羅布麻莖葉粗提物及脫膠纖維的抑菌活性分析

劉寧，哈尼帕·哈再斯，喻春明，陳平，陳繼康，陳坤梅，王曉飛，Aminu Shehu Abubakar，高鋼*，朱愛國*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

（2.新疆伊犁州農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆 伊寧 835000）

我國可開發(fā)利用的夾竹桃科羅布麻屬（Apocynum）植物資源主要有羅布白麻（ApocynumhendersoniiHook.f.）和羅布紅麻（ApocynumvenetumL.）兩種［1］，他們具有相似的植物形態(tài)、生理特性以及類似的經(jīng)濟屬性［2-4］。羅布麻屬植物生態(tài)適應性強，具有較強的生態(tài)和經(jīng)濟雙重效益。根、莖、葉、花、全草可入藥，有平心悸、止眩暈、消痰止咳、強心利尿等功效［5-7］；莖部韌皮纖維是紡織、造紙的優(yōu)質(zhì)原料，并具有良好的保健與抑菌性能［8-9］；葉子可制成保健茶等［10］。近年來，在回歸自然思潮的影響下，羅布麻產(chǎn)品的開發(fā)利用如火如荼。

羅布麻莖、葉中含多種抑菌成分，其中的蒽醌、黃酮類、β-谷甾醇以及鞣質(zhì)等酚類對微生物的抑制和殺滅起主要作用［11］，如黃酮等酚類化合物分子中的酚羥基能與細菌或真菌中的蛋白質(zhì)或酶以氫鍵方式結合，促使蛋白質(zhì)變性，導致細胞質(zhì)解體和細胞膜皺縮等［12］，從而有效地抑制微生物的生長［13］。當前，羅布麻脫膠纖維的生產(chǎn)和加工方法與苧麻等其他麻類作物較為相似，植株莖稈上的韌皮需經(jīng)剝離、蒸煮、脫膠等系列精細化生產(chǎn)后才可獲得理想的紡織纖維，韌皮剝離過程中產(chǎn)生大量的莖葉副產(chǎn)物。為此，本文主要研究羅布麻脫膠纖維以及韌皮纖維剝離過程中產(chǎn)生的莖葉副產(chǎn)物的抑菌效果，旨在探索羅布麻非抗生素類天然產(chǎn)物的抑菌活性成分，并為羅布麻多用途利用和功能型纖維制品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羅布紅麻和羅布白麻纖維均為脫膠處理后的精干麻纖維，羅布紅麻莖葉采集于中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所國家種質(zhì)麻類資源圃，羅布白麻莖葉采集于中國農(nóng)業(yè)科學院西部農(nóng)業(yè)研究中心昌吉試驗基地。莖葉收集后于70℃烘箱中烘干30 min充分去除水分，置于破壁機中打碎至粉末狀后過160目細篩，備用。

試驗菌種：大腸桿菌（CCTCC AB 91117）、金黃色葡萄球菌（CCTCC AB 91093）和黃曲霉菌（ATCC 13450）。

1.2 試劑與主要儀器

胰蛋白胨（Trytone）和酵母粉（Yeast Extract）：Oxiod公司；氯化鈉、氫氧化鈉：99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉，PDA、PDB培養(yǎng)基：BR級，北京索萊寶科技有限公司。

電熱恒溫干燥箱（DGG-9030A）、Westinghouse多功能加熱破壁機D16、精密分析天平（ME204，0.0001 g）、TOMY全自動高壓滅菌鍋（TOMY Autoclave）、AIRTECH超凈工作臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082型）、722 N可見分光光度計等。

1.3 試驗方法

1.3.1 羅布麻莖葉粗提物抑菌活性測定

（1）羅布麻莖葉粗提物樣品的制備

稱取過細篩后的羅布紅麻和羅布白麻莖葉粗提物，20%PEG-400+10%DMSO+70%生理鹽水分別配制成15、20 mg/mL的懸濁液備用。

（2）培養(yǎng)基的制備

LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：取950 mL去離子水于1 L的錐形瓶中，加入胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，玻璃棒攪拌直至完全溶解，并加入1.0 mg/mL氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0左右，去離子水定容至1 L，于高壓滅菌鍋中121℃滅菌20 min備用（用于細菌培養(yǎng)）。

PDB培養(yǎng)基：取25 g PDB加入1 L蒸餾水后加熱煮沸溶解，于高壓滅菌鍋中121℃滅菌20 min備用（用于真菌培養(yǎng)）。

固體培養(yǎng)皿：在液體LB培養(yǎng)基的基礎上加入1.5%～2.0%瓊脂粉，用于細菌固體培養(yǎng)；真菌固體培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，取40.1 g PDA于1 L蒸餾水中加熱煮沸至完全溶解，于高壓滅菌鍋中121℃滅菌20 min，待滅菌完成后，均勻倒于一次性無菌培養(yǎng)皿中，厚度約0.5 cm，待冷卻凝固后于4℃冰箱中保存待用。

（3）菌懸液的制備

將測試用的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中劃線，37℃培養(yǎng)12 h；黃曲霉菌接種于PDA培養(yǎng)基中劃線，于30℃培養(yǎng)12 h。取滅菌好的試管3支分別加入LB液體培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基約5.0mL，用接種環(huán)挑取一環(huán)單菌落于試管中，放置于水浴搖床培養(yǎng)12 h。超凈工作臺上取少許活化的菌體置于試管中，稀釋至相同濃度（約1.0×108CFU/mL）備用。

（4）抑菌活性檢測

將經(jīng)LB或PDB稀釋后的不同菌液分別均勻涂布于固體LB或PDA一次性培養(yǎng)皿中，然后吸取不同濃度的羅布紅麻和羅布白麻葉片粗提物懸濁液20μL，滴于直徑為6 mm的濾紙片中心位置，靜置2 min后，置于上述培養(yǎng)皿中，助溶劑為對照組，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃（細菌）或30℃（真菌）下培養(yǎng)12 h，采用游標卡尺測量抑菌圈直徑［14］。每個菌種設置3個重復，取平均值，同時每組試驗中，每個培養(yǎng)皿中放入5枚濾紙片，以中間放置無菌濾紙片的培養(yǎng)皿作為空白對照組。

采用對倍稀釋法檢測羅布紅麻及羅布白麻莖葉粗提物溶液的最小抑菌濃度。將羅布白麻及羅布紅麻莖葉粗提物溶液和3種菌種混合培養(yǎng)于無菌試管中，依次稀釋并使粗提物終濃度分別為40、20、15、10、7.5、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL，且不同菌種終濃度保持一致，約1.0×108CFU/mL，每個處理均設置3個重復，助溶劑作為陽性對照組，培養(yǎng)基和生理鹽水作為陰性對照組。于37℃（真菌30℃）孵箱中培養(yǎng)12 h后，肉湯澄清表示無細菌生長（-），渾濁表示有細菌生長（+），以能抑制細菌生長的藥液濃度作為其MIC［15］。

1.3.2 羅布麻脫膠纖維抑菌活性定性測定

（1）瓊脂平皿擴散試驗方法

采用《GB/T 20944.3-2007紡織品抗菌性能的評價》方法定性評定羅布麻脫膠纖維對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能；采用《AATCC30-2004抗真菌活性：紡織品防腐和防霉性能評價》方法測定羅布麻脫膠纖維對黃曲霉的防腐和防霉性能。

（2）振蕩法測定抑菌性試驗方法

按照《GB/T 20944.3-2008紡織品抗菌性能的評價》第3部分振蕩法標準執(zhí)行。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

各指標測定均重復3次。采用Excel 2019和SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)采集和分析。

憲法的生命在于實施，憲法的權威也在于實施。如何讓文本上的憲法在我省“活起來”“落下去”，充分發(fā)揮國家根本法的作用，是全省各級各部門的共同責任，地方各級人大及其常委會更是責無旁貸。當前，深入推進憲法學習宣傳和貫徹實施，應著重把握好以下5個方面。

2 結果與分析

2.1 羅布麻莖葉粗提物抑菌性能

2.1.1 羅布白麻莖葉粗提物的抑菌活性

由表1和圖1可知，羅布白麻莖葉粗提物對不同微生物的抑制活性與粗提物濃度呈正相關。對同一菌種，羅布白麻莖葉提取物抑菌圈直徑隨著濃度的升高而增加，其中大腸桿菌增加值最高，為5.330 mm，金黃色葡萄球菌次之，為4.735 mm，黃曲霉菌最小，約4.120 mm。同一濃度下，羅布白麻莖葉粗提物對不同微生物的抑制效果較為相似，均為對黃曲霉菌的抑制效果最佳（抑制圈直徑分別為12.735、16.855 mm），金黃色葡萄球菌次之，大腸桿菌稍差。

圖1 不同濃度羅布麻屬植物莖葉粗提物的抑菌圈Fig.1 Inhibition zones of apocynum plants leaf and stem rough extract with different concentrations

表1 羅布白麻莖葉粗提物對不同菌種的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameters of different concentrations of A.hendersonii leaf and stem rough extract on different strains mm

2.1.2 羅布紅麻莖葉粗提物的抑菌活性

由表2和圖1可知，羅布紅麻莖葉粗提物對不同菌種的抑制活性同羅布白麻，均隨著濃度的升高而增加。其中，金黃色葡萄球菌增加值最高，為4.315 mm，黃曲霉菌次之，為4.170 mm，大腸桿菌最低，約為3.840 mm。同一濃度下，羅布紅麻莖葉粗提物對不同微生物的抑制活性存在差異，抑菌圈直徑大小情況為：黃曲霉菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌。

表2 羅布紅麻莖葉粗提物對不同菌種的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameters of different concentrations of A.venetum leaf and stem rough extract on different strains mm

綜上所述，不同羅布麻之間，羅布白麻粗提物對3種微生物的抑菌活性均大于羅布紅麻。相同濃度下，兩種羅布麻粗提物對不同微生物的抑制活性大小順序相同，均為黃曲霉菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌。

2.1.3 羅布麻莖葉粗提物最小抑菌濃度測定

由表3可知，隨著培養(yǎng)時間增加，培養(yǎng)基和生理鹽水混合培養(yǎng)的陰性對照組處于澄清狀態(tài)；加入助溶劑的陽性對照組的菌液渾濁程度不斷增加，將不同質(zhì)量濃度的羅布麻莖葉粗提物加入包含有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黃曲霉菌的培養(yǎng)液后其渾濁程度發(fā)生了明顯的變化，說明羅布麻莖葉粗提物對不同菌種均有不同程度的抑制作用。其中，羅布白麻和羅布紅麻莖葉粗提物對黃曲霉菌的最小抑菌濃度分別為5、7.5mg/mL，對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度相同，均為7.5mg/mL；而對大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為10、15 mg/mL。羅布麻莖葉粗提物在低于最小抑菌濃度下，同一樣品不同濃度之間，菌種的生長密度隨樣品濃度的降低而增加，呈現(xiàn)一定的劑量依賴關系。

表3 羅布麻莖葉粗提物最小抑菌濃度（MIC）Table 3 Minimum inhibitory concentrations（MIC）of A.venetum leaf and stem rough extract on different strains

2.2 羅布麻脫膠纖維抑菌性能

2.2.1 瓊脂平皿擴散法測定羅布麻脫膠纖維抑菌性能

通過瓊脂平皿擴散法測試羅布麻脫膠纖維對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黃曲霉的抑菌圈發(fā)現(xiàn)，羅布紅麻和羅布白麻纖維樣品對大腸桿菌的抑菌圈直徑大于10mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑小于10 mm，從定性試驗結果初步推測，羅布紅麻和羅布白麻脫膠纖維對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具一定的抑制能力，但對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）的抑制效果稍優(yōu)于革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）。羅布麻脫膠纖維置于黃曲霉瓊脂平皿中培養(yǎng)3 d后，平皿中伴隨有大量菌落繁殖，纖維附近形成抑菌圈。從定性試驗結果初步推測，羅布紅麻和羅布白麻纖維對黃曲霉的防腐、防霉性能不明顯（見表4）。

表4 羅布麻脫膠纖維瓊脂平皿擴散法抗菌效果評價Table 4 Evaluation on antibacterial effect of AGAR plate diffusion method of Apocynum venetum fiber

2.2.2 振蕩法測定羅布麻脫膠纖維抑菌性能

由表5可知，羅布紅麻纖維和羅布白麻纖維對供試大腸桿菌的抑菌率分別高達96%、95%，對金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為91%、89%，對黃曲霉的抑菌率則分別為10%和11%。羅布紅麻纖維和羅布白麻纖維對供試金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的抑菌率均大于標準值（根據(jù)振蕩法抗菌性能評價標準，對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑菌率≥70%，樣品具有抗菌效果），抑菌效果較為明顯。

表5 羅布麻脫膠纖維震蕩法抑菌性能結果Table 5 Results of bacteriostatic performance by shock method

3 結論與討論

細菌細胞壁的結構在決定抗菌劑與微生物的相互作用之間發(fā)揮著關鍵作用［16］。革蘭氏陽性菌的細胞壁存在較厚的肽聚糖層（15～100 nm），占整個細胞干重的40%～90%。除此之外，還含有大量的磷壁酸和少量的脂類與細胞膜緊密連接［17］。革蘭氏陰性菌由細胞質(zhì)膜和薄的肽聚糖層組成（20～50 nm），占整個細胞干重的5%～10%，但其細胞壁層次較多且成分復雜，并進一步受到由脂多糖組成的疏水性脂質(zhì)雙分子層保護，脂質(zhì)層大大降低了其滲透能力［18］。由濾紙片-瓊脂平皿抑菌試驗結果可知，羅布麻莖葉粗提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黃曲霉3類菌體結構各異的微生物均具有抑制效果，且對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和真菌（黃曲霉）的抑制效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）。據(jù)此可推測羅布麻莖葉粗提物中抑菌成分可能對肽聚糖層的破壞能力相對較強且能穿過成分復雜的細胞壁，而對肽聚糖、脂類和磷壁酸作用能力相對較弱。分離這些活性物質(zhì)并鑒定其分子結構，有可能發(fā)現(xiàn)具有新型殺菌活性的先導化合物。

真菌細胞壁結構特點區(qū)別于細菌，主要由幾丁質(zhì)、脫乙酰殼多糖、葡聚糖、纖維素、半乳聚糖等碳水化合物組成［19］。本研究發(fā)現(xiàn)羅布白麻和羅布紅麻莖葉提取物對供試黃曲霉類真菌的最小抑菌濃度分別為5、7.5 mg/mL，抑制效果優(yōu)于多種植物源抑制劑或精油［20］，這一結果對利用和開發(fā)羅布麻來源的天然黃曲霉抑制劑具有重要意義。

目前關于麻類纖維的抗菌機理主要如下：一是從纖維結構來說，麻類纖維內(nèi)部含大量孔腔，可抑制厭氧菌的生長，并且具吸水快干的功能，破壞細菌生長的潮濕環(huán)境；從纖維成分來說，纖維中含有的某些活性成分具較好的抑菌、殺菌效果［21］。李明華等［22-24］從羅布麻原麻中分離鑒定了多種含量較高的黃酮類抑菌活性成分，但在脫膠后的纖維中未能發(fā)現(xiàn)黃酮化合物。羅布麻不同部位含有不同成分的抑菌活性物質(zhì)，分別對不同類型的微生物具有抑制作用［25-27］。羅布麻原纖維經(jīng)強酸強堿脫膠等加工工藝，去除果膠和木質(zhì)素的同時，也導致纖維的有效抑菌成分明顯減少和結構變化。本試驗中，脫膠后的羅布麻纖維對黃曲霉類真菌的抑制效果與羅布麻莖葉粗提物相比顯著降低，這也進一步支持了上述推測。此外，羅布麻脫膠纖維雖仍對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具一定的抑制效果，但相對于羅布麻莖葉粗提物，其抑制活性表現(xiàn)出一定的差異。因此，羅布麻脫膠纖維中存在的耐酸耐堿性抑菌物質(zhì)或經(jīng)強酸強堿作用生成的新抑菌物質(zhì)還有待進一步發(fā)掘。