氨水浸泡液對羅布麻韌皮生物脫膠的影響

馮湘沅，許炳榮，成莉鳳，楊琦，劉平，劉志遠(yuǎn)，鄭科，段盛文*，彭源德*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205；2.湖州南潯善璉盛業(yè)紡織有限公司，浙江 湖州 313014）

21世紀(jì)以來，隨著社會的進(jìn)步和生活水平的提高，人們對服裝的要求更加注重紡織材料的健康環(huán)保和綠色天然，而羅布麻韌皮正是一種健康、天然、綠色的紡織原料［1］。

由于羅布麻韌皮含有半纖維素、果膠、木質(zhì)素等膠質(zhì)，必須去除膠質(zhì)才能用于紡織，但羅布麻與苧麻、亞麻等韌皮相比，含有的黃酮類、槲皮苷、強心苷、酚類、丹桂酸等諸多抑菌成分較多，相較其他麻類植物脫膠難度較大［2-4］。為了改善這一問題，近年來，國內(nèi)外科學(xué)研究者開展了大量工作。例如申請?zhí)枮?01010530013.1的中國專利公開了一種羅布麻韌皮纖維短流程脫膠方法，首先將羅布麻韌皮浸入配制的松解液中進(jìn)行松解，然后再加入一定量的堿進(jìn)行煮煉，最后洗滌得到目標(biāo)物質(zhì)，該方法雖然縮短了生產(chǎn)時間，提高了工作效率，但是采用堿法處理，使得纖維受到堿類不同程度的破壞，從而導(dǎo)致產(chǎn)物得率很低［5］。Halim等［6］研究了一種以乙酸浸泡為核心的羅布麻脫膠工藝。而生物脫膠主要依賴于產(chǎn)果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等活性高的優(yōu)良菌株，在適當(dāng)條件下將非纖維素物質(zhì)快速降解為低分子單糖類物質(zhì)，從而實現(xiàn)脫膠目的，具有可循環(huán)和環(huán)保的優(yōu)點［7-8］。

本研究擬分別采用0.1%氨水和自來水為浸泡液，并利用LM菌株在恒溫振蕩條件下對羅布麻韌皮進(jìn)行脫膠，檢測脫膠過程中發(fā)酵液的關(guān)鍵酶活力、pH值、有機酸組分濃度的變化規(guī)律，以及脫膠試驗終止時的單糖類組分含量、脫膠失重率等指標(biāo)，旨在尋找一種適合于羅布麻韌皮脫膠的方法，并為其脫膠機理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

LM菌株：菊果膠桿菌變異菌株P(guān)ectobacteriumchrysanthemi（保藏號CCTCCM 2017304）。

原麻：羅布麻韌皮。

液體培養(yǎng)基：氯化鈉0.5%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，牛肉浸膏0.5%，自來水。

1.2 主要儀器與試劑

液相色譜儀（Dionex Ultimate 3000），紫外檢測器（VWD-3400），Thermo Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），圖譜和數(shù)據(jù)采集處理為變色龍軟件。

粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司，F(xiàn)Z102型），恒溫振蕩器（金壇市天竟實驗儀器廠，SHZ-82型），pH計（梅特勒-托利多儀器上海有限公司，F(xiàn)E28型），全波長酶標(biāo)分析儀（Thermo Fisher，multiskan Go型）。

葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、橘子果膠、木聚糖均為美國Sigma公司產(chǎn)品；

乙酸銨（分析純）、1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮（PMP）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、三氯甲烷、氨水、3，5-二硝基水楊酸、丙三醇均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、磷酸二氫鉀、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均為Aladdin公司產(chǎn)品；魔芋膠為成都路特生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

0.1%氨水浸泡液：V（氨水）∶V（自來水）=0.1∶100。

DNS試劑：稱取3，5-二硝基水楊酸6.5 g，溶于約500 mL超純水中，逐漸加入325 mL的氫氧化鈉（2mol/L）溶液，45℃水浴中攪拌（磁力），再加入45 g丙三醇，待全部溶解后，冷卻至室溫，定容至1000 mL，貯存于棕色試劑瓶中，暗處放置7 d后使用。

1.3 菌液制備

挑取LM菌株的活化典型菌落1個接入盛有5 mL液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，混勻，置于35℃、150 r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)4 h后，全部倒入盛有100mL液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，再取6 mL接于300 mL液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)6 h。

1.4 接種與脫膠

取6 mL菌液于裝有300 mL氨水（0.1%）浸泡液（根據(jù)前期預(yù)試驗確定0.1%氨水為最適體積百分比濃度）的錐形瓶中，混勻，投入15 g羅布麻韌皮，置于35℃、150 r/min全恒溫振蕩器進(jìn)行振蕩，同時設(shè)置CK組（加菌、自來水）。

1.5 取樣

羅布麻韌皮接種振蕩0.5 h開始取樣，直至15.5 h結(jié)束，其中每隔3 h取樣一次。每瓶取10 mL（立即用等量無菌水補充）發(fā)酵液，分別用于測定關(guān)鍵酶活力、pH值、有機酸濃度等指標(biāo)；試驗終止時的發(fā)酵液用于測定單糖類含量；麻纖維用于測定脫膠失重率。

1.6 測定方法

1.6.1 關(guān)鍵酶活力測定

果膠酶活力的測定［9］：取2.0 mL果膠酶底物（0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH 9.0，配置5.0 mg/mL聚半乳糖醛酸鈉溶液，預(yù)熱至50℃），加入1.0 mL粗酶液（0.2μm濾膜過濾發(fā)酵液所得的過濾液），50℃下反應(yīng)5 min后，立刻加入2.0 mL DNS，沸水浴顯色5.0 min，冰浴冷卻，加入超純水定容至15 mL。以滅活的粗酶液作陰性對照，在520 nm波長測定OD值。

甘露聚糖酶活力的測定［10］：底物改為0.05 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液（pH=6.0）配置5.0 mg/mL的甘露聚糖溶液，預(yù)熱至65℃，剩余步驟與果膠酶活力測定一致，在540 nm波長測定OD值。

木聚糖酶活力測定［11］：底物改為0.05mol/L檸檬酸-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH=5.8）配置5.0 mg/mL的木聚糖溶液。預(yù)熱至60℃，剩余步驟與果膠酶活力測定一致，在540 nm波長測定OD值。

1.6.2 有機酸組分測定

有機酸組分含量參照馮湘沅等［12］的HPLC法進(jìn)行測定。

混合標(biāo)準(zhǔn)有機酸溶液配制：用超純水準(zhǔn)確配制濃度5 g/L甲酸、5 g/L乙酸、5 g/L乳酸、5 g/L丙酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取上述等體積各標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，0.45μm濾膜過濾，適度稀釋用作HPLC檢測分析。

樣品處理：取發(fā)酵液2 mL，10 000 r/min離心10 min，去沉淀，取上清用0.2μm濾膜過濾，HPLC檢測分析。

HPLC檢測條件：流動相：V（甲醇）∶V（0.01mol/L磷酸二氫鉀緩沖液，pH2.7）=3∶97；紫外檢測波長：210 nm；柱溫：25℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

1.6.3 pH值測定

取2 mL發(fā)酵液按照pH計操作說明書測其pH值。

1.6.4 單糖類測定

單糖類含量測定按照馮湘沅等［13］的方法進(jìn)行。

HPLC檢測條件：流動相：V（乙腈）∶V（0.1mol/L醋酸銨緩沖，pH5.5）=19∶81；紫外檢測波長：250 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

1.6.5 失重率測定

試驗終止時，將麻瓶置于滅菌高壓鍋中保持105℃、20 min，取出麻纖維，然后用清水洗掉附著在纖維表面的膠質(zhì)（注意防止纖維損失），干燥、稱量。

脫膠失重率以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)w（%）表示，按公式（1）進(jìn)行計算：

式中：

m0—試驗初始麻皮質(zhì)量，g；

m1—試驗終止麻纖維質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫膠過程中關(guān)鍵酶活力變化規(guī)律

處理組（0.1%氨水浸泡液）和CK組（自來水浸泡液）的果膠酶活力（圖1，a）均隨發(fā)酵時間的延長先升高后降低，但兩組浸泡液達(dá)到最大酶活力所需時間和增加的幅度卻不同，處理組、CK組果膠酶達(dá)到最大酶活力分別為12.5、9.5 h。處理組果膠酶由起始酶活力（28.77 U/mL）到最高酶活力（674.4 U/mL）增加了645.63 U/mL，而CK組果膠酶活力卻只增加了301.40 U/mL。

處理組、CK組甘露聚糖酶活力（圖1，b）均隨發(fā)酵時間的延長而逐漸升高，但CK組酶活力增長的幅度明顯低于處理組。從0.5 h開始到15.5 h結(jié)束，處理組甘露聚糖酶活力由起始測定時的10.97 U/mL上升到脫膠結(jié)束時的113.69 U/mL。而CK組在整個脫膠過程中甘露聚糖酶活力最大值僅為29.15 U/mL。

處理組、CK組的木聚糖酶活力（圖1，c）均隨發(fā)酵時間的延長呈上升趨勢，但處理組木聚糖酶活力較CK組增加明顯。15.5 h發(fā)酵終止時處理組的酶活力（42.14 U/mL）較CK組（10.06 U/mL）提高32.08 U/mL。

圖1 脫膠關(guān)鍵酶活力變化規(guī)律Fig.1 Variation trend of activities of the key enzymes for degumming

由脫膠關(guān)鍵酶活力變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，以0.1%氨水作為羅布麻韌皮脫膠浸泡液，可能會為LM菌株提供充足的氮源，有利于菌株的快速大量生長繁殖，從而使脫膠關(guān)鍵酶的分泌量增加。

2.2 脫膠過程中發(fā)酵液有機酸組分變化規(guī)律

通過對羅布麻韌皮脫膠過程中采集的樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，經(jīng)HPLC法分析得到發(fā)酵液中含有甲酸、乳酸、乙酸、丙酸等有機酸組分，從圖2、3可看出：

圖2 處理組有機酸組分變化規(guī)律Fig.2 Variation trend of organic acids in treatment group

圖3 CK組有機酸組分變化規(guī)律Fig.3 Variation trend of organic acids in control group（CK）

處理組、CK組甲酸濃度的變化規(guī)律近乎相同，均為0.5～6.5 h緩慢上升，6.5～12.5 h出現(xiàn)下降，12.5～15.5 h又回升，變化趨勢均大致呈“N”型，但在脫膠過程中，處理組甲酸濃度均高于CK組。

處理組的乙酸濃度出現(xiàn)“M”不規(guī)則型變化趨勢，在3.5、12.5 h出現(xiàn)峰高，濃度分別為0.54、0.46 mg/L；CK組僅在9.5 h出現(xiàn)峰高，濃度為0.50 mg/L，呈倒“V”型變化趨勢。

處理組乳酸濃度的變化趨勢大致為“M”型，起始濃度（0.04mg/L）低于終止?jié)舛龋?.05mg/L）。

CK組的乳酸濃度近似于“N”型的變化趨勢。

處理組的丙酸濃度為“W”型的變化趨勢，峰高分別在0.5 h（0.17 mg/L）、6.5 h（0.15 mg/L）、15.5 h（0.09 mg/L）出現(xiàn)；CK組的丙酸濃度大致呈倒“V”型，6.5 h出現(xiàn)最大含量（0.13 mg/L）。

脫膠過程中有機酸組分變化規(guī)律顯示，在發(fā)酵初期，由于LM菌株利用原料溶出物進(jìn)行生長繁殖、分泌脫膠關(guān)鍵酶，產(chǎn)生代謝釋放乙酸和乳酸，導(dǎo)致其濃度逐步上升，隨著發(fā)酵時間的延長，菌株進(jìn)入穩(wěn)定生長期，乙酸與乳酸轉(zhuǎn)化速度趨于平穩(wěn)，同時乙酸與乳酸在其他微生物（雜菌）作用下逐步被還原利用，致使?jié)舛认陆?，隨后其他微生物也開始大量繁殖，代謝產(chǎn)生的乙酸和乳酸轉(zhuǎn)化速度大于消耗速度，濃度再次回升，直至微生物進(jìn)入衰亡期后，乙酸和乳酸的轉(zhuǎn)化速度又小于消耗速度，濃度再次下降。甲酸濃度變化規(guī)律與乙酸和乳酸近乎相同，也經(jīng)歷了先升高、再降低、又升高的變化過程，但是甲酸濃度變化幅度較小、周期較長。丙酸濃度一開始就出現(xiàn)下降，可能是原料中含有某種能降解丙酸的微生物，之后隨著LM菌株的快速生長代謝，致使原料溶出物逐漸轉(zhuǎn)化成丙酸而濃度升高，LM菌株進(jìn)入穩(wěn)定期后，其他可利用丙酸的微生物進(jìn)一步生長，丙酸濃度下降，直至最后微生物進(jìn)入衰亡期，丙酸進(jìn)一步累積［14-16］。通過比較發(fā)現(xiàn)，處理組所積累的有機酸組分變化趨勢較CK組明顯增強，表明添加一定量的氨水浸泡液能使LM菌株在羅布麻韌皮脫膠過程中代謝活動更加旺盛。

2.3 脫膠過程中發(fā)酵液pH值變化規(guī)律

如圖4所示，處理組在0.5～9.5 h，發(fā)酵液pH值由9.15下降到7.06，15.5 h時發(fā)酵液pH值上升到7.65，整個脫膠過程中發(fā)酵液pH值呈略似于“V”字型的變化規(guī)律。這可能是由于處理組在加入0.1%氨水后浸泡液初始pH值大幅度增加，隨著發(fā)酵時間的增加，LM菌株在脫膠過程中產(chǎn)生代謝活動。從整個發(fā)酵體系來看，發(fā)酵液pH值處于7.06～9.15，這一環(huán)境能促使菌株不斷地消耗發(fā)酵液中溶氧及溶出物，快速分泌脫膠關(guān)鍵酶，從而使發(fā)酵液中形成的乙酸、乳酸等有機酸被逐一分解和轉(zhuǎn)化［17］，導(dǎo)致發(fā)酵液pH值降低或回升。而CK組的發(fā)酵液pH值隨著發(fā)酵時間的延長變化不大，此環(huán)境不利于LM菌株脫膠關(guān)鍵酶的產(chǎn)生，代謝活動欠佳，其pH值在5.3上下波動。

圖4 pH值變化規(guī)律Fig.4 Variation trend of pH values

2.4 單糖類含量分析

羅布麻韌皮分別在兩組浸泡液下加菌進(jìn)行恒溫振蕩發(fā)酵15.5 h時，取發(fā)酵液經(jīng)濃縮、干燥后，用HPLC法檢測單糖類組分含量，結(jié)果如圖5、表1所示。對照單糖類標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，處理組發(fā)酵液的半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖含量依次為1.93、0.87、0.86、2.36 mg/g，其含量分別為CK組相應(yīng)含量的5.4、2.5、4.1、5.4倍，但甘露糖、鼠李糖含量相差不大。結(jié)果表明，浸泡液中添加一定量的氨水可能有利于破壞羅布麻韌皮中的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)［18-19］，能促進(jìn)脫膠關(guān)鍵酶與羅布麻韌皮中的半纖維素、果膠等成分充分接觸，從而將羅布麻韌皮中的果膠降解為半乳糖醛酸，半纖維素降解成甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖等單糖類物質(zhì)，更好地起到協(xié)同脫膠作用。

圖5 羅布麻韌皮發(fā)酵液的單糖類組分色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of monosaccharides from A.venetum bast fermentation broth

表1 羅布麻韌皮發(fā)酵液的單糖類組分含量Table 1 Content of monosaccharide in fermentation broth of A.venetum bast

2.5 失重率分析

試驗終止時，麻纖維經(jīng)滅活、干燥、稱量，按照公式（1）計算失重率得出的結(jié)果如圖6所示，CK組、處理組的失重率分別為20.02%、29.13%，處理組的失重率較CK組提高了9.11%。這更進(jìn)一步表明處理組剝離非纖維素物質(zhì)能力較CK組強。

圖6 羅布麻韌皮失重率Fig.6 Weight loss rate of A.venetum bast

3 結(jié)論

本研究分別以0.1%氨水（處理組）和自來水（CK組）為浸泡液，加入LM菌液和羅布麻韌皮在35℃、150 r/min條件下進(jìn)行振蕩脫膠比較，結(jié)果表明：采用0.1%氨水浸泡液能使LM菌株對羅布麻韌皮脫膠過程中所分泌的甘露聚糖酶、果膠酶、木聚糖酶的增加幅度較CK組分別相應(yīng)提高4.8、2.5、7.5倍；代謝活動所產(chǎn)生的有機酸組分——甲酸、乳酸、乙酸、丙酸濃度變化趨勢較CK組增強；發(fā)酵液pH值在7.06～9.15，而CK組pH值處于5.3上下波動；試驗終止時發(fā)酵液中半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖含量分別是CK組相應(yīng)含量的5.4、2.5、4.1、5.4倍；脫膠失重率較CK組提高9.11%。研究發(fā)現(xiàn)，以0.1%氨水為浸泡液能使LM菌株更好地完成羅布麻韌皮脫膠。

由于以自來水為浸泡液的發(fā)酵液呈較強酸性，對微生物生長繁殖、分泌脫膠關(guān)鍵酶所需條件不利，故本研究通過氨水來提高浸泡液起始pH值，進(jìn)而補充氮源，使LM菌株對羅布麻韌皮起到一定的脫膠效果。但是氨水具有較強烈的刺激性氣味以及不穩(wěn)定性特征，因此，結(jié)合添加最佳緩沖液實現(xiàn)高效脫膠菌株對羅布麻韌皮的脫膠還有待于進(jìn)一步探究。