紅糖、白砂糖、赤砂糖與黑糖的HPLC指紋圖譜與化學(xué)模式識別

蔡瑋琦，左雯雯，陸 楊，黃勝良，李存玉,3，鄭云楓,3，彭國平,3,*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇融昱藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安 223200；3.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023）

紅糖是由甘蔗的汁液經(jīng)過簡單加工后制作而成的產(chǎn)物，在不同地區(qū)有不同的名稱，如“jaggery（棕櫚糖）”、“panela”、“non-centrifugal sugar（非離心糖）”，并且生產(chǎn)工藝也略有不同[1]。在明代宋應(yīng)星所著的《天工開物》卷六（《甘嗜》）中，就已詳細(xì)記述了種蔗、制白糖與紅糖的方法[2]?，F(xiàn)今，由于糖的過度攝入，導(dǎo)致了肥胖等一系列問題，甚至產(chǎn)生成癮性[3]。人們開始更多的將關(guān)注點(diǎn)放在了功能性紅糖、黑糖上，不僅具有甜味，且含有大量的生物活性成分，可以增強(qiáng)免疫力、保護(hù)細(xì)胞、降低糖尿病和高血壓的發(fā)病率等[4-6]。有學(xué)者已經(jīng)提出是否可以將紅糖作為白砂糖的替代品[7]，或開發(fā)富含植物源性生物活性成分的糖類增值產(chǎn)品[8]，以期獲得更高的商品價值。

白砂糖與赤砂糖中所含的酚類物質(zhì)，主要是甘蔗中的天然色素，赤砂糖中的酚類物質(zhì)稍多，約為白砂糖的1～3 倍，但在實(shí)際生產(chǎn)加工過程中，糖廠會去除酚類化合物使產(chǎn)品更加穩(wěn)定[9]。紅糖與黑糖在熬制過程中，發(fā)生美拉德反應(yīng)，改善風(fēng)味和感官質(zhì)量的同時也更多的產(chǎn)生了具有抗氧化、抗炎等功能的多酚類和黃酮類的化合物[10-12]，并且由于黑糖熬制時間更久且含有豐富的鐵元素，使其呈現(xiàn)出黑褐的顏色[13]。如今，許多糖類的關(guān)聯(lián)產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，消費(fèi)者追求更高品質(zhì)的糖，但仍然無法區(qū)分市面上銷售的糖的種類[14]，相當(dāng)多關(guān)于糖類的錯誤信息仍然需要糾正。

本研究在確立的紅糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上[15]，通過對紅糖、白砂糖、赤砂糖和黑糖的非糖部分進(jìn)行的指紋圖譜測定，并通過指紋圖譜結(jié)合模式識別（聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交最小二乘法判別分析）進(jìn)行綜合分析[16-19]，將白砂糖、紅糖、赤砂糖以及黑糖進(jìn)行區(qū)分，以期為其質(zhì)量控制與評價、生產(chǎn)以及消費(fèi)者的選擇提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、三氟乙酸（均為色譜純） 德國Merck公司；反-烏頭酸（批號：10210049）、順-烏頭酸（批號：10213040） 美國Alfa Aesar公司；重蒸水由Milli-Q超純水儀制得，其余試劑均為分析純。30 批次樣品信息見表1。

表 1 30 批紅糖樣品廠家及批號Table 1 Manufacturers and batch numbers of 30 batches of samples tested in this study

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance e2695高效液相色譜儀（配有Waters 2998二極管陣列檢測器）、Empower 3色譜工作站 美國Waters公司；Triple TOFTM5600型質(zhì)譜儀 美國AB Sciex公司；FA1004型萬分之一電子天平、Anke TGL-16B臺式離心機(jī) 上海安亭電子儀器廠；B807438265十萬分之一電子天平 美國Mettler-Toledo公司；KH-250B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

采用Durashell C18-AM親水性色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行分析，以乙腈（A）-0.1%三氟乙酸（B）為流動相，梯度洗脫見表2，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長210 nm。

表 2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取順-烏頭酸、反-烏頭酸對照品適量，加水溶解，即得。

1.3.3 供試品溶液的制備

取本品1 g，精密稱定，于具塞錐形瓶中，加水10 mL，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液即得。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～2 000；噴霧電壓5 500 V；解簇電壓100 V；碰撞電壓40、20 V；離子源溫度600 ℃；霧化氣壓力413.7 kPa；輔助加熱氣壓力413.7 kPa；氣簾氣壓力275.8 kPa。

1.3.5 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性測定

稱取同一批次紅糖樣品6 份（S10），并按照1.3.3節(jié)供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，取其中一份樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次，取另一份樣品分別在0、2、4、8、12、24 h的不同時間點(diǎn)進(jìn)樣檢測，按照1.3.1節(jié)指紋圖譜色譜條件分別進(jìn)行檢測，選擇9號峰作為參照，并分別計算該樣品中共有峰的相對峰面積和相對保留時間，并計算精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 相似度分析

經(jīng)測定精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性檢測RSD均小于3%，儀器良好。將30 批樣品按1.3.3節(jié)方法制備供試品溶液，在1.3.1節(jié)條件下進(jìn)樣，對其紫外色譜指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行比較。將30 批圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）”。結(jié)果，紅糖相似度大于0.995，白砂糖相似度均小于0.261，赤砂糖相似度為0.171～0.881，批次間的差異很大，而黑糖的相似度為0.800、0.983與0.983?？紤]到4 種糖之間成分差異性較大，而除赤砂糖外，同種之間差異較小。因此，不能建立同一指紋圖譜，而應(yīng)各自進(jìn)行分析比較。

2.2 指紋圖譜的建立

將30 批圖譜按類別分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）”進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。紅糖（S1～S10）的相似度為0.994、1、0.999、0.983、1、1、0.999、1、0.959、0.989；白砂糖（S11～S17）的相似度為0.955、0.981、0.979、0.979、0.980、0.979、0.658；赤砂糖（S18～S27）的相似度為0.997、0.953、0.989、0.944、0.839、0.998、0.979、0.959、0.976、0.993；黑糖（S28～S30）的相似度為0.947、1、0.999?？梢钥闯觯N糖成分接近，而4 種糖間差異較大。

圖 1 4 類糖高效液相色譜指紋圖譜Fig. 1 HPLC fingerprints of 30 samples of four types of sugars

2.3 共有峰的標(biāo)定與分析

根據(jù)10 批紅糖樣品、7 批白砂糖樣品、10 批赤砂糖樣品以及3 批黑糖樣品分別生成相對應(yīng)的對照圖譜，由于4 種糖在同類別中的差異不大，相似度很高，所以可以將對照圖譜代替各類樣品進(jìn)行比對，結(jié)果見圖2。按保留時間排序，共有17 個峰。紅糖中共有峰13 個，白砂糖中共有峰1 個，赤砂糖中共有峰7 個，黑糖中共有峰17 個。其中2、5、6、7、9、14、16號峰為紅糖、赤砂糖和黑糖共有峰，紅糖和黑糖的6號和9號峰較高。根據(jù)圖譜可以看出，赤砂糖更接近于白砂糖，除糖類以外其他成分的含量很低；紅糖與黑糖基本類似，共有峰14 個，這與相似度結(jié)果基本一致。

圖 2 4 種糖對照圖譜Fig. 2 Typical chromatograms of four types of sugars

2.4 聚類分析

將30 批樣品色譜圖數(shù)據(jù)量化后導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件中，以“Single linkage”模式為距離計算方式，以“size”為分類方式，對數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果見圖3。4 類糖基本可以單獨(dú)分類。當(dāng)歐氏距離為4.5時，黑糖就可以與其他3 類糖進(jìn)行區(qū)分，當(dāng)歐氏距離為4時，可以分出紅糖和白砂糖與赤砂糖（S11～S27）兩大類。并且，當(dāng)度量距離為0.5時，赤砂糖與白砂糖基本分開，但S19、S21和S22均被歸類為白砂糖，所以再次證明了市場上的某些品牌的赤砂糖與白砂糖并無明顯差異。

圖 3 30 批樣品聚類樹狀圖Fig. 3 Dendrogram obtained from cluster analysis of 30 batches of samples

2.5 PCA結(jié)果

圖 4 30 批樣品PCA圖Fig. 4 PCA plot for 30 batches of samples

將30 批樣品色譜圖數(shù)據(jù)量化后導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件中，若在該保留時間下無對應(yīng)色譜峰，則將峰面積定為0。PCA采用了無監(jiān)督模式識別，選擇前2 個PC進(jìn)行區(qū)分。具體結(jié)果見圖4。以中軸為分界，左側(cè)為白砂糖和赤砂糖；右側(cè)為黑糖與紅糖，且黑糖與紅糖也可以區(qū)分開，以x軸為分界時，上方為黑糖，下方為紅糖。

2.6 正交最小二乘法判別分析

圖 5 變量重要性投影圖Fig. 5 VIP plots of OPLS-DA for brown sugar versus red granulated sugar and black sugar

通過聚類分析、PCA以及相似度分析后，可以看出白砂糖與赤砂糖并無太大區(qū)別，可以將其歸為一類。所以，為了更進(jìn)一步的看出紅糖與赤砂糖以及紅糖和黑糖之間的成分差異，選擇正交最小二乘法判別分析，生成變量重要投影，對這3 類糖進(jìn)行兩兩分析，結(jié)果見圖5。以變異權(quán)重參數(shù)（variable importance in projection，VIP）值大于1作為標(biāo)準(zhǔn)，得出各標(biāo)定峰對于區(qū)分作出的貢獻(xiàn)程度。

在紅糖和赤砂糖的對比中，起主要區(qū)別作用的峰分別為峰9以及峰6（按影響大小排序），且2 個峰為紅糖與赤砂糖的共有峰。在紅糖和黑糖進(jìn)行對比時，峰13、峰10、峰15、峰11（按影響大小排序）的貢獻(xiàn)較大。4 個峰均為黑糖獨(dú)有峰。因此，可以據(jù)此6 個峰，對幾種糖類樣品進(jìn)行鑒別。

2.7 共有峰定性分析

為了進(jìn)一步確定共有峰成分，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[20-21]結(jié)合對照品進(jìn)行比對。9號色譜峰成分：高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜給出其準(zhǔn)分子離子峰m/z175.2[M+H]+，確定其分子式為C6H6O6。1H核磁共振（nuclear magnetic resonance ，NMR）（D2O，500 MHz），δ3.890（1H，d，H-2），δ4.878（1H，dd, H-3），δ7.051（1H，s，H-1）。13C NMR（D2O，125 MHz），δ33.36（C-4），δ130.66（C-2），δ139.06（C-3），δ168.77（C-4），δ169.52（C-6），δ174.69（C-5）。上述1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與SciFinder數(shù)據(jù)庫中的反-烏頭酸的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為反-烏頭酸，結(jié)構(gòu)見圖6。

圖 6 反-烏頭酸結(jié)構(gòu)圖Fig. 6 Structure of trans-aconitic acid

進(jìn)一步，采用反-烏頭酸和順-烏頭酸對照品進(jìn)行標(biāo)定，紅糖對照圖譜中特征峰6號和9號的成分確認(rèn)，見圖7。

圖 7 紅糖、黑糖對照圖譜特征峰的成分確認(rèn)Fig. 7 Confirmation of the characteristic peaks of brown sugar and black sugar

3 討論與結(jié)論

許多紅糖相關(guān)的產(chǎn)品不斷開發(fā)出來，僅紅糖本身的分類較多，許多紅糖標(biāo)注古法制造，亦或是原生態(tài)紅糖，以求提高產(chǎn)品價值[7-8,22-23]。市場上主要存在的赤砂糖、紅糖以及黑糖，價格和質(zhì)量參差不齊，沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，為消費(fèi)者的選擇帶來了很大困擾。

本實(shí)驗(yàn)選擇課題組前期建立的藥用輔料紅糖紫外指紋圖譜[15]，較為全面地考察4 個不同品種市售的糖的成分以及含量，并且通過化學(xué)模式識別，判斷4 類糖成分是否有明顯差別。

結(jié)果表明，赤砂糖和白砂糖基本一致，與紅糖和黑糖的差異明顯，成分主要差異在峰6和峰9上。紅糖與黑糖成分類似，但仍能夠通過峰13、峰10、峰15、峰11（按影響大小排序）明顯區(qū)分。

白砂糖主要以甘蔗、甜菜或原糖為原料，通過榨汁、過濾等一步或兩步沉淀后得到的。而赤砂糖則是生產(chǎn)白砂糖時的副產(chǎn)品[24]，這類赤砂糖在市場上售賣時，也標(biāo)注為紅糖。古法或者純手工制作的紅糖從榨汁到過濾熬糖、起糖的整個過程沒有水參與，保留了甘蔗中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)的同時，口感香氣更佳[25-26]。黑糖則是熬制時間更久的紅糖，在相應(yīng)的國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，黑糖的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和要求比紅糖更高。Qu Ruijing等[27]在甘蔗汁的渾濁沉淀中分析出，其主要是多糖、蛋白質(zhì)、酯類、膠體和多酚，并有少量的無機(jī)元素，Wang Liwen等[28]發(fā)現(xiàn)甘蔗提取物中主要成分為表兒茶素的多酚物質(zhì)，可以抗組織纖維化。紅糖和黑糖在生產(chǎn)加工時，并不需要徹底精制或是沉淀過濾，其甘蔗原有的多酚類物質(zhì)保留較多，從生產(chǎn)工藝與化學(xué)模式識別的結(jié)果結(jié)合推測分析，不同糖的加工生產(chǎn)工藝以及熬制的時間可能是造成其成分差異以及藥理活性差異的原因之一。這為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供了方向和思路。

幾種糖的差異以及區(qū)分已經(jīng)有較多研究[29]，但并沒有通過數(shù)據(jù)證實(shí)其從成分含量上的具體區(qū)別。并且，市面上也存在售假或者虛假宣傳的現(xiàn)象[30-31]，白砂糖與赤砂糖主要滿足的顧客需求與紅糖和黑糖有著明顯差異，廣大消費(fèi)者應(yīng)該注意所購買的糖是否達(dá)到預(yù)期購買愿望，滿足自身需求。

本實(shí)驗(yàn)建立紅糖、白砂糖、赤砂糖、黑糖的指紋圖譜，并通過化學(xué)模式識別（聚類分析、PCA和正交最小二乘法判別分析），發(fā)現(xiàn)白砂糖與赤砂糖較為相似，赤砂糖S19、S21和S22在聚類分析時可歸為白砂糖。赤砂糖與紅糖、黑糖之間的差異較大，通過峰6與峰9的含量高低可以進(jìn)行區(qū)分；紅糖與黑糖較為相似，有13 個共有峰，但可以通過是否有峰13、峰10、峰15、峰11（按影響大小排序）進(jìn)行區(qū)分。該方法為紅糖、白砂糖、赤砂糖、黑糖的鑒定、區(qū)分以及品質(zhì)評價提供了新的思路。