基于AQP9和線粒體細胞凋亡途徑相關性探討健脾活血祛濕方對體外培養(yǎng)H22肝癌細胞的影響*

李 嘉，高 玲，楊孝芳，張 軍，蒲 翔，施楊婉玲

(貴州中醫(yī)藥大學，貴陽 550025)

肝癌是最常見的結締組織瘤之一，每年在全世界范圍有60萬新增患者，其惡性程度僅次于胃癌和食道癌，在所有腫瘤相關性死因中排在第三位[1]。中藥對減輕肝癌患者的臨床癥狀，提高患者的生存質量和免疫功能、預防復發(fā)和轉移都具有重要作用[2]。課題組以“毒損肝絡”理論為用藥的指導依據(jù)，自擬健脾活血祛濕方輔助治療肝癌。前期研究結果顯示，本方可顯著提高肝硬化腹水大鼠線粒體水通道蛋白8、9(aquaporin8、9，AQP8、9)的表達，減輕線粒體水腫，同時促進線粒體ATP合成，改善肝功能，提高細胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase，COX)活性表達，促進肝癌細胞在線粒體途徑的凋亡[3]。為進一步研究本方在治療肝癌中可能存在的作用及作用機制，課題組進行體外培養(yǎng)H22肝癌細胞，在不同劑量健脾活血祛濕方的給藥干預下，觀察細胞的增殖抑制率、凋亡率及線粒體膜電位和AQP9的改變，為中醫(yī)藥治療肝癌提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株

H22小鼠肝癌細胞，購自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞保存中心。

1.2 實驗藥物

健脾活血祛濕方組成：五爪龍30 g，白術30 g，白背葉根30 g，豬苓15 g，田基黃20 g，茜草15 g，土鱉蟲10 g，砂仁5 g(后下)，全部藥材均購自貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥房，符合《中華人民共和國藥典》2010年版要求。先加蒸餾水浸泡40 min，一煎加藥材量的8倍水，沸騰后煎40 min；二煎加藥材量的6倍水，沸騰后煎30 min過濾，2次所得濾液混合后干燥濃縮至15 ml，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ? g/m1的原液，80 ℃水浴30 min，連續(xù)3 d滅活后，1000rpm離心10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。實驗時以含2%DMEM培養(yǎng)液倍比稀釋。

1.3 主要試劑

胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)；DMSO(美國Sigma公司)；胰蛋白酶、PBS緩沖液、Trizol(均為Invitrogen公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit withgDNAEraser，RR047 A、TBGreen? Premix Ex TaqTMII，RR820 A(均為TAKARA公司)；氯仿、異丙醇、無水乙醇(均購自廣州化學試劑廠)；DEPC(上海生工(GAPDH抗體)(1∶4000稀釋液)，杭州三箭公司；AQP9抗體(1∶400稀釋液)，博世德公司(批號BA3619-2)；Bax抗體(1∶1000稀釋液)，CST公司(批號5023)；Bcl-2抗體(1∶1000稀釋液)，CST公司(批號2870)；注射用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX):200 mg/瓶，德國Baxter Oncology Gmbh 公司。

1.4 儀器

超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備有限公司)；倒置顯微鏡(美國thermo公司)；低速離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；酶標儀(美國thermo公司)；ABI7500熒光定量PCR儀(美國Invitrogen公司)；PCR儀(美國thermo公司)；DYY7C型電泳儀電源(北京市六一儀器廠)；TY-80B脫色搖床(江蘇金壇市萊華儀器制造有限公司)；電泳槽(Tanon公司)；濕轉轉膜儀(Tanon公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的小鼠H22細胞，置于含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)孵育，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況并用臺盼蘭染色，計算細胞存活率達95%以上，取對數(shù)生長期細胞，用PBS緩沖液清洗2遍，經胰蛋白酶消化后，加入4 mL DMEM高糖培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的消化，充分均勻吹打，使H22細胞處于單個懸浮狀態(tài)，對H22細胞進行細胞計數(shù)。

2.2 比色法(MTT)測定

H22細胞增殖抑制率將藥物做系列倍比稀釋成高濃度(200 mg/ml)、中濃度(100 mg/ml)、低濃度(50 mg/ml)，同時設置不加任何藥物的空白組和CTX組(20 mg/ml)，在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，標記為A、B、C、D。取對數(shù)生長期細胞，將細胞密度調整為3×103/mL，接種在2塊96孔板中。96孔板外圍孔加入PBS緩沖液0.1 ml/孔，中間60孔每孔加入100μLDMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。24 h后取孔板A每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清加入DMSO 150 μL，充分振蕩溶解結晶，在490 nm波長酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的吸光度(A)，計算藥物作用24 h細胞增殖抑制率。同理測出48 h、72 h、96 h孔板B、C、D各孔吸光度。增殖抑制率=(對照組A490-實驗組A490)/對照組A490×100%。

2.3 Annexin V-FICT/PI檢測

H22細胞凋亡率取對數(shù)生長期細胞，將細胞密度調整為6×104/mL接種在6孔板中，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，胰蛋白酶消化細胞，終止消化后離心收集2×104個細胞，雙蒸水稀釋5×Binding Buffer為1×工作液，取500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。每個流式管加入5 μL Annexin V-FICT和10 μL PI，避光靜置5 min。通過FICT檢測通道(FLI)檢測Annexin V-FICT(Ex=488 nm；Em=530 nm)，通過PE檢測通道檢測PI(FL2)。

2.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測

表1示，H22細胞AQP9的表達細胞加1 ml Trizol提取總RNA，室溫放置5 min，加入200 μL氯仿，顛倒混勻后室溫放置15 min，4℃ 12000 g離心15 min，吸取上層水相，至另一離心管中，加入0.5 ml異丙醇混勻，室溫放置5～10 min，4℃ 12000 g離心10 min，棄上清，RNA沉于管底，加入1 ml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，洗滌沉淀，4 ℃ 8000 g離心5 min，盡量棄上清，室溫晾干或真空干燥5～10 min，加入50 μL DEPC處理過的H2O溶解并測量RNA濃度。從-80 ℃冰箱中取出樣品RNA 4 ℃下解凍，然后在 0.2 ml PCR 管中配制反應溶液。

表1 引物設計

反應體系：DNA 模板2 μL，PCR Forward Primer(10 μM)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus) (2×)10 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，dH2O Up to 20 μL。反轉錄條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5sec4℃。將PCR管置于定量PCR儀中進行反應，反應條件為:95 ℃，30 s；95 ℃，3s；60 ℃，30 s，40 Reps，Melt Curve Stage。使用2^-ΔΔCт計算相對mRNA含量，ΔCт=Cт(目的基因)—Cт(管家基因)GAPDH，ΔCт=ΔCт(各用藥組)—ΔCт(空白組)，2^-ΔΔCт表示各用藥組目的基因mRNA的含量相對空白組所改變的倍數(shù)。

2.5 免疫印跡法(Western Blotting,WB)檢測

H22細胞AQP9、B細胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X protein, Bax)的表達低溫提取蛋白，蛋白定量，加入含2-ME(巰基乙醇，強還原劑)的5×上樣緩沖液(1∶50)100 ℃變性5 min，12%的SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜，用5%的脫脂奶粉于搖床上封閉1 h。一抗孵育：取出封閉好的PVDF膜，用TBST漂洗，根據(jù)目的蛋白分子量大小與內參剪開，放入相應稀釋好的一抗中孵育，4 ℃過夜。二抗孵育：第2天回收一抗，PVDF膜用TBST洗5遍，于搖床上進行洗滌，每次5 min。洗滌結束后，開始孵育二抗，二抗稀釋比例為1∶6000，搖床上室溫孵育50 min。用TBST洗膜5次，每次5 min，預先配好顯影液、定影液、ECL發(fā)光液，每張膜上加200-300ulECL液進行曝光。

2.6 共聚焦顯微鏡技術觀察

JC-1法檢測細胞線粒體膜電位，取制備好的線粒體混懸液使用流式細胞儀按JC-1法檢測。取適量JC-1(200×)，按照每50 μL JC-1(200×)加入8 mL超純水比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1，然后再加入2 mL JC-1染色緩沖液(5×)，混勻后把試劑盒中提供的CCCP(10mM)推薦按照1∶1000的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至10 μM，處理細胞20 min，共振聚焦顯微鏡觀察。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 MTT法測定H22細胞增殖抑制率

圖1示，與空白組比較，CTX組在48 h、72 h和96 h對小鼠H22肝癌細胞的抑瘤率明顯升高(P<0.05)；與CTX組比較，健脾活血祛濕方各劑量組的抑瘤率呈時間/劑量依賴性增高(P<0.05)，其中高劑量組在96 h的抑瘤率達最高。

注：與空白組比較：*P<0.05；與CTX組比較：△P<0.05

3.2 Annexin V-FICT/PI檢測H22細胞凋亡率

圖2示，Q2-UL表達晚期凋亡群體，Q2-UR表達中晚期凋亡群體，Q2-LL表達未凋亡群體，Q2-LR表達早期凋亡群體，圖中箭頭所指部分區(qū)域面積表示整體凋亡率。圖2表2示，與空白組比較，CTX組的凋亡率明顯增加(P<0.05)；與CTX組比較，健脾活血祛濕方各劑量組凋亡率均明顯增加(P<0.05)，其中高劑量組表達顯著(P<0.05)。

圖2 Annexin V-FITC/PI檢測H22肝癌細胞凋亡

表2 Annexin V-FITC/PI檢測H22肝癌細胞凋亡比較

3.3 RT-PCR檢測H22細胞AQP9的表達

圖3示，與空白組比較，CTX組的AQP9mRNA轉錄水平明顯增高(P<0.05)；與CTX組比較，健脾活血祛濕方高劑量組的AQP9mRNA轉錄水平明顯增高(P<0.05)，中、低劑量組的AQP9mRNA轉錄水平明顯下降(P<0.05)，各劑量組呈劑量依賴性增高(P<0.05)。

注：與空白組比較：*P<0.05；與CTX組比較：△P<0.05

3.4 WB法檢測H22細胞AQP9、Bax、Bcl-2的表達

圖4、5示，與空白組比較，CTX組的AQP9、Bax、Bcl-2蛋白表達水平均有顯著增高(P<0.05)；與CTX組比較，健脾活血祛濕方各組AQP9、Bax蛋白表達水平呈劑量依賴性增高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達呈劑量依賴性下降(P<0.05)。

注：A.空白組; B.CTX組;C.低劑量組; D.中劑量組;E.高劑量組

注：與空白組比較：*P<0.05；與CTX組比較：△P<0.05

3.5 共聚焦顯微鏡觀察

JC-1法檢測細胞線粒體膜電位：紅色熒光表示細胞線粒體膜電位較高，綠色熒光表示細胞線粒體膜電位較低。圖6示，空白組Merge無明顯綠色熒光細胞顯示，以紅色熒光為主要表達(箭頭所示)；與空白組比較，CTX組Merge顯示綠色熒光增多(箭頭所示)，提示線粒體膜電位有明顯降低；與CTX組比較，健脾活血祛濕方低、中劑量組Merge顯示綠色熒光變淺(箭頭所示)，高劑量組Merge主要表達綠色熒光且漸強(箭頭所示)，提示健脾活血祛濕方可顯著降低線粒體膜電位，促進細胞凋亡。

圖6 共聚焦顯微鏡觀察JC-1檢測細胞線粒體膜電位(DAB×200)

4 討論

肝癌屬于中醫(yī)學“肝積”“積聚”“癥瘕”等范疇，一般認為由于情志不暢、飲食勞倦、寒邪侵襲以及久病不愈、耗氣傷血等因素影響臟腑氣機異常變化，絡脈郁滯不通、津血互換失常、痰濕血瘀凝滯脈絡而終成本病[4]。肝癌屬于本虛標實之證。絡病學認為“毒損肝絡”是肝癌形成的基本病理過程，其基礎理論認為毒瘀作祟阻滯于肝絡出現(xiàn)絡虛、毒侵，而化毒為害則是絡病遷延和深化的關鍵所在，此時的疾病處于正虛邪實、病勢膠著狀態(tài)。課題組根據(jù)此理論以健脾活血祛濕方輔助治療肝癌。本方以五爪龍、白術為君，共奏健脾益氣、補益肝絡、化濕行水之功；以田基黃、豬苓、白背葉根三藥為臣，以達健脾通絡、清熱利水之效；土鱉蟲、茜根活血化瘀、通絡為佐，砂仁調理脾胃、辛溫化濕為使，達到利濕而不傷脾胃之效。全方配伍嚴謹，藥味精煉，共奏健脾、通絡、祛濕之功?，F(xiàn)代藥理學實驗證實，五爪龍具有良好的抗病毒、抑制腫瘤、免疫調節(jié)等作用；白術具有良好的保肝利膽作用，常用于治療肝硬化腹水、消癥積；白背葉根具有良好的保肝利膽、抗纖維化作用；田基黃具有保肝護肝、抗病毒、增強免疫等作用；豬苓、茜根同樣具有良好的保肝護肝作用。課題組前期研究結果表明, 健脾活血祛濕方能緩解肝細胞線粒體損傷，改善肝線粒體代謝功能，并具有良好的保肝作用。課題組推測其機制可能是通過激發(fā)線粒體細胞凋亡途徑，促進肝臟壞損細胞的早期凋亡。同時本研究結果也提示，健脾活血祛濕方各劑量組可呈時間/劑量依賴性地抑制腫瘤細胞生長。

AQP是一種廣泛存在于細胞膜上的水通透性蛋白，是近年在腫瘤分子生物學領域內研究的一個熱點。目前共發(fā)現(xiàn)有13個成員(命名為AQP0-12)，主要介導肝癌細胞凋亡時水的內外膜運動。肝細胞上有多種AQPs且每種表達數(shù)量各異，其中AQP9是最重要的一種[5]。一些水通道蛋白在腫瘤中異常表達，并參與腫瘤的凋亡、增殖、侵襲及轉移[6]。研究證實，AQP9表達于正常肝臟，在肝癌細胞中表達下降，使得肝癌細胞對滲透壓反應和對凋亡的刺激性下降，從而促進腫瘤細胞增殖[7]；AQP9在肝臟腫瘤細胞中比正常肝細胞表達顯著減少，離體肝臟腫瘤細胞質膜的水通透性極低，對凋亡誘導信號反應遲鈍，而正常肝細胞反應迅速。本研究表明，健脾活血祛濕方各劑量組的AQP9表達均呈劑量依賴性升高，課題組推測肝癌細胞凋亡可能是因為高表達的AQP9增加了肝癌細胞的通透性，促進細胞內外水代謝的運轉，線粒體基質的滲透壓升高，激活相關凋亡因子，引起半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)，最終導致細胞核皺縮，核染色凝縮和核碎裂等現(xiàn)象。同時Annexin V-FICT/PI結果也提示，健脾活血祛濕方可呈劑量依賴性地促進細胞凋亡。

線粒體釋放凋亡酶激活因子誘導Caspase家族產生級聯(lián)反應，導致癌細胞的不可逆凋亡，這一過程在肝癌細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[8]。線粒體細胞凋亡途徑是三大經典凋亡途徑的中心途徑，以線粒體膜電位下降為標志，引起相關凋亡蛋白Bax、Bcl-2與一些通道蛋白PTP、AQP等變位，形成調亡小體導致凋亡。具體途徑可表現(xiàn)為細胞受外界因素損傷刺激引起線粒體膜電位下降，ATP合成降低，胞質Ca2+升高以及細胞內活性氧種類(reactive oxygenspecies, ROS)的增加，使腺苷酸轉運體(adenine nucleotide tranporter, ANT)的構象改變，進而導致PT孔開放。繼而ATm及內膜腺苷轉位酶(APH)崩解，呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體基質的滲透壓升高、內膜腫脹，膜內外形成滲透梯度，水通道蛋白迅速有選擇性地將水排出，使細胞凋亡性容積減小(apoptotic volume decrease, AVD)[9-10]，導致細胞水分丟失。同時伴隨線粒體膜間隙的細胞色素c(cytochrome c, Cyt-C)、Smac/DIABLO、細胞凋亡誘導因子(apoptosis induced factor, AIF)、核酸內切酶G(endonucleaseG, EndoG)、Bcl-2蛋白家族等的釋放，通過caspase級聯(lián)反應引起細胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，健脾活血祛濕方高劑量組細胞線粒體膜電位有下降并出現(xiàn)核皺縮，細胞呈現(xiàn)凋亡趨勢；同時Western Blot檢測結果也提示，健脾活血祛濕方促進AQP9、Bax表達增高、Bcl-2表達降低，增加促凋亡Bax與抗凋亡Bcl-2比值；Annexin V-FICT/PI結果也提示，健脾活血祛濕方可呈劑量依賴性地增高肝癌細胞凋亡率。

隨著對AQP9的進一步研究，尤其針對其在正常肝細胞和肝癌細胞的顯著差異表達，課題組自擬健脾活血祛濕方以研究該方基于AQP9促肝癌細胞凋亡的可能性。實驗結果均提示，健脾活血祛濕方能夠通過線粒體依賴途徑觸發(fā)肝癌細胞凋亡，這可能與AQP9具有一定相關性，但是否直接調控AQP9表達還需后續(xù)實驗的深入研究。