蘇黃止咳膠囊對大鼠慢阻肺模型NF-ΚB p65、TLR4及IAP1表達(dá)的影響

秦 豐，潘宏達(dá)，呂 爽，李艷平，封 紅

(包頭市第四醫(yī)院呼吸內(nèi)科,內(nèi)蒙古 包頭 014030)

慢性阻塞性肺病(慢阻肺)可見呼吸氣流受限不完全可逆且呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對香煙等有害氣體的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。慢阻肺和慢性支氣管炎密切相關(guān)，呼吸道反復(fù)病毒和繼發(fā)性細(xì)菌感染是導(dǎo)致慢性支氣管炎病變的重要致病因素，大氣污染也是引起慢性支氣管炎的重要原因，機(jī)體的抵抗力下降、呼吸系統(tǒng)防御受損是發(fā)病的內(nèi)在因素[2]。蘇黃止咳膠囊由麻黃、紫蘇葉、地龍、枇杷葉(蜜制)、紫蘇子(炒)、蟬蛻、前胡、牛蒡子(炒)、五味子組成，具有疏風(fēng)宣肺、止咳利咽的功效，用于風(fēng)邪犯肺、肺氣失宣所致的咳嗽、咽癢、氣急、遇冷空氣、異味等因素突發(fā)，多呈反復(fù)發(fā)作。本實(shí)驗(yàn)研究了蘇黃止咳膠囊對慢阻肺模型的影響，為蘇黃止咳膠囊的臨床應(yīng)用提供了藥效學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號SCXK(蒙)2016-0001。本實(shí)驗(yàn)已通過內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

蘇黃止咳膠囊購自北京海燕藥業(yè)有限公司，規(guī)格9粒/盒(0.45 g/粒)，每次3粒，每日3次；氨茶堿片(天津力生制藥股份有限公司，每次1～2片，每日3～6片；水合氯醛、檸檬酸鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

多聚甲醛、二甲苯、無水乙醇、檸檬酸(購自天津大茂化學(xué)試劑廠)，PBS磷酸緩沖液(北京Solarbio科技有限公司)，TMS-P超敏試劑盒(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，脂多糖(Sigma)，細(xì)胞核因子/k基因結(jié)合核因子單克隆抗體(nuclear factor kappa-B p65，NF-KB p65)，Toll樣受體4抗體(Toll-like receptors 4，TLR4)、凋亡抑制因子1抗體(inhibitor of apoptotic protein 1，IAP1)(購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

BX53型顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司);DHP-9032 35 L電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);KD-P型生物組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);切片機(jī)(德國徠卡)；動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)(北京吉安得爾科技有限公司);YG-280KX烤片機(jī)(湖北貝諾醫(yī)療科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備

將60只SPF級SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、蘇黃止咳膠囊低劑量組(0.36 g/kg)、蘇黃止咳膠囊中劑量組(0.72 g/kg)、蘇黃止咳膠囊高劑量組(1.44 g/kg)、氨茶堿片組(0.01 g/kg)。除空白對照組外，其余各組大鼠均制備慢阻肺模型。于實(shí)驗(yàn)第1天和第15天滴鼻注入0.2 ml LPS(1 g/L)溶液[3]，每天給予煙熏，用10支香煙熏10只大鼠，每次熏30 min[4]。造模第28天后開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)治療4周，末次給藥1 h，使用動(dòng)物呼吸功能測定儀測定大鼠最大呼氣流量(PEP)、1 s用力呼氣容積(FEV1)[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取肺臟用4% 多聚甲醛溶液固定，用于HE 染色及免疫組化染色。

2.2 肺臟HE染色

取肺組織于多聚甲醛溶液中固定24 h后，將肺組織從固定液中取出，脫水后石蠟包埋。石蠟切片經(jīng)二甲苯透明，常規(guī)脫蠟至水。用蘇木精染色5 min反藍(lán)，0.5% 伊紅液染色、脫水，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察肺組織炎性細(xì)胞浸潤并進(jìn)行炎癥病理學(xué)評分[6]。肺組織HE染色分級：0級：無炎癥；1級：輕度炎癥，炎性細(xì)胞浸潤；2級：中度炎癥，肺泡間隔增厚；3級：炎性細(xì)胞浸潤，病變范圍大于30%[7]。

2.3 免疫組化法檢測肺組織NF-ΚB p65、TLR4及IAP1表達(dá)

石蠟切片經(jīng)二甲苯透明，常規(guī)脫蠟至水。3% H202室溫孵育10 min[8]。蒸餾水沖洗，PBS緩沖溶液沖洗3次，每次5 min。滴加10% 山羊血清封閉，室溫孵育10 min傾去血清。滴加一抗(NF-ΚB p65抗體)，PBS稀釋比例為1∶450；TLR4抗體，PBS稀釋比例為1∶400；IAP1抗體，PBS稀釋比例為1∶350，37 ℃ 孵育2 h。PBS緩沖溶液沖洗3次，每次5 min。滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃ 孵育30 min。PBS緩沖溶液沖洗3次，每次5 min。滴加適量的辣根酶標(biāo)記的鏈霉素工作液，37 ℃ 孵育30 min。PBS緩沖溶液沖洗3次，每次5 min。DAB顯色劑顯色、沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片[8]，免疫組化圖片采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析[9]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 蘇黃止咳膠囊對慢阻肺模型大鼠肺功能的影響

表1示，與空白對照組比較，模型對照組PEP、FEV1顯著降低(P<0.01)；與模型對照組比較，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組、氨茶堿片組PEP顯著升高(P<0.05或0.01)；與模型對照組比較，蘇黃止咳膠囊低、中、高劑量組、氨茶堿片組FEV1顯著升高(P<0.05或0.01)。

3.2 蘇黃止咳膠囊對大鼠慢阻肺模型肺臟HE染色病理分級的影響

表2圖1示，與空白對照組比較，模型對照組HE染色病理分級顯著增加(P<0.01)；與模型對照組比較，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組、氨茶堿片組HE染色病理分級顯著降低(P<0.05或0.01)。

表2 各組肺臟HE染色病理分級比較

注：A．空白對照組；B．模型對照組；C．蘇黃止咳膠囊低劑量組；D．蘇黃止咳膠囊中劑量組；E．蘇黃止咳膠囊高劑量組；F．氨茶堿片組

3.3 蘇黃止咳膠囊對大鼠慢阻肺模型肺臟細(xì)胞NF-KB p65、TLR4、IAP1表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型對照組肺臟細(xì)胞NF-KB p65、TLR4、IAP1表達(dá)均顯著增加(P<0.01)；與模型對照組比較，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組和氨茶堿片組NF-KB p65、TLR4表達(dá)均顯著降低(P<0.05或0.01)；與模型對照組比較，蘇黃止咳膠囊各劑量組和氨茶堿片組IAP1表達(dá)均顯著降低(P<0.05或0.01)。

表 1 各組肺功能檢測結(jié)果比較

4 討論

有研究表明，蘇黃止咳膠囊口服可以改善慢阻肺患者的肺功能,提高生存質(zhì)量,減少慢阻肺患者再入院次數(shù)。蘇黃止咳膠囊聯(lián)合噻托溴銨能夠有效改善慢阻肺肺功能,減輕患者咳嗽、咳痰等癥狀,減輕呼吸困難,延緩氣道重塑[10]。蘇黃止咳膠囊聯(lián)合噻托溴銨對慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期的FEV1、FEV1/FVC、IL-6、IL-8均較前明顯改善[11]。在蘇黃止咳膠囊聯(lián)合小劑量茶堿治療風(fēng)邪犯肺型慢性阻塞性肺疾病的研究中，蘇黃止咳膠囊組咳嗽癥狀評分顯著改善,總有效率高,復(fù)發(fā)率低[12]。蘇黃止咳膠囊具有疏風(fēng)宣肺的功效，用于肺氣失宣所致的咳嗽，或用于氣急、遇冷空氣、異味、空氣污染等因素引起的咳嗽。肺氣腫是支氣管和肺疾病常見的并發(fā)癥，與吸煙、空氣污染、小氣道感染、塵肺等關(guān)系密切，慢性阻塞性細(xì)支氣管炎是引起肺氣腫的重要原因。本研究結(jié)果表明，蘇黃止咳膠囊中劑量組、蘇黃止咳膠囊高劑量組可顯著增加慢阻肺模型大鼠PEP及FEV1，具有改善慢阻肺模型大鼠肺功能的作用。

TLR受體是參與非特異性免疫的蛋白質(zhì)分子，TLR如同天然免疫的眼睛，監(jiān)視與識別各種不同的疾病相關(guān)分子，是機(jī)體抵抗感染性疾病的第一道屏障[13]。

機(jī)體最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞可表達(dá)TLR。借助TLR識別LPS、肽聚糖以及分支桿菌的細(xì)胞壁成分等具有PAMP的分子，樹突細(xì)胞被活化而成熟，提供獲得性免疫的共刺激信號，因此TLR是微生物成分引起樹突細(xì)胞活化的橋梁[14]。NF-κB是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，NF-κB通常以p65與 p50組成的異二聚體存在[15]。P65蛋白質(zhì)二聚化形成具有活性的NF-kB。在未受到刺激的細(xì)胞中NF-kB 二聚體通過與細(xì)胞質(zhì)中3個(gè)抑制因子結(jié)合，以無活性的狀態(tài)存在[16]。刺激信號可降解IkBs進(jìn)而活化NF-kB，依賴IKK-降解IkBs的活化途徑被稱為經(jīng)典的NF-kB活化途徑。凋亡抑制因子(inhibitor of apoptotic proteins，IAPs)主要通過抑制Caspase3、7、9等酶的活性而發(fā)揮阻斷凋亡的作用。IAPs 家族成員抑制細(xì)胞凋亡功能與NF-kB 的活化誘導(dǎo)信號強(qiáng)度呈正相關(guān)[17]。蘇黃止咳膠囊中劑量組、蘇黃止咳膠囊高劑量組大鼠肺臟TLR4表達(dá)顯著降低，提示蘇黃止咳膠囊可能通過阻斷LPS誘導(dǎo)TLR4表達(dá)，從而抑制脂多糖引起的炎癥反應(yīng)。HE染色及免疫組化染色結(jié)果表明，肺組織炎癥反應(yīng)程度與NF-KB p65表達(dá)呈正相關(guān)。蘇黃止咳膠囊中劑量組、蘇黃止咳膠囊高劑量組大鼠肺臟炎癥反應(yīng)級別與NF-KB p65表達(dá)均顯著降低，說明蘇黃止咳膠囊可能通過NF-KB通路調(diào)控外界刺激引起肺部的炎癥反應(yīng)。蘇黃止咳膠囊各組大鼠肺臟IAP1表達(dá)均顯著降低，可能與其抑制NF-KB的活化有關(guān)。綜上所述，蘇黃止咳膠囊可能通過改善肺功能，降低慢阻肺模型大鼠肺臟NF-KB p65、IAP1和TLR4的表達(dá)，從而減輕慢阻肺模型大鼠肺組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)，最終起到對慢阻肺模型大鼠肺臟的保護(hù)作用。

表 3 各組免疫組化染色肺臟細(xì)胞NF-ΚB p65、TLR4、IAP1表達(dá)(灰度值)比較

注：A．空白對照組；B．模型對照組；C．蘇黃止咳膠囊低劑量組；D．蘇黃止咳膠囊中劑量組；E．蘇黃止咳膠囊高劑量組；F．氨茶堿片組

注：A．空白對照組；B．模型對照組；C．蘇黃止咳膠囊低劑量組；D．蘇黃止咳膠囊中劑量組；E．蘇黃止咳膠囊高劑量組；F．氨茶堿片組

注：A．空白對照組；B．模型對照組；C．蘇黃止咳膠囊低劑量組；D．蘇黃止咳膠囊中劑量組；E．蘇黃止咳膠囊高劑量組；F．氨茶堿片組