α-輔肌動(dòng)蛋白4 和鈉氫交換子調(diào)節(jié)因子1 在微電場(chǎng)刺激人宮頸癌Hela 細(xì)胞遷移中的作用機(jī)制＊

陳瑾歆，王含彥，唐 珍，張 燕

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其預(yù)后與有無(wú)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，如伴有轉(zhuǎn)移，即使是早期預(yù)后也相對(duì)較差［1］，因此研究宮頸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)該病的治療及預(yù)后評(píng)估有重要意義。

內(nèi)源性生物電場(chǎng)（direct current electric fields，DCEF）在機(jī)體許多生理及病理過(guò)程如細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生、血管新生和組織再生等中都具有重要作用［2］。有研究［3］顯示，細(xì)胞在生理強(qiáng)度的外加電場(chǎng)中會(huì)出現(xiàn)生物學(xué)行為改變?nèi)缍ㄏ蚺帕小⒍ㄏ蜻w移等，這在創(chuàng)傷愈合、腫瘤侵蝕等病理過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用［4］。目前微電場(chǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞侵蝕轉(zhuǎn)移的影響已成為人們對(duì)電場(chǎng)生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)注焦點(diǎn)［5］，細(xì)胞對(duì)電信號(hào)反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。筆者采用宮頸癌Hela 細(xì)胞，通過(guò)RNA 干擾鈉氫交換子調(diào)節(jié)因子1（NHERF1）mRNA 的表達(dá)，研究微電場(chǎng)中NHERF1是否經(jīng)過(guò)α-輔肌動(dòng)蛋白（α-actinin 4）影響Hela 細(xì)胞的遷移能力，為進(jìn)一步研究宮頸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和試驗(yàn)分組人宮頸癌Hela 細(xì)胞從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所購(gòu)進(jìn)；TRIZOL（Invitrigon）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）；SYBR Green PCR Kit （QIAGEN）；RPMI1640 培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（BI）。

試驗(yàn)分為陰性對(duì)照組（control）、加電組（EF）、NHERF1 基因沉默組 （siRNA）、基因沉默加電組（siRNA+EF）。

1.2 培養(yǎng)細(xì)胞的電場(chǎng)干預(yù)細(xì)胞加電培養(yǎng)小室的組裝和細(xì)胞加電的步驟見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道［6］。加電組加電條件：150 mV/mm 微電場(chǎng)刺激8 h。

1.3 基因沉默

1.3.1 siRNA 序列合成 NHERF1 的siRNA 序列由上海權(quán)陽(yáng)生物公司設(shè)計(jì)合成，相關(guān)序列如下：NHERF1 siRNA-1：sense GAAGGAGAACAGUCGU GAATT，antisense UUCACGACUGUUCUCCUUCTT；NHERF1 siRNA-2：sense CGAGGAGCUGAAUUCC CAATT，antisense UUGGGAAUUCAGCUCCUCGTT；NHERF1 siRNA-3 sense GGUGGAGGUGAACGGC GAATT，antisense UGCGCCGUUCACCUCCACCTT；陰性對(duì)照siRNA：sense UUCUCCGAACGUGUCACG UTT，antisense ACGUGACACGUUCGGAGAATT。

1.3.2 siRNA 轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，種植在加電小室中，常規(guī)培養(yǎng)至60%～70%的融合狀態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照LipofectamineTM 2000 說(shuō)明書(shū)的轉(zhuǎn)染條件和方法用siRNA 1、2 和3 及陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染hela 細(xì)胞，5%的CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～6 h 后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.3.3 RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞基因沉默效果 用TRIZOL 提取總RNA，NanoDrop 2000 微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 含量與純度，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA 完整性進(jìn)行鑒定。用約1.5 μg 總RNA 為模板，采用試劑盒（Takara）提供的方法去除基因組DNA 污染，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板在實(shí)時(shí)定量檢測(cè)擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)細(xì)胞NHERF1 基因沉默效果，選取最有效的一組siRNA 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。用于qPCR 反應(yīng)的特異引物序列：NHERF1-F CAGAAGGAGAACAGTCGTGAA GCC，NHERF1-R TGGTGTCACTGGAGGCGGATC；GAPDH-F ATTGACCTCAACTACATGGTTTACATG，GAPDH-R TTGGAGGGATCTCGCTCCTGGAAG。

1.4 RT-qPCR 檢測(cè)各組細(xì)胞NHERF1 和α actinin 4mRNA 的表達(dá)細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合，種植細(xì)胞于加電小室中，常規(guī)培養(yǎng)至60%～70%的融合狀態(tài)，按試驗(yàn)分組加入siRNA 轉(zhuǎn)染，設(shè)置對(duì)照，4～6 h 后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，80%～90%的融合時(shí)EF組、siRNA+EF組150 mV/mm 加電8 h，設(shè)置不加電的對(duì)照。將control、EF組、siRNA組、siRNA+EF組細(xì)胞按照步驟1.3.3 提取鑒定總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板在實(shí)時(shí)定量檢測(cè)擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增各組細(xì)胞NHERF1 和α-actinin 4。用 于qPCR 反應(yīng)的特異引物序列：NHERF1、GAPDH 的引物見(jiàn)步 驟 1.3.3；α -actinin 4 -F ATCTGTAAGGTGCTGGCTGTCAAC，α-actinin 4-R GCTTCTGCTGCATCTCCTGGATAG。反應(yīng)體系為20 μl：SYBY qPCR mix 10.0 μl，特異上下游引物（10 pmol/μl）各0.8 μl，cDNA 模板2.0 μl，去離子水補(bǔ)足20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃變性2 min；95 ℃30 s，60 ℃1 min 擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)60 ℃延伸時(shí)檢測(cè)熒光，循環(huán)完成后做融解曲線，NHERF1、αactinin 和GAPDH 的反應(yīng)體系和條件相同。定量分析根據(jù)待測(cè)cDNA 中目的基因和GAPDH 的Ct 值，用2△△Ct法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 劃痕試驗(yàn)細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合，種植細(xì)胞于加電小室中，常規(guī)培養(yǎng)至60%～70%的融合狀態(tài)，按試驗(yàn)分組加入siRNA 轉(zhuǎn)染，設(shè)置對(duì)照，4～6 h 后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，90%的融合時(shí)用10 μl Eppendorf Tip 在加電小室底部劃痕，劃痕后用PBS 洗3 次，加入2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，EF組、siRNA+EF組150 mV/mm 加電8 h，設(shè)置不加電的對(duì)照，在0 h、8 h 拍照，進(jìn)行組間比較。使用Image J 軟件測(cè)量各組細(xì)胞的劃痕寬度，計(jì)算劃痕細(xì)胞遷移率，劃痕細(xì)胞遷移率%=（0 h 寬度-8 h 寬度）/0 h 寬度×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，所有數(shù)據(jù)均采用（）表示，采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用t 檢驗(yàn)和方差分析，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞基因沉默效果與對(duì)照組比較，siRNA -1、siRNA -2、siRNA -3組細(xì)胞NHERF1 mRNA 表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），提示基因沉默效果可靠，其中NHERF1 siRNA-1 效果最好，用作后續(xù)試驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 RT-qPCR 檢測(cè)Hela 細(xì)胞基因沉默效果

2.2 RT-qPCR 檢測(cè)各組細(xì)胞NHERF1 和αactinin 4mRNA 的表達(dá)

2.2.1 NHERF1 mRNA 的表達(dá) 與對(duì)照組比較，EF組NHERF1 mRNA 的表達(dá)明顯增加 （P＜0.05）；siRNA組和siRNA+EF組NHERF1 mRNA 的表達(dá)均明顯降低 （P ＜0.01）。siRNA+EF組NHERF1 mRNA 的表達(dá)比siRNA組稍有增加。見(jiàn)圖2。

圖2 RT-qPCR 檢測(cè)Hela 細(xì)胞NHERF1 mRNA 的表達(dá)

2.2.2 α-actinin 4mRNA 的表達(dá) 與對(duì)照組比較，EF組α-actinin 4 mRNA 的表達(dá)明顯減少 （P＜0.05）；siRNA組α-actinin 4 mRNA 的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；siRNA+EF組α-actinin 4 mRNA 的表達(dá)稍增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

2.3 劃痕試驗(yàn)與對(duì)照組比較，EF組劃痕細(xì)胞遷移率明顯增加（P＜0.01）；siRNA組劃痕細(xì)胞遷移率明顯降低 （P＜0.01）；siRNA+EF組劃痕細(xì)胞遷移率有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4、圖5。

圖3 RT-qPCR 檢測(cè)Hela 細(xì)胞α-actinin 4 mRNA 的表達(dá)

圖4 各組Hela 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

圖5 各組Hela 細(xì)胞劃痕遷移率

3 討論

宮頸癌的轉(zhuǎn)移途徑主要為直接浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移，腫瘤的轉(zhuǎn)移必然牽涉到細(xì)胞的遷移。α-輔肌動(dòng)蛋白（α-actinin）有1、2、3、4 四種類型，主要形成細(xì)胞骨架中的肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白，還可與信號(hào)傳導(dǎo)通路中的信號(hào)分子協(xié)同作用，在穩(wěn)定細(xì)胞黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著重要作用［7］。有研究發(fā)現(xiàn)［8，9］，α-actinin-4 突變可影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移；腫瘤細(xì)胞中α-actinin 表達(dá)下調(diào)；α-actinin-1 高表達(dá)可以降低細(xì)胞的遷移，抑制其表達(dá)則能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，提示α-actinin 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

鈉氫交換子調(diào)節(jié)因子1（NHERF1）是一種重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控蛋白，可與多種蛋白質(zhì)如膜受體、細(xì)胞激酶等結(jié)合調(diào)控第二信使級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程［10］。有研究［11，12］發(fā)現(xiàn)，NHERF1 可通過(guò)其ERM 結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)域間接結(jié)合細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和運(yùn)動(dòng)，下調(diào)α-actinin-4 表達(dá)，影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架解體，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等方面起作用。

筆者發(fā)現(xiàn)，在Hela 細(xì)胞中，EF 刺激可增加細(xì)胞NHERF1 的表達(dá)，抑制α-actinin-4 的表達(dá)，細(xì)胞遷移增加；用RNA 干擾NHERF1 mRNA 的表達(dá)，可明顯上調(diào)細(xì)胞α-actinin-4 的表達(dá)，抑制細(xì)胞的遷移。由此推測(cè)，在微電場(chǎng)的作用下NHERF1 可能與α-actinin-4 相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)，抑制了NHERF1 表達(dá)的Hela 細(xì)胞，在EF 作用下α-actinin-4 的表達(dá)及細(xì)胞遷移率均有所增加，這提示EF 對(duì)細(xì)胞遷移的影響存在其他次要調(diào)節(jié)元素，可能與其他信號(hào)通路的激活有關(guān)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

微電場(chǎng)刺激Hela 細(xì)胞NHERF1 表達(dá)增加，抑制α-actinin-4 表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞遷移；NHERF1 基因沉默的Hela 細(xì)胞，α-actinin-4 的表達(dá)明顯增加，細(xì)胞遷移受到抑制。