載氣類型對氣相色譜法分離順-反脂肪酸異構(gòu)體的影響

裴紫薇，楊 杰，張 磊，周 爽，趙云峰，陳達(dá)煒，苗 虹，方從容,*

（1.國家衛(wèi)生健康委員會食品安全風(fēng)險評估重點實驗室，國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京 100021；2.廣州市花都區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510800）

食品中反式脂肪酸（transfatty acids，TFA）主要是指部分氫化植物油、反芻動物的牛奶和肉類產(chǎn)品脂肪中的C18:1TFA異構(gòu)體，食用油加工中除臭步驟導(dǎo)致全順式多不飽和脂肪酸中雙鍵異構(gòu)化產(chǎn)生的C18:2TFA和C18:3TFA異構(gòu)體。流行病學(xué)研究已揭示TFA攝入過多可增加心血管疾病的風(fēng)險，因此，食品營養(yǎng)標(biāo)簽規(guī)定必須標(biāo)出TFA的含量[1-5]。2018年世界衛(wèi)生組織將評估和監(jiān)測食品供應(yīng)中TFA的含量及人群中TFA消費量的變化列為13 個工作規(guī)劃的優(yōu)先目標(biāo)之一，因此準(zhǔn)確定量TFA含量極為重要。

氣相色譜-火焰離子化檢測法是國際上油脂中TFA、飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）最常用的定量技術(shù)。通用檢驗方法包括美國石油化學(xué)家學(xué)會（American Oil Chemists Society，AOCS）AOCS Ce 1h-05[6]、AOCS Ce 1j-07[7]，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Standards Organization，ISO）ISO 12966[8]、BS ISO 16958:2015[9]和美國分析化學(xué)家協(xié)會（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）AOAC 2012.13[10]等，分析柱是涂有極性氰基烷基聚硅氧烷固定相的100 m毛細(xì)管柱如CP-Sil88或SP-2560，操作溫度為等溫180 ℃或梯度溫度程序，能分離出油脂中大多數(shù)脂肪酸的順式異構(gòu)體和相應(yīng)的反式異構(gòu)體[6-11]，油脂中的TFA、SFA、MUFA和PUFA同時被分析并定量。我國食品中的TFA和其他脂肪酸（SFA、MUFA和PUFA）測定方法分屬不同的標(biāo)準(zhǔn)，方法間實驗條件也不同，其中包括色譜分離所用載氣。AOCS Ce 1f-96-2001[11]載氣為氫氣、氦氣和氮氣，但I(xiàn)SO、AOCS和AOAC方法中[6-10]的載氣為氫氣和氦氣，特別是ISO 12966:4-2015中明確指出載氣不能為氮氣[8]。GB 5009.257—2016《食品中反式脂肪酸的測定》[12]的載氣為氦氣，而GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》[13]、GB 5413.27—2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定》[14]和GB 5413.36—2010《嬰幼兒食品和乳品中反式脂肪酸的測定》[15]3 個方法的載氣為氮氣。TFA和順式脂肪酸異構(gòu)體的最佳分離條件受色譜柱型號、色譜柱溫度、載氣類型、入口壓力以及進(jìn)樣濃度等參數(shù)的影響，在以往研究中色譜柱極性及溫度敏感性對分離TFA和順式脂肪酸異構(gòu)體的影響已有報道[16-21]，但載氣的類型對TFA分離的影響鮮有報道，針對國標(biāo)TFA和其他脂肪酸分析方法[12-15]中載氣應(yīng)用不統(tǒng)一，特別是GB 5413.36—2010推薦載氣為氮氣的情況，本研究選擇C18:1單個TFA異構(gòu)體間含量差異較大的起酥油、黃油、餅干和蛋糕4 種樣品和含有C18:2TFA、C18:3TFA的植物油樣品，在等溫180 ℃和梯度溫度2 種操作溫度條件下，分別以氮氣和氦氣為載氣，考察載氣的類型對順反式脂肪酸異構(gòu)體的分離和準(zhǔn)確定量的影響，以滿足食品營養(yǎng)標(biāo)簽中對TFA定量的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

起酥油、黃油、餅干、蛋糕和植物油 市購。

52 種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（GLC 674）、二十一碳酸甘油三酯（內(nèi)標(biāo)，純度≥99.0%） 美國Nu-Chek Prep公司；亞油酸甲酯異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品（10 mg/mL，C18:29t,12t、C18:29c,12t、C18:29t,12c和C18:29c,12c）（Catalog No 47791）、亞麻酸甲酯異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品（10 mg/mL，C18:39t,12t,15t、C18:3 9t,12t,15c、C18:3 9t,12c,15t、C18:3 9c,12t,15t、C18:3 9c,12c,15t、C18:39c,12t,15c、C18:39t,12c,15c和C18:39c,12c,15c）（Catalog No.47792） 美國Supelco公司；C18:1順-反脂肪酸異構(gòu)體混標(biāo)（2.5 mg/mL）（Catalog No. 40495-U） 美國Sigma公司；乙醚、石油醚、乙醇、異辛烷（均為色譜純）美國Fisher Chemical公司；鹽酸 北京化工廠；焦性沒食子酸、氫氧化鉀（均為優(yōu)級純），硫酸氫鈉（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890氣相色譜儀（配火焰離子化檢測器） 美國安捷倫科技有限公司；HH-6型水浴鍋（40～100 ℃） 北京科偉永興儀器有限公司；B-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；VORTEX-2渦旋混合器 美國Scientific Industries公司；3K15離心機(jī) 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 GC條件

CP-Sil88色譜柱（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；溫度程序1：等溫180 ℃，保持60 min；溫度程序2：120 ℃，持續(xù)10 min；以3 ℃/min升至180 ℃；以1.5 ℃/min升至200 ℃，保持3 min；再以2 ℃/min升至225 ℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度240 ℃；檢測器溫度250 ℃；高純氦氣（純度＞99.999%）；高純氮氣（純度＞99.999%）；恒壓模式，壓力38 psi；分流比100∶1；進(jìn)樣量1.0 μL。

1.3.2 樣品前處理

市購固體樣品用研磨機(jī)粉碎，于-20 ℃以下冷凍保存，分析時將其解凍后，在室溫條件下使用。

黃油、餅干和蛋糕樣品處理采用GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》[13]酸水解提取-酯交換法：稱取均勻試樣0.5～1.5 g（精確至0.1 mg，約含脂肪60～100 mg）移入到125 mL三角瓶中。加入約100 mg焦性沒食子酸，再加入2 mL 95%乙醇溶液和4 mL水，混勻。加入鹽酸溶液10 mL混勻。將三角瓶放入70～80 ℃水浴中水解40 min。每隔10 min振蕩三角瓶，使黏附在三角瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出三角瓶冷卻至室溫。加入10 mL 95%乙醇溶液，混勻。將水解液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中加入25 mL乙醚，振搖1 min，再加入25 mL石油醚振搖1 min，靜置10 min，將醚層提取液收集到150 mL燒瓶中。按照以上步驟重復(fù)提取水解液1 次。全部提取液收集到150 mL燒瓶中，準(zhǔn)確加入2.0 mL C21:0TAG內(nèi)標(biāo)溶液3.00 mg/mL，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘留物為脂肪提取物。將脂肪提取物用7 mL異辛烷溶解并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入350 μL氫氧化鉀-甲醇溶液，蓋上塞猛烈振搖30 s后靜置至澄清。加入約1 g硫酸氫鈉，猛烈振搖。4 000 r/min離心5 min，將上層溶液移至進(jìn)樣瓶中，待測。

起酥油和植物油樣品：稱取0.1 g樣品于50 mL燒瓶中，準(zhǔn)確加入2.0 mL C21:0TAG內(nèi)標(biāo)溶液3.00 mg/mL，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干。用7 mL異辛烷溶解并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入350 μL氫氧化鉀-甲醇溶液，蓋上塞猛烈振搖30 s后靜置至澄清。加入約1 g硫酸氫鈉，猛烈振搖。4 000 r/min離心5 min，將上層溶液移至進(jìn)樣瓶中，待測。

1.3.3 順-反脂肪酸甲酯異構(gòu)體的確證和定量

取C18:1、C18:2和C18:3順-反脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入氣相色譜儀。C18:1順-反脂肪酸異構(gòu)體混標(biāo)（40495-U，2.5 mg/mL）中單個C18:1反式異構(gòu)體出峰順序的識別和定量區(qū)間根據(jù)BS ISO 16958:2015[9]和AOAC 2012.13[10]，C18:2和C18:3順-反異構(gòu)體根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)保留時間對色譜峰進(jìn)行定性，采用內(nèi)標(biāo)（C21:0）-響應(yīng)因子法定量。單個C18:1反式異構(gòu)體加和為C18:1TFA總量，單個C18:2反式異構(gòu)體加和為C18:2TFA總量，單個C18:3反式異構(gòu)體加和為C18:3TFA總量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每組數(shù)據(jù)重復(fù)3 次，利用Origin 8.5軟件處理數(shù)據(jù)作圖。利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行配對t檢驗及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TFA異構(gòu)體的分離度及含量

2.1.1 C18:1TFA異構(gòu)體分離度

反式C18:1脂肪酸異構(gòu)體位于4t～11t雙鍵位置的峰很容易與油酸甲酯（C18:19c）的峰分離，但雙鍵位置位于12t～14t之間的反式C18:1異構(gòu)體的峰易與C18:19c的峰重疊[21]，因此，BS ISO16958:2015[9]和AOAC 2012.13[10]中規(guī)定當(dāng)C18:1TFA含量不小于0.5 g/100 g時，C18:113t,14t(6-8c)與C18:19c的分離度不小于（1.00±5）%。根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]提供分離度的計算公式，分別計算出順-反C18:1異構(gòu)體混標(biāo)40495-U（2.5 mg/mL）、4 種樣品（起酥油、黃油、餅干和蛋糕）分別在2 種載氣2 種溫度條件下分離度。如表1、圖1所示，以氦氣為載氣，40495-U標(biāo)準(zhǔn)溶液和4 種樣品在等溫180 ℃和梯度程序升溫條件下的分離度范圍分別為1.20～1.58和1.02～1.20，都達(dá)到分離度的要求，且等溫分離度大于梯度升溫。以氮氣為載氣，40495-U標(biāo)準(zhǔn)溶液和4 種樣品在等溫180 ℃條件下分離度范圍為0.93～1.34，除餅干略低于0.95外，其他樣品都達(dá)到了分離度要求；梯度程序模式下，餅干樣品中的分離度為0.67，其他樣品由于C18:113t,14t(6-8c)與C18:19c峰重疊，因此無分離度。從TFA和其他脂肪酸分離的效率及柱效角度考慮，氫氣是最適合的載氣，因此國際通用方法推薦的載氣首推為氫氣，其次為氦氣。但氫氣因其自身安全性的問題，在國內(nèi)較少使用。氦氣的分離效率好于氮氣，這在色譜柱對同分異構(gòu)體進(jìn)行拆分時表現(xiàn)尤為重要[22]，通過分離度結(jié)果也表明，氦氣為載氣可以滿足不同溫度操作條件的要求，而氮氣只適用于等溫操作條件，因此以氦氣為載氣優(yōu)于以氮氣為載氣。

表 1 2 種載氣2 種溫度操作條件下C18:1異構(gòu)體分離度（n=3）Table 1 Resolution of C18:1 isomers using two carrier gases under two temperature modes (n= 3)

圖 1 不同樣品C18:1順反異構(gòu)體甲酯色譜分離譜圖Fig. 1 Chromatograms of methyl esters of C18:1 isomers in cake samples

2.1.2 C18:1TFA異構(gòu)體計算結(jié)果

表 2 2 種載氣2 種溫度操作條件下C18:1 TFA異構(gòu)體含量（n=3）Table 2 C18:1 TFA isomer contents determined using different carrier gases under different temperature conditions (n= 3)%

采用內(nèi)標(biāo)-響應(yīng)因子法對4 種樣品中的單個C18:1TFA異構(gòu)體定量，再將單個TFA異構(gòu)體加和計算出樣品中總TFA含量。如表2所示，以氦氣為載氣，C18:14t～C18:114t反式異構(gòu)體在等溫180 ℃和梯度程序升溫2 個分離條件下全部檢出，配對樣品t檢驗結(jié)果顯示P值大于0.05，C18:1TFA總量無顯著性差異，且單個TFA異構(gòu)體分離清晰，能顯示出C18:1TFA異構(gòu)體的構(gòu)成，如起酥油樣品中C18:110t含量為主，黃油樣品中C18:111t含量最高；餅干樣品中C18:1的6-8t、10t、13t,14t(6-8c)含量相當(dāng)，蛋糕樣品中C18:16-8t～13t,14t(6-8c)各異構(gòu)體含量差異不大。以氮氣為載氣，2 種溫度條件下，C18:19t、C18:110t和C18:111t三個異構(gòu)體峰幾乎全部重疊或勉強(qiáng)能識別；等溫180 ℃條件下，配對樣品t檢驗結(jié)果顯示P值大于0.05，C18:1TFA總量與氦氣測定結(jié)果下的總量無差異，而梯度升溫條件下，起酥油、黃油和蛋糕樣品中由于C18:113t,14t(6-8c)與C18:19c重疊沒有檢出，因此C18:1TFA總量明顯低于氦氣條件下測定的總量，但餅干樣品，雖然C18:113t,14t(6-8c)與C18:19c的分離度只有0.67，但因為C18:113t,14t(6-8c)與C18:19c的含量僅相差1 倍，因而這兩異構(gòu)體能較明顯分離，C18:1TFA總量與氦氣條件下的總量基本無差異，可見除分離度外，C18:19c含量的高低也是能否準(zhǔn)確定量C18:1TFA影響因素之一。

以氦氣為載氣，能分離出大部分C18:1TFA異構(gòu)體，并獨立定量，這對于反芻動物衍生的食品（尤其是乳脂）尤為重要，因為C18:111t是主要的C18:1TFA異構(gòu)體，約占總反式C18:1異構(gòu)體的30%～50%，其對人類的潛在健康益處與其作為順式共軛亞油酸（C18:29c,11t）前體的作用有關(guān)[21,23-25]。C18:110t是另一種值得注意的C18:1TFA異構(gòu)體，其在牛奶和肉類中的含量等于或大于C18:111t的含量，當(dāng)某些飲食不適合反芻動物時，表明存在替代的生物氫化途徑，C18:110t與C18:111t不同，不會對人類產(chǎn)生任何有益的健康影響[25-29]。含有部分氫化植物油的食品中，主要的TFA也是C18:1異構(gòu)體，C18:19t占反式-C18:1總異構(gòu)體的20%～30%[5]?，F(xiàn)在，國際上通用方法都要求準(zhǔn)確測量TFA單個異構(gòu)體含量，特別是C18:1TFA異構(gòu)體，GB 5009.257—2016也要求對C18:1TFA中的6t、9t、11t準(zhǔn)確定量。氮氣為載氣，等溫180 ℃條件下可以滿足TFA定量的要求，但等溫分析中短鏈脂肪酸如C4:0等易和溶劑峰重疊，而長鏈脂肪酸如C22:6n3則洗脫時間長，因此樣品適用范圍窄。本研究通過實驗證明氦氣替代氮氣作為同時測定于食品中的TFA、SFA、MUFA和PUFA的載氣，C18:1TFA異構(gòu)體的分離度高，定量結(jié)果準(zhǔn)確，樣品適用性廣。

2.1.3 C18:2TFA和C18:3TFA的分離度及含量

選擇植物油為樣品，分別考察在2 種載氣2 種溫度操作條件下C18:2TFA和C18:3TFA的分離度和含量。如表3、圖2所示，載氣類型和不同的溫度操作條件對C18:2TFA異構(gòu)體的分離和定量影響不大，定量結(jié)果無差異。在2 種載氣2 種溫度條件下，大多數(shù)C18:3TFA異構(gòu)體分離度無區(qū)別，C18:39t,12c,15c與C20:1基線分離，C18:3TFA異構(gòu)體總量無差異，但以氦氣為載氣，C18:39t,12t,15c和C18:39t,12c,15t之間有可見的分離，與氮氣相比有一定優(yōu)越性。

表 3 不同條件下C18:2 TFA和C18:3 TFA含量（n=3）Table 3 Contents of C18:2 TFA and C18:3 TFA determined using different carrier gases under different temperature conditions (n= 3)%

圖 2 植物油樣品C18:2和C18:3順-反異構(gòu)體甲酯色譜分離譜圖Fig. 2 Chromatograms of methyl esters of C18:2 and C18:3 isomers in vegetable oil samples

2.2 不同批號色譜柱分離的一致性

精煉植物油中C18:3TFA異構(gòu)體是加工過程中產(chǎn)生的，菜籽油和花生油等食用油脂中均含有大量C20:1及C18:3n3反式異構(gòu)體，特別是C18:39c,12c,15t和C18:39t,12c,15c大量存在[30]。在色譜分離中，C20:1與C18:39t,12c,15c易出現(xiàn)部分或全部重疊，因此C20:1與C18:3n3異構(gòu)體的分離非常重要。在2017—2019年內(nèi)購入Sil88 100 m色譜柱，每個色譜柱批號都不同，購買后每次采用同一植物油樣品在等溫180 ℃進(jìn)行C20:1和C18:3n3反式異構(gòu)體的分析，發(fā)現(xiàn)不同批次的Sil88色譜柱分離C18:39t,12c,15c、C20:1和C18:3n3的能力有所差別，這種差異很可能源于制造過程中柱極性的變化[30-32]。這提示，應(yīng)用高極性氰丙基柱測定順反式脂肪酸含量，應(yīng)根據(jù)色譜柱實際分離情況，對操作溫度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，并定期仔細(xì)監(jiān)測脂肪酸的出峰順序和保留時間，以確保準(zhǔn)確評估TFA含量。

3 結(jié) 論

本研究以CP-Sil88毛細(xì)管柱為分析柱，在等溫180 ℃和梯度升溫2 種溫度操作條件下，分別以氦氣和氮氣為載氣，考察起酥油、黃油、餅干和蛋糕4 種樣品中的18:1單個TFA異構(gòu)體的分離度及C18:1TFA總量。以氦氣為載氣，能分辨出不同濃度的C18:19t、C18:110t和C18:111t異構(gòu)體，并單獨準(zhǔn)確定量，不會低估C18:1TFA異構(gòu)體總量。載氣類型對植物油中18:2反式異構(gòu)體的分離度和含量無影響，氦氣相較于氮氣，在植物油中C18:3反式異構(gòu)體的分離上有一定優(yōu)勢。不同批號的CP-Sil88毛細(xì)管柱在C20:1與C18:39t,12c,15c分離上具有一定不一致性，因此，有必要使用標(biāo)準(zhǔn)品監(jiān)測不同脂肪酸甲酯的出峰順序和保留時間，并對溫度程序仔細(xì)進(jìn)行微調(diào)。