苧麻纖維發(fā)育相關的3個miRNA鑒定與表達分析

馬永紅，朱四元，嚴理，劉頭明

（中國農業(yè)科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

小RNA（miRNA）是一段長22 bp左右、具有頸環(huán)結構的小分子非編碼RNA，其在生物體內含量較rRNA、tRNA、mRNA等主要RNA要低得多。miRNA雖然不編碼蛋白，但具有轉錄因子的作用，通過多種酶的剪切加工作用形成成熟的miRNA沉默復合體后，通過堿基互補配對靶向沉默mRNA，抑制靶基因的翻譯或靶向降解靶基因，進而調控植物的生長發(fā)育［1-7］、逆境脅迫［8-9］等多種生物過程。例如miR319調控靶基因TCP4在擬南芥中的表達，miR319表達下調會使TCP表達量上升，促進了次生壁細胞的合成，篩管增厚［10］。在番茄中，miR319的過表達下調了幾個TCPs基因，導致小葉變大，葉片邊緣持續(xù)生長，而miR319表達水平的降低或TCP表達水平的提高會使番茄葉片變小。在柑橘中，miR397通過調控LAC基因調節(jié)細胞壁多糖的二次沉積，調控細胞壁的形成［11］。對于miRNA的研究引起生物學界廣泛關注。

苧麻（BoehmerianiveaL.Gaud）是一種多年生草本植物，具有宿根性，纖維含量豐富，早期通過抽取纖維制作麻繩等，是中國主要的紡織纖維作物，具有悠久的種植歷史。苧麻作為重要的天然纖維作物，其產量決定因素在于韌皮部，韌皮纖維次生壁的生物合成決定纖維產量。纖維素合成酶是植物纖維合成的關鍵酶，基于轉錄組序列，Liu等［12］發(fā)現(xiàn)苧麻中36個可能與韌皮纖維發(fā)育相關的纖維素合成酶基因。miRNA也可能參與了苧麻的韌皮纖維發(fā)育調控。Wang等［13］構建了苧麻纖維伸長、胞壁增厚和端壁溶解階段miRNA表達譜，并在纖維伸長增厚和端壁溶解階段識別到298個miRNA，推測他們可能與苧麻的纖維發(fā)育相關。在擬南芥、水稻、柑橘等中也有關于miRNA調控纖維發(fā)育功能的報道，如在擬南芥中，miR397b通過調控其靶基因AtLAC4的表達進而影響木質素的含量，miR397b過表達株系木質素含量降低，次生壁厚度變?。?4］。在陸地棉中，調控纖維發(fā)育的GhLAC4基因與miR397b的堿基互補區(qū)域發(fā)生了mRNA的切割，也說明了miRNA對棉花纖維發(fā)育的調控作用［15］。研究表明，具有較高同源性的基因在不同植物體中可能具有不同的生物學功能，例如mir397a在番茄中主要參與非生物脅迫過程［16］，而在梨果肉中主要調控石細胞的發(fā)育形成［17］。在苧麻中關于纖維發(fā)育的miRNA研究較少，所以本研究擬針對苧麻莖皮進行miRNA測序，并進行表達分析，以研究和發(fā)現(xiàn)苧麻中可能與纖維發(fā)育相關的miRNA，旨在為闡明miRNA在苧麻纖維發(fā)育中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料處理

苧麻材料為中苧1號，取自中國農業(yè)科學院麻類研究所試驗基地，所取材料均經過清水沖洗，取葉（中部葉）、5芽（頂端芽）、頂皮（頂端韌皮部）、中皮（中間韌皮部）、莖（中間木質部）、根（根尖）6個部位迅速轉入液氮后移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止RNA降解。

1.2 RNA提取及RNA純度、產率和完整性檢測

將0.5 g苧麻組織在液氮中迅速研磨至粉末狀，按照植物RNA提取試劑盒說明書（Takara）的要求提取RNA，-80℃保存。苧麻根部含有大量多糖多酚類物質，在研磨樣品后按說明書提取方法二（去除多糖多酚法）進行操作。

取1μL RNA樣品，用微量分光光度計（NANO 100，中國）測其A260/A280和A260/A230的比值和RNA濃度。取所得的RNA約2μL，加2μL無RNAase的水和1μL 6×loading buffer后制備1.0%的瓊脂凝膠，在1×TBE緩沖液中電泳檢測總RNA的完整性。

1.3 反轉錄及qRT-PCR體系的建立

分別取苧麻6個部位RNA 1μg，按照cDNA合成試劑盒（TransgenAT311）上的說明書操作進行反轉錄。反應體系為 20μL，反應條件：30°C 10min，42°C 20min，95°C 5min，反轉錄完成后再加無菌水稀釋5倍至100μL。反轉錄后的cDNA置于-80℃冰箱保存。

1.4 miRNA測序以及內參基因的選擇

對中苧1號苧麻中韌皮部進行miRNA的提取、文庫構建和高通量測序，對miRNA測得的原始數(shù)據(jù)需進行質量控制，得到高質量序列，為了識別miRNA，將miRNA序列中的優(yōu)質數(shù)據(jù)分別采用AASRA［18］和 CMsearch軟件［19］與 miRbase［20］和 Rfam［21］數(shù)據(jù)庫進行比對。通過使用 PIPmiR［22］和默認參數(shù)，未匹配到這兩個數(shù)據(jù)庫的序列被認為是新的miRNAs。與已知miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase（v21）中的成熟miRNA序列進行比對，完全相同的序列被認為是已知miRNA。

所選內參基因要具有穩(wěn)定表達的特性，且與要定量的基因表達量相近，為了獲得可靠的qPCR結果，必須為每個研究物種和需要定量的基因選擇合適的內參基因［23］。內參基因的穩(wěn)定性取決于樣本和條件，因為苧麻沒有完善的qPCR內參設定體系，因此從常用作內參的管家基因中選擇18s、ACT、TUB、UBQ4個基因。設計引物，凝膠電泳檢測引物設計是否合適，然后進行qPCR檢測。

在NCBI中查找測序鑒定到的候選基因的保守序列，用Primer 5.0軟件設計引物（表1）。引物的退火溫度為53～57°C，引物長度為18～21 bp，擴增產物長度為150～250 bp。引物序列由擎科生物有限公司合成，實時定量PCR使用的引物見下表1。

表1 qRT-PCR檢測中基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes in qRT-PCR analysis

1.5 纖維發(fā)育相關miRNA的靶基因測定

miRNA為具有負調控作用的轉錄因子，其所調控的靶基因才可能具有實際調控纖維發(fā)育的作用，為了進一步闡明miRNA調控纖維發(fā)育的生物學機制，取苧麻韌皮部轉錄本進行測序，構建RNA文庫并進行高通量測序，根據(jù)miRNA與靶基因堿基互補配對高度的保守性進行具有差異表達的miRNA的靶基因預測。常用的靶基因預測軟件有TAPIR［24］和TargetFinder［25］，參數(shù)設置為默認參數(shù)。

1.6 實時熒光定量

PCR試劑采用Transgen公司的熒光定量PCR試劑盒，采用SYBRGreen熒光染料法在CFX96實時熒光定量PCR儀上進行定量。按照說明書進行操作，選取管家基因18s為內參基因。PCR體系按照TB GreenPremix酶（Transgen公司）說明書的要求設置，對6個部位進行3次生物學重復，體系為20μL，擴增程序95℃預變性3 min，40個循環(huán)的程序為95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，CFX96分析軟件制作擴增曲線。用BestKeeper軟件分析內參基因表達的穩(wěn)定性。相對表達量的計算以18s為內參基因，計算Ct值（Ct代表目標擴增產物達到設定閾值所經歷的循環(huán)數(shù)），參照魏敏［26］計算方法，得到RQ值（表達量變化倍數(shù)）。即通過計算 ΔCt（ΔCt=Ct目的基因-Ct內參），獲得 ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組），再計算RQ值（RQ=2-ΔΔCt），取3次生物學重復的平均值作為該基因在該處理組的表達量，并計算RQ的誤差。

2 結果與分析

2.1 苧麻中的miRNA測序

通過對苧麻韌皮部miRNA的測序，在苧麻韌皮部共計378個miRNA中，將測序序列進行注釋，共鑒定出176個已知miRNA和202個新miRNA，為了研究miRNA在苧麻不同部位是否具有表達差異，選定了3個在模式生物中同源且與纖維發(fā)育相關的常見miRNA進行了實時定量PCR檢驗，分別為miR828、miR166和miR156。

2.2 纖維發(fā)育相關miRNA的靶基因預測

通過與擬南芥同源序列對比發(fā)現(xiàn)有許多和擬南芥一致的靶標，如HDZIP基因、MYB基因、NAC基因等，被miRNA（分別為miR166、miR828、miR156）靶向調控，具體見表2。而擬南芥中的HDZIP基因、MYB基因、NAC基因具有調控纖維發(fā)育的功能，由于miRNA具有反向調控靶基因表達的作用，通過抑制靶基因的表達調控植物生長發(fā)育。在擬南芥纖維發(fā)育過程中，莖頂端miRNA基因的表達量高，從而抑制靶基因的程度也高，在莖中部，miRNA基因表達量降低，使靶基因表達量上升，從而引起次生壁細胞發(fā)生增厚或增多，莖稈增粗，纖維量增加［27］。推測在苧麻中miRNA表達也具有這種規(guī)律性。

表2 miRNA靶基因功能注釋Table 2 Functional annotation ofmiRNA target genes

2.3 苧麻內參基因的分析

對4對候選內參基因18s、ACT、TUB和UBQ進行測試，Ct值在6～37，表達豐度分布范圍較廣（圖1）。由此可初步判斷，18s和ACT表達較為穩(wěn)定，TUB和UBQ表達差異較大。通過比較兩個基因的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）和平均標準偏差（standard deviation，SD）來確定基因的穩(wěn)定性［28］。一般穩(wěn)定的內參基因具有較低的SD值和CV值。而SD的臨界值為1.5，若SD＞1.5，則表明穩(wěn)定性較差［29］。但是在對目標基因進行校準時，不僅要求所用內參基因的表達水平穩(wěn)定，而且要求其穩(wěn)定的表達，與目標基因的表達量相近，表達量過高或過低，都可能導致定量結果出現(xiàn)明顯偏差［30］。由表3可知，18s在不同部位中表達量較為穩(wěn)定，為了保證試驗的準確性，選定18s作為標準內參，取相對變量。

圖1 苧麻內參基因的Ct值分布Fig.1 Distribution of Ct values of reference genes in ramie

表3 4個候選內參基因在苧麻不同部位的表達穩(wěn)定性Table 3 The expression stability of 4 candidate internal reference genes in different tissues of ramie

2.4 miRNA中miR156、miR166和miR828的表達分析

對miR156、miR166和miR828進行定量分析，得到溶解度曲線見圖2，采用表達量變化倍數(shù)（RQ值）對3個mirRNA基因在中苧1號不同部位的表達情況進行分析。以中苧1號根的表達量作為對照，設定表達量為1。由圖3可知，miR828、miR166和miR156在頂皮和芽中表達量較高，miR828在芽中表達量最高，miR166其次，miR156最低。miR828、miR166和miR156在頂端韌皮部中表達量高，miR828表達量最高，miR156其次，miR166最低。miR828、miR166和miR156在苧麻的葉、莖和根中表達量均較低。

圖2 苧麻中miR828、miR166和miR156擴增曲線Fig.2 Amplification curves of miR828，miR166 and miR156 in ramie

圖3 候選基因在中苧1號不同部位的相對表達量Fig.3 The relative expression levels of candidate genes at different sites of Zhonghu No.1

2.5 纖維發(fā)育相關miRNA鑒定

將miRNA在頂皮和中皮兩個部位進行定量表達見圖4，由圖4可以看出，3個miRNA在頂皮中的表達量要顯著高于中皮，也進一步證明其與苧麻纖維發(fā)育相關。

圖4 miRNA在頂皮和中皮的表達差異Fig.4 Expression differences of miRNA in the apical and mesothelial

苧麻頂端韌皮部與中間韌皮部中的纖維發(fā)育差異明顯，中皮纖維處于生長期，次生壁處于正在加厚或增厚結束時期，而頂皮纖維處于剛開始生長期，纖維發(fā)育相關基因的表達必定活躍。

3 結論與討論

本研究在苧麻中共檢測到378個miRNA，其中包括176個已知miRNA和202個新miRNA。Wang等［31］對苧麻纖維發(fā)育莖皮中miRNA的表達譜進行了表征，得到51個具有差異表達的miRNA?？梢?，本研究中識別的miRNA數(shù)量上更加全面和豐富。在所選的4個管家基因中，18s在苧麻各個部位都能夠穩(wěn)定表達，建議在苧麻研究中作為內參基因。在測定的378個miRNA中選取的3個miRNA經實時定量PCR鑒定，在韌皮部頂端和中部具有差異表達。而頂端韌皮和中部韌皮主要存在纖維發(fā)育方面的差距。在模式植物擬南芥中miRNA具有調控纖維發(fā)育的作用，如miR319可以通過靶向調控TCP4轉錄因子激活次生壁的生物合成。miR319過表達導致莖中TCP4豐度降低和次生壁的形成，表明miR319介導TCP4發(fā)育過程中次生細胞的生物合成［32］。據(jù)此，推測苧麻中miRNA具有調控纖維發(fā)育的作用。

在擬南芥的纖維組織中，Yang等［33］發(fā)現(xiàn)MYB26過表達會引起木質素的異位沉積，導致表皮纖維組織次生增厚。并發(fā)現(xiàn)在兩個NAC結構域基因NAC次生壁促因子1（NST1）和NST2的表達也發(fā)生了變化，這兩個基因與花藥內膜的次生增厚有關。NAC基因作為MYB26基因的上游基因，共同調控了纖維組織次生壁的增厚。擬南芥基因組包含47個HDZIP基因，具有調控纖維發(fā)育的作用。薛宇［34］比較不同發(fā)育時期棉纖維的表達譜深度測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)大量HD-Zip家族基因可能參與棉纖維發(fā)育過程。這說明MYB、NAC和HDZIP在纖維發(fā)育中具有重要調控作用。

在本研究中，通過生物信息學預測miR166、miR828和miR156分別靶向調控MYB、NAC和HDZIP基因。通過對比擬南芥同源序列發(fā)現(xiàn)，具有纖維發(fā)育相關的HDZIP基因、MYB基因、NAC基因的同源基因被miRNA（分別為miR166、miR828、miR156）靶向調控。一般來說，如果預測的靶基因具有調控苧麻纖維發(fā)育的作用，那么莖頂端miRNA基因的表達量高，從而抑制靶基因的程度也高，在莖中部，miRNA基因表達量降低，會使靶基因表達量上升，從而會引起次生壁細胞發(fā)生增厚或增多，莖稈增粗，導致苧麻纖維量增加。而HDZIP基因、MYB基因［35］和NAC基因在擬南芥等模式生物中對纖維發(fā)育的調控作用已被證實。MYB作為一類轉錄因子廣泛參與木質部中木質素、細胞壁的合成。這說明miR166、miR828、miR156可能通過調控MYB、NAC和HDZIP基因來進一步參與到苧麻纖維發(fā)育的生物網(wǎng)絡中去。本研究只對miRNA在苧麻不同部位的表達進行了定量分析，表明miRNA可能通過調控相關基因表達來調控苧麻纖維發(fā)育。對于以上推測需要對預測靶基因的表達量開展進一步的研究。因此，本研究為探究miRNA在苧麻纖維發(fā)育調控中的功能奠定了基礎。