基于高通量測序技術的脾虛腹瀉型腸易激綜合征小鼠與健康小鼠腸道菌群的差異研究*

丁姮月，朱惠萍，梁國強，張 川，連秋華，孫宏文△

(1. 南京中醫(yī)藥大學， 南京 210023； 2.南京中醫(yī)藥大學附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹痛、排便頻率與大便性狀改變?yōu)樘卣鞯呐R床常見的功能性胃腸道疾病，腹瀉為主的腸易激綜合征(IBS-D)是其主要亞型，其主要表現(xiàn)是腹痛和腹瀉[1]。IBS-D屬于中醫(yī)學“泄瀉”“鶩溏”“飧泄”“濡泄”“洞泄”“注下”“后泄”等范疇，其病因有外感、內(nèi)傷之分，外感中濕邪最為重要，內(nèi)傷中脾虛最為關鍵，因此脾虛濕盛是導致本病發(fā)生的關鍵因素。泄瀉的病位在脾、胃、腸，脾胃為泄瀉之本，脾主運化水濕，脾失健運、清氣不升、清濁不分自可成瀉，其他諸如寒、熱、濕、食等內(nèi)外之邪以及肝腎等臟腑所致的泄瀉都只有在傷脾的基礎上，導致脾失健運時才能引起泄瀉[2]。正如《景岳全書·泄瀉》曰：“泄瀉之本，無不由于脾胃?！蔽麽t(yī)方面，IBS-D的病因尚不完全明確，但大量的實驗研究提示，可能與胃腸道動力紊亂、內(nèi)臟感覺異常、中樞感覺異常、“腦-腸-菌”軸失調(diào)、腸道感染與炎癥反應、精神心理因素等相關[3]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與IBS-D的關系密切。近年來，16S rDNA基因高通量測序方法的發(fā)展，使學者們能夠?qū)δc道細菌進行較詳細的分析。本研究采用此技術，旨在觀察脾虛型IBS-D小鼠腸道菌群的變化情況。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級幼齡ICR雄性小鼠20只，40～50 d齡，體質(zhì)量(20±2) g，購自江蘇省蘇州市新區(qū)昭衍新藥研究中心有限公司，動物合格證號scxk(蘇)2013-0003。光暗每日各半，室溫控制在(23±2 )℃，相對濕度45%～70%。小鼠無菌標準飼料喂養(yǎng)，購自蘇州市雙獅實驗動物飼料科技有限公司，自由飼食、水，適應性喂養(yǎng)1周后備用。本研究已通過南京中醫(yī)藥大學附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查(批件號2017倫研批009)。

1.2 實驗藥物

戊巴比妥鈉(上?；瘜W試劑采購供應站分裝廠提供，sigma公司生產(chǎn)，批號20089104)；番瀉葉：蘇州市春輝堂藥業(yè)有限公司，批號170909。

1.3 實驗試劑

SYBR Green PCR試劑盒(貨號K0223)Thermo；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號，K1622)Fermentas；Trizol，(貨號1596-026)invitrogen；無水乙醇(貨號100092680)國藥集團產(chǎn)品；氯仿(貨號10023419)國藥集團；異丙醇(貨號80109218)國藥集團。

1.4 實驗儀器

352型酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS)；TG16 W離心機(國產(chǎn))微量高速離心機)；GNP-9080型培養(yǎng)箱(國產(chǎn))隔水式恒溫培養(yǎng)箱；Sigma 1-13微量離心機(美國Sigma公司)；AX-26DR萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ABI9700智能梯度PCR儀(ABI 美國)；Axygen 凝膠回收試劑盒(Axygen 美國)；FTC-3000TM real-time PCR(楓嶺 上海)；Miseq測序儀(Illumina 美國)等。

2 方法

2.1 實驗分組

隨機將20只清潔級幼齡ICR小鼠分為空白組(CK)與模型組(IBS-D)，CK組5只，IBS-D組15只。

2.2 動物造模

造模前每日定時記錄觀察小鼠的大便性狀，測量其飲食、體質(zhì)量并記錄一般情況。采用100%番瀉葉浸液(1 g生藥/ml)以10 ml/kg小鼠體積灌胃，每日2次，連續(xù)10 d，期間喂食不定時，飲食無常，制定脾虛型IBS-D模型[4-5]。

2.3 脾虛型IBS-D動物模型標準

主癥：泄瀉嚴重甚至脫肛;食少納呆；次癥：消瘦、體質(zhì)量減輕;神態(tài)萎靡，四肢不收，毛色枯槁;蜷縮聚堆;易疲勞。其中具備2項主癥、2項次癥即可確認脾虛型IBS-D造模成功[6]。

2.4 觀察及檢測指標

2.4.1 一般情況觀察 每天定時記錄造模前后小鼠的大便性狀、飲食及體質(zhì)量。

6) 外輸結束。當外輸油量達到既定值時，外輸結束，關閉外輸泵，常規(guī)油船將之前接收的水通過CTV打回到FPSO以沖洗油管，增壓泵旁通閥打開，外泄閥關閉，CTV軟管與常規(guī)油船斷開，并將油管中殘余的水排至CTV的污液艙，由拖船協(xié)助軟管回收到CTV的卷筒上。常規(guī)油船系泊解脫，CTV回收系泊纜索，斷開側(cè)裝載接頭，由拖船協(xié)助軟管回收到FPSO的軟管收放滾筒上。

2.4.2 小鼠腸道菌群的檢測 造模成功后，提取CK、IBS-D組小鼠腸道內(nèi)糞便，無菌操作收集于凍存管中。隨后稱取樣本質(zhì)量，采用組織勻漿器冰浴上勻漿并離心取上清液。最后對所有樣本進行基因組DNA抽提進行雙向測序，并采用兩步PCR擴增方法(表1)，將全部PCR產(chǎn)物采用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒進行回收，將樣本按照等摩爾比混勻后完成文庫制備，而后進行illumina miseq 2×300 bp高通量測序及生物信息學分析。

表1 PCR擴增引物序列

2.5 統(tǒng)計學方法

采用R 3.4.1語言作圖軟件剖析腸道菌群，采用SPSS 22軟件進行統(tǒng)計分析， wilcox、Ttest分析比較各組之間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 脾虛型IBS-D小鼠一般情況比較

表2、3示，模型組在造模過程中，均出現(xiàn)了主癥2項及次癥中至少2項。參照Bristol分型積分標準對造模前后小鼠的大便進行評分，結果表明模型組小鼠的Bristol積分值明顯高于空白組(P<0.05)，主要表現(xiàn)為水樣便；另對造模前后小鼠的進食量與體質(zhì)量進行統(tǒng)計比較，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的進食量與體質(zhì)量明顯低于空白組(P<0.05)。以上信息初步確認脾虛型IBS-D小鼠造模成功(表3)。

表2 Bristol分型積分標準

表3 小鼠造模前后數(shù)據(jù)結果比較

3.2 小鼠樣本的基因DNA質(zhì)控及PCR擴增

首先采用QIAamp DNA Stool Mini Ki方法對樣本進行基因組DNA提取，然后進行PCR擴增，文庫構建主要采用兩步PCR擴增方法。(1)一次擴增(圖1A)：電泳檢測條帶單一，片段長度與預期片段大小一致，且濃度適中，負對照無污染；(2)二次擴增(圖1B)：二次PCR擴增后條帶單一，亮度適中，每個條帶的分子量均在750～500 bp之間，符合預期結果，可進行后續(xù)凝膠回收實驗。

注：圖中每一條帶代表一個分子量，Marker為DL2000，從上至下條帶依次為2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp，上樣量為3 μL，亮帶為30ng/μL，其余條帶均為10ng/μL

3.3 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠細菌多樣性分析

3.3.1 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠細菌的測序深度分析 本實驗將相似性等于或大于97%的序列歸為同一單元OTU，并基于物種分類學信息，在門、界、綱、目、科、屬、種分類水平上分別進行群落結構的統(tǒng)計分析。為得出樣本的測序深度情況，使用mothur軟件進行稀釋性曲線(Rarefaction curve)的繪制。圖2示，所有樣本在測序量1000左右出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)折點，隨后即進入平緩期，說明本次測序深度充分，測序數(shù)據(jù)量大且合理，能反映出標本中的絕大部分生物信息。

注：橫坐標表示隨機抽取的測序量，縱坐標表示OUT數(shù)值

3.3.2 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠細菌的豐度、均勻度分析 為證明本次樣品細菌的多樣性達到實驗要求，進行了豐度等級圖(Rank-abundance)繪制。圖3示，大部分樣品曲線在水平方向較寬，下降趨勢較平緩，可見20例樣本中細菌豐度和均勻度皆較為合理。

注：橫坐標代表OTU數(shù)值，縱坐標表示OTU中序列數(shù)的相對百分含量

3.4 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠之間細菌多樣性比較

細菌多樣性主要采用基于OTU聚類結果進行Alpha多樣性(Alpha diversity)分析的方法，包括chao指數(shù)、ace指數(shù)、shannon指數(shù)以及simpson指數(shù)等。圖4示，這20例樣本中細菌的豐富度與多樣性均較高，且曲線都進入平臺期。

圖4 20例樣本腸道細菌的Alpha多樣性分析

圖5 20例樣本腸道細菌Alpha多樣性的差異性分析

3.5 脾虛型IBS-D小鼠與健康小鼠樣本間腸道菌群的物種信息及差異分析

3.5.1 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠腸道菌群在門水平上的分布及差異 表4示，對CK、IBS-D組的20個樣本進行菌群結構與差異分析，發(fā)現(xiàn)2組小鼠腸道菌群的構成存在差異，且各菌門的構成比不同；與健康小鼠比較，脾虛型IBS-D小鼠擬桿菌門、Saccharibacteria、藍藻門減少，變形菌門、疣微菌門增多(P均<0.05)。

表4 脾虛型IBS-D小鼠與健康小鼠樣本在門水平上物種相對豐度及差異分析

3.5.2 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠腸道菌群在屬水平上的分布及差異 表5示，本次實驗共在小鼠糞便中檢測出58種菌屬，選取CK、IBS-D組樣本中前27種優(yōu)勢菌群，分別統(tǒng)計其占比并繪制表格。結果發(fā)現(xiàn)，2組小鼠腸道菌群的構成存在差異，且各菌屬的構成比不同。進一步進行物種差異分析可以發(fā)現(xiàn)，與健康小鼠比較，脾虛型IBS-D小鼠另枝菌屬、乳酸菌屬、理研菌屬、Candidatus Saccharimonas、分節(jié)絲狀菌屬、瘤胃球菌屬、脫硫弧菌屬、Gelria減少，擬桿菌屬、阿克曼菌屬、Parasutterella、Lachnoclostridium、厭氧棍狀菌屬、Blautia、埃希氏菌屬、Erysipelatoclostridium、Parabacteroides、克雷伯氏菌屬、厭氧原體屬、Flavonifractor、Candidatus Stoquefichus、Anaerostipes、Epulopiscium、沙雷氏菌屬增多(P均<0.05)。

表5 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠樣本在屬水平上物種的相對豐度及差異分析

3.5.3 脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠腸道菌群各分類差異性分析 表6圖6示，為對脾虛型IBS-D小鼠和健康小鼠腸道菌群進行門、綱、目、科、屬、種6個分類匯總分析，采用組間群落差異分析方法(LDA Effect Size)。

注：這個由內(nèi)至外輻射的圓圈圖為聚類樹，依次代表由門、綱、目、科、屬、種的分類級別。在不同圓圈層上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈的直徑與該分類的相對豐度大小呈正比。該圖中，紅色區(qū)域表示CK組，綠色區(qū)域表示IBS-D組；樹枝中紅色、綠色節(jié)點分別表示在該組別中起到重要作用的微生物類群。圖中英文字母表示物種名稱在右側(cè)圖例中進行展示

表6 脾虛型IBS-D小鼠與健康小鼠樣本組間結構差異性分析

4 討論

IBS-D 屬于中醫(yī)“泄瀉”等范疇，古代醫(yī)家早已認識到泄瀉乃脾之功能失常所致。正如《素問·藏氣法時論篇》曰：“脾病者，虛則腹?jié)M，腸鳴，饗泄，食不化。”現(xiàn)代醫(yī)家亦對該疾病進行了中醫(yī)證候探究，黃紹剛等[7]經(jīng)聚類分析得知，IBS-D的主要證型為脾胃氣虛證、肝郁脾虛證、脾腎陽虛證、脾胃濕熱證；李梅等[8]認為， IBS 可分為脾胃虛弱、肝郁脾虛、肝脾不和、肝氣郁結、脾胃濕熱5型，可見脾胃虛弱及肝郁脾虛為IBS-D的常見證型，而此2型又以脾虛為基礎。脾失健運，升降失調(diào)，水谷不化，清濁不分，混雜而下，形成泄瀉。

IBS是一種常見的功能性胃腸道疾病，臨床根據(jù)大便性狀將其分為腹瀉型、便秘型、混合型與未定型4種類型，其中腹瀉型在我國發(fā)病率最高，是IBS最常見的類型[9]。近年來，越來越多的實驗致力于腸道微生物群的研究，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與IBS-D的關系密切。相關報道指出，一旦腸道菌群的動態(tài)平衡被打破，導致菌群失調(diào)，可能會引起腸道功能紊亂，從而導致IBS-D的發(fā)生[10]。

目前，學者們對脾虛型IBS-D腸道菌群的研究較為粗略，僅停留于較常見的數(shù)種細菌。江月斐等[11]發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D患者腸桿菌、腸球菌、酵母菌增多，雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、消化球菌減少。張衛(wèi)平等[12]指出，脾虛型泄瀉小鼠類桿菌、腸球菌增多，腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌減少。

因此，為進一步觀察脾虛型IBS-D小鼠腸道菌群的變化情況，此次研究對2組小鼠糞便進行了16S rDNA基因測序。結果發(fā)現(xiàn)與健康小鼠比較，脾虛型IBS-D小鼠的腸道菌群表現(xiàn)為大量有益菌的下降和有害菌的增加。

在門水平上發(fā)現(xiàn)，健康小鼠的擬桿菌門與厚壁菌門共占94.14%，而脾虛型IBS-D小鼠則占79.63%，較健康小鼠有所減少。報道指出，擬桿菌門與厚壁菌門不僅能夠促進碳水化合物的代謝與能量的吸收[13]，還能夠生成腸道自由基清除劑及炎癥調(diào)節(jié)因子，抑制腸道的氧化應激與炎癥反應，有效阻止胃腸疾病的發(fā)生與發(fā)展[14]。Bennet SMP等[15]表明，厚壁菌門與擬桿菌門比值的升高會引起腸道免疫活性的改變，從而導致IBS-D的發(fā)生。本次研究發(fā)現(xiàn)該比值升高了7.03%，與文獻報道相一致。變形菌門是細菌中最大的一門，包括大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等致病菌。報道指出，健康人腸道中變形菌門豐度較低，而在一些致病因素的作用下會誘發(fā)其大量增殖，產(chǎn)生促炎因子引起腸道炎癥[16]。Durbán A等[17]通過研究IBS-D患者腸道菌群的不穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，急性腹瀉的發(fā)生可能與變形菌門相關。本次研究發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠變形菌門增多，提示該菌門的增多與脾虛型IBS-D有一定的相關性。

在屬水平上發(fā)現(xiàn)，另枝菌屬隸屬于理研菌科、擬桿菌目、擬桿菌綱、擬桿菌門。漆靖等[18]指出，另枝菌屬的減少能夠使腸道通透性增加，導致腸道的炎癥。本實驗發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠另枝菌屬減少，提示該菌屬豐度的下降或與本疾病的發(fā)生發(fā)展相關。乳酸菌屬隸屬于乳酸菌科、乳酸菌目、芽孢桿菌綱、厚壁菌門，是益生菌的重要組成部分，對宿主具有促進消化、提升免疫力和抑制病原菌生長的益生特性[19]。本次實驗發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠乳酸菌屬減少，與以往研究結論相一致。理研菌屬隸屬于理研菌科、擬桿菌目、擬桿菌綱、擬桿菌門，徐航宇等[20]研究表明，潰瘍性結腸炎大鼠腸道菌群中理研菌屬豐度較高，其在該疾病的活動期發(fā)揮重要作用；而本次研究發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠理研菌屬減少，兩者結論不相符，尚待進一步探究。阿克曼菌屬隸屬于疣微菌科、疣微菌目、疣微菌綱、疣微菌門，Derrien M等[21]發(fā)現(xiàn)，其具有降低黏蛋白的作用，能夠破壞黏液層的完整性，從而破壞腸道黏膜屏障，導致IBS-D的發(fā)生。本次實驗發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠腸道中該菌屬增多，表明阿克曼菌屬可能與該疾病存在關聯(lián)。Chen YJ等[22]研究表明，IBS-D患者腸道菌群中Parasutterella顯著增加，指出該菌屬與慢性腸道炎癥相關，并認為其與IBS-D的發(fā)生發(fā)展有關。本實驗結果與之相符。

在種水平上發(fā)現(xiàn)，柔嫩梭菌隸屬于梭菌屬、梭菌科、梭菌目、梭菌綱、厚壁菌門，是腸道內(nèi)重要的有益菌，可促進腸系膜的修復，增強機體的免疫力，抑制炎癥因子的形成[23]。Lopez-Siles M等[24]指出，IBS患者體內(nèi)的柔嫩梭菌低于健康人。本研究亦發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠柔嫩梭菌減少，其為健康小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群，與文獻報道相一致。艱難梭菌隸屬于梭菌屬、梭菌科、梭菌目、梭菌綱、厚壁菌門，其主要通過產(chǎn)生毒素A、毒素B、二元毒素致病，從而導致腹瀉或偽膜性結腸炎[25]。本次實驗亦發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D小鼠腸道中艱難梭菌增多，表明艱難梭菌或與脾虛型IBS-D的發(fā)生發(fā)展相關。

本研究提示，16S rDNA測序技術能夠滿足小鼠腸道微生態(tài)的研究需求。盡管本次實驗樣本數(shù)量較少，但已基本闡明脾虛型IBS-D小鼠與健康小鼠的腸道菌群比較已發(fā)生明顯的偏移。與健康小鼠比較，脾虛型IBS-D小鼠腸道菌群的豐富度與多樣性均降低。在門、綱、目、科、屬、種6個分類水平上，2組小鼠的菌群構成及構成比皆存在差異，脾虛型IBS-D小鼠表現(xiàn)為大量有益菌的下降、有害菌的增加。由于本研究受客觀條件的限制，并未對脾虛型IBS-D小鼠菌群改變的具體因果關系進行研究，未來可加大樣本數(shù)量進一步分析探討。