導(dǎo)致人類死亡的第二大疾病?;熓侵委煱┌Y的主要手段之一,然而腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性是臨床上亟待解決的難題之一[1,2]。阿霉素、五氟尿嘧啶、尼莫司汀和多西他賽等多種藥物的聯(lián)合化療和尋求低毒性的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑是提高癌癥治療效果的重要手段[3-6]。槲皮素廣泛分布于植物的花、葉和果實中,是一種天然的黃酮類化合物。許多研究表明,槲皮素不僅能顯著抑制多種腫瘤細胞的生長,而且是一種性能優(yōu)良的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑[7]。但由于槲皮素難溶于水、化學(xué)穩(wěn)定性差、生物利用度低[8],限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。
脂質(zhì)體、納米粒、納米混懸劑和納米乳等新型制劑能顯著提高槲皮素的生物利用度[9-11],更好發(fā)揮其在臨床上的抗腫瘤效果。層狀雙金屬氧化物具有較大的表面積和良好的化學(xué)穩(wěn)定性,是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦退幬锞忈屳d體[12-14]。通過調(diào)控層狀雙金屬氧化物的制備工藝和篩選適宜的載藥條件,可實現(xiàn)對靶向藥物的最大負載和有效緩釋。
該實驗利用松針水提液為綠色溶劑,采用化學(xué)沉淀法合成鐵鋯復(fù)合氧化物,以槲皮素為模型藥物,探討其對槲皮素的載藥能力和在模擬胃腸液下的緩釋效果。
1.1 試劑氯化鐵、氯氧化鋯、氫氧化鈉、十二烷基苯磺酸鈉、聚乙烯亞胺、無水乙醇、海藻酸鈉和槲皮素等分析純試劑均購自泰安某試劑公司。
1.2 鐵鋯氧化物微膠囊的制備
1.2.1 植物提取液的制備 將新鮮竹葉、松針、桑葉和女貞葉樣品置于60 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干至恒重。經(jīng)中草藥粉碎機粉碎后,過0.125 mm 的樣品篩,得到四種植物粉末。將8.0 g 植物粉末和100 ml蒸餾水加入到盛250 ml 蒸餾燒瓶中,于80 ℃下浸提2 h[15],過濾殘渣后,得到四種植物提取液。
1.2.2 鐵鋯氧化物的制備 將1.5 mmol 氯氧化鋯、2.5 mmol 氯化鐵和20 ml 蒸餾水或植物提取液加入到250 ml 燒杯中,置于50 ℃的磁力攪拌器上攪拌30 min 使其溶解完全。然后,在持續(xù)攪拌下逐滴滴加3.0 mol/L 的氨水,直至混合液的pH 值為8.0 時,停止滴加氨水,并繼續(xù)攪拌反應(yīng)120 min。最后,用離心機將沉淀物從混合液中分離,于105 ℃恒溫干燥箱中將沉淀烘干至恒重,得到蒸餾水為溶劑的鐵鋯氧化物(DFZ)、竹葉提取液為溶劑的鐵鋯氧化物(BFZ)、松針提取液為溶劑的鐵鋯氧化物(PFZ)、桑葉提取液為溶劑的鐵鋯氧化物(MFZ)、女貞葉提取液為溶劑的鐵鋯氧化物(GFZ)。
1.2.3 鐵鋯氧化物微膠囊的制備 分別將1.5 g 五種鐵鋯氧化物和50 ml 質(zhì)量分數(shù)為1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)水溶液加入到100 ml 燒杯中,置于超聲波清洗器中超聲30 min。然后,向溶液中添加50 ml 質(zhì)量分數(shù)為1%的聚乙烯亞胺(PEI)水溶液,并超聲30 min,使其吸附第一層聚乙烯亞胺膜。將混合液置于4800 r/min 離心機中離心15 min,并用去離子水多次洗滌除去十二烷基硫酸鈉和聚乙烯亞胺,從而得到吸附第一層聚乙烯亞胺膜的納米微囊。最后,分別用100 ml 濃度為1 mg/ml 海藻酸鈉和100 ml 濃度為1 mg/ml 聚乙烯亞胺交替沉積在納米微囊上,使振蕩沉積過程持續(xù)20 min,并且在每次沉積后用去離子水洗滌3 次,得到五種鐵鋯氧化物微膠囊。
1.3 槲皮素的載藥能力測定
1.3.1 五種材料載藥率的對比 將5 mg 蒸餾水和不同提取液制備的鐵鋯氧化物微膠囊 (代號為:DFZ、BFZ、PFZ、MFZ、GFZ) 分別加入到盛有50 ml濃度為60 mg/L 槲皮素溶液的錐形瓶中,室溫下置于恒溫振蕩器上,于120 r/min 下震蕩24 h 后,將混合液抽濾,用紫外可見分光光度計測定濾液在373 nm 處的吸光度,代入標準曲線后,利用公式(1)計算每種材料對槲皮素的載藥率。
式中,R 是鐵鋯氧化物微膠囊對槲皮素的載藥率,%;C0為載藥前槲皮素的濃度,mg/L;C 為載藥后槲皮素的濃度,mg/L。
1.3.2 藥物初始濃度對載藥能力的影響 準確稱取5 份5 mg 鐵鋯氧化物微膠囊分別置于不同的100 ml 錐形瓶中,依次向錐形瓶中加入50 ml 濃度為20、40、60、80 和100 mg/L 的槲皮素溶液,經(jīng)恒溫振蕩器振蕩24 h 后,將混合液過濾,用紫外可見分光光度計測定濾液在373 nm 處的吸光度,代入標準曲線后,利用公式(1)和(2)計算槲皮素的載藥率和載藥量。
式中,Q 為載藥量,mg/g;C0為載藥前槲皮素的濃度,mg/L;C 為載藥后槲皮素的濃度,mg/L;V 是溶液的體積,L;M 為藥物緩釋載體的質(zhì)量,g。
1.3.3 反應(yīng)時間對載藥能力的影響 準確稱取9份5 mg 鐵鋯氧化物微膠囊分別置于不同的100 ml錐形瓶中,依次向錐形瓶中加入50 ml 濃度為60 mg/L 的槲皮素溶液,經(jīng)恒溫振蕩器分別震蕩5、10、15、30、60、90、120、180 和240 min 后取出,過濾后,用紫外可見分光光度計測定濾液在373 nm 處吸光度,代入標準曲線后,利用公式(1)計算槲皮素的載藥率。
1.4 槲皮素的緩釋實驗配制3 種不同pH(pH 分別為4.2、5.5 和7.2)的緩沖溶液中進行槲皮素的體外緩釋實驗:pH 為4.2 和5.5 的緩沖溶液是用枸櫞酸-枸櫞酸鈉配制的,pH 為7.2 的緩沖溶液是用磷酸氫二鈉-氫氧化鈉配制成的。具體操作步驟如下:將5 mg 負載后60 mg/L 槲皮素的鐵鋯氧化物微膠囊加到裝有5 ml 緩沖溶液的透析袋中,再將透析袋放入到裝有10 ml 緩沖溶液的離心管中,在37 ℃條件下振蕩。分別在0.5、1、2、3、5、8 和10 h 的時刻從離心管中取1.5 ml 溶液,再補加1.5 ml 空白緩沖溶液到離心管中,保持總體積不變。用紫外分光光度計測定每一時刻所取出的溶液在373 nm 處吸光度,然后計算釋放出的槲皮素的釋放率RA。
2.1 五種材料載藥率的對比由圖1 可知,在給定的實驗條件下,四種植物提取液制備的鐵鋯氧化物微膠囊對槲皮素的載藥率分別為PFZ (51.2%)>MFZ(46.8%)>BFZ(44.7%)>GFZ(43.2%),均高于蒸餾水制備的鐵鋯氧化物微膠囊對槲皮素的載藥率30.0%。這是由于植物提取液含有還原糖、多酚、類黃酮和蛋白質(zhì)等有效成分[16],可作為綠色溶劑合成特殊形貌的雙金屬氧化物,提高對目標藥物的載藥效果。
圖1 五種材料對槲皮素的載藥率
目前,許多學(xué)者嘗試利用多種材料和劑型來提高對槲皮素的載藥效果,如夏曉靜等[17]合成的N-(4-咪唑甲基)-羥乙基殼聚糖對槲皮素的載藥率為5.42%、典靈輝等[18]以泊洛沙姆407、聚乙二醇維生素E 琥珀酸酯和聚乙二醇硬脂酸酯為材料制備的納米粒對槲皮素的載藥率為2.87%、趙文琦等[19]制備的納米脂質(zhì)體對槲皮素的載藥率為6.40%、徐浩等[20]以聚乙二醇1000 維生素E 琥珀酸酯為穩(wěn)定劑制備的納米混懸劑對槲皮素的載藥率為45.82%。該實驗制備的四種鐵鋯氧化物微膠囊對槲皮素的載藥率均優(yōu)于脂質(zhì)體和納米粒等傳統(tǒng)藥物載體,且松針提取液制備的鐵鋯氧化物微膠囊對槲皮素的載藥率略優(yōu)于納米混懸劑劑型對槲皮素的載藥率。
2.2 藥物初始濃度對載藥率和載藥量的影響由圖2a 和圖2b 可知,隨著槲皮素溶液的濃度從20 mg/L 增加到140 mg/L,蒸餾水制備的鐵鋯氧化物微膠囊(DFZ)對槲皮素的載藥量從100.7 mg/g 逐漸增加到335.5 mg/g,載藥率從50.3%逐漸下降到24.1%。松針提取液制備的鐵鋯氧化物微膠囊(PFZ)對槲皮素的載藥量從136.2 mg/g 逐漸增加到399.1 mg/g,載藥率卻從68.0%逐漸下降到28.5%。這是由于當鐵鋯氧化物微膠囊的質(zhì)量保持不變時,隨著溶液中槲皮素濃度的增大,微膠囊結(jié)合的槲皮素分子越來越多,并逐漸趨于穩(wěn)定。然而,膠囊結(jié)合的槲皮素分子增加幅度小于溶液中槲皮素濃度的增加幅度,故載藥率逐漸下降。綜合考慮載藥量和載藥率,選擇槲皮素的濃度為60 mg/L 較為適宜,此時蒸餾水制備的鐵鋯氧化物微膠囊(DFZ)和松針提取液制備的鐵鋯氧化物微膠囊(PFZ)的載藥率分別為30.0%和51.2%,載藥量分別為180.1 mg/g 和307.2 mg/g。
圖2 見封三。
表2 藥物初始濃度對鐵鋯氧化物微膠囊載藥率和載藥量的影響
2.3 反應(yīng)時間對載藥率的影響由圖3 可知,鐵鋯氧化物微膠囊對槲皮素的負載呈現(xiàn)一個先快后慢、最后趨于穩(wěn)定的發(fā)展過程。在初始15 min 內(nèi),蒸餾水制備的鐵鋯氧化物微膠囊(DFZ)和松針提取液制備的鐵鋯氧化物微膠囊(PFZ)對槲皮素的載藥率分別增加到20.2%和35.0%。當反應(yīng)時間從15 min增加到180 min 時,蒸餾水制備的鐵鋯氧化物微膠囊(DFZ) 和松針提取液制備的鐵鋯氧化物微膠囊(PFZ) 對槲皮素的載藥率分別從20.2%和35.0%緩慢增加到30.8%和51.6%。當反應(yīng)時間繼續(xù)延長到240 min 時,兩種鐵鋯氧化物微膠囊對槲皮素的載藥率基本趨于穩(wěn)定。為保證槲皮素的較高負載率,后續(xù)實驗的反應(yīng)時間應(yīng)選擇240 min 較好。
圖3 反應(yīng)時間對載藥率的影響
2.4 槲皮素的緩釋實驗圖4 是負載槲皮素的鐵鋯氧化物微膠囊 (PFZ) 分別在pH4.2、pH5.5 和pH7.2 下的最大釋放率與反應(yīng)時間的變化曲線。由圖3 可知,在初始0.5 h 內(nèi),載藥微膠囊在pH4.2、pH5.5、pH7.2 的藥物釋放率分別達到39%、36%、31%。隨著反應(yīng)時間由0.5h 增加到3 h 時,載藥微膠囊在pH4.2、pH5.5、pH7.2 下的藥物釋放率分別增加到85%、79%和72%。繼續(xù)延長反應(yīng)時間至10 h,載藥微膠囊在pH4.2、pH5.5、pH7.2 下的藥物釋放率基本趨于穩(wěn)定,分別達到最大值89%、84%和79%。
圖4 槲皮素的緩釋實驗
采用松針水提液為綠色溶液合成一種新型藥物緩釋載體-鐵鋯氧化物微膠囊,該材料的最佳載藥條件為: 當槲皮素濃度為60 mg/L,反應(yīng)時間為240 min 時,5 mg 微膠囊對槲皮素的最大載藥率為51.2%。鐵鋯氧化物微膠囊在pH4.2、pH5.5、pH7.2中10 h 的最大藥物釋放率分別為89%、84%和79%。