基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)浙江傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜微生物多樣性的解析

鮑 偉，韓姣姣，張旨軒，蘆晨陽，周 君，明庭紅，李 曄，蘇秀榕,*

（1.寧波大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315832；3.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315832）

自古以來，中國(guó)就有谷物、蔬菜、牛奶、肉類、茶葉和豆類在內(nèi)的一系列原料的發(fā)酵產(chǎn)品，如白酒、陳醋、酸菜和醬油，除此之外，還有一些地方發(fā)酵產(chǎn)品，如浙東地區(qū)的寧波三臭（臭冬瓜、臭莧菜梗和臭菜心）、廣東南雄的酸筍和長(zhǎng)沙臭豆腐等。微生物發(fā)酵不僅延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，還在口感、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)方面賦予了食品其他特性。發(fā)酵食品中有古生菌、細(xì)菌、真菌等多種微生物，其檢測(cè)方法還基于體外培養(yǎng)，在這種狀態(tài)下許多微生物通過培養(yǎng)基無法被檢測(cè)到[1]。

高通量測(cè)序技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物，可廣泛應(yīng)用于微生物群落的組成和變化分析[2-3]，其快速發(fā)展同時(shí)也促進(jìn)了基因組學(xué)技術(shù)在傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物研究中的應(yīng)用[4]。魏本良等[5]利用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)西北地區(qū)特色發(fā)酵食品漿水中細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum，33.39%）、乙醇片球菌（Pediococcus ethanolica，21.13%）和L. parafarraginis（13.28%）；寧亞麗等[6]利用高通量測(cè)序技術(shù)解析出朝鮮族傳統(tǒng)米酒中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus和腸桿菌屬（Enterobacter），優(yōu)勢(shì)真菌為釀酒酵母和伯頓絲孢畢赤酵母（Pichia burtoni）；自然發(fā)酵豆腐乳清的優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng)actobacillus、Enterobacter、芽孢桿菌屬（Bacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）和Picha等[7]；郫縣豆瓣在發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌群為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、Pediococcus、Lactobacillus、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）和Bacillus[8]。此外，袁曉陽等[9]采用人工培養(yǎng)的方式對(duì)寧波臭冬瓜主要發(fā)酵菌種進(jìn)行了研究，分離出自然發(fā)酵腌制冬瓜中的6 株主要發(fā)酵菌種：短小芽孢桿菌（B. pumilus）、極小棒狀桿菌（C. parvum）、腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaction）、漢遜酵母（Hansenula）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和植物乳桿菌（L.plantarum）；孫麗等[10]利用5.8S rDNA-ITS克隆文庫(kù)法分析了腌制冬瓜中酵母菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)腌制早期優(yōu)勢(shì)酵母菌為普魯蘭類酵母（Aureobasidium pullulans），腌制中、后期，酵母菌群中優(yōu)勢(shì)菌種轉(zhuǎn)變?yōu)闊釒Ъ俳z酵母（Candida tropicalis）；萬力婷等[11]采用16S rDNA基因克隆文庫(kù)的方法研究了莧菜梗在腌制過程中細(xì)菌多樣性的變化，結(jié)果表示，莧菜梗腌制第0天優(yōu)勢(shì)菌群為L(zhǎng)actobacillus、Pediococcus和Weissella，第10天優(yōu)勢(shì)菌群為L(zhǎng)actobacillus和產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes），到腌制中后期Alcaligenes、擬桿菌屬（Bacteroides）和梭菌屬（Clostridium）為優(yōu)勢(shì)菌群，且細(xì)菌群落組成趨于穩(wěn)定。以上研究均是對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品混合物中微生物多樣性的研究，而對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)品的汁液、固形物以及培養(yǎng)物中的微生物組成及多樣性研究還鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以鹵水、臭冬瓜、臭莧菜梗、酸筍和酸茭白為研究對(duì)象，利用16S rDNA和ITS測(cè)序技術(shù)，分別對(duì)汁液、固形物及其培養(yǎng)物的細(xì)菌和真菌進(jìn)行測(cè)序，剖析這些發(fā)酵食品的微生物多樣性，確定結(jié)構(gòu)比例并找出優(yōu)勢(shì)菌群，以期為進(jìn)一步研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物或功能性成分提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹵水、臭冬瓜、臭莧菜梗、酸筍、酸茭白 寧波三臭居公司。

厭氧培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.A.?Soil試劑盒 上海玉博生物科技有限公司；AMPure XT beads試劑盒 美國(guó)貝克曼公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TL-08X普通型無菌均質(zhì)器 江蘇天翎儀器有限公司；NanoDrop 2000分光光度計(jì) 賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

分別取鹵水、臭冬瓜、臭莧菜梗、酸筍和酸茭白的汁液和培養(yǎng)物，以及后4 種食品的固形物；固形物是指將食品表面用無菌水沖洗干凈，然后從內(nèi)部取樣；培養(yǎng)物是指將樣品厭氧培養(yǎng)24 h后的產(chǎn)物，其中鹵水取汁液培養(yǎng)，其余4 種按照固液比1∶1用均質(zhì)器打碎混勻后培養(yǎng)。上述樣品采集后經(jīng)無菌密封好后放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高通量測(cè)序

1.3.2.1 DNA提取

根據(jù)E.Z.N.A.?Soil試劑盒說明書進(jìn)行樣品總DNA的提??；用NanoDrop 2000分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA濃度和純度。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

細(xì)菌采用16S rDNA基因可變區(qū)（V3-V4）區(qū)域通用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）；真菌采用ITS2可變區(qū)引物fITS7（5’-GTGARTCATCGAATCTTTG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，AMPure XT beads試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收純化、構(gòu)建文庫(kù)，利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用FLASH軟件根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系將成對(duì)的reads拼接成一條序列[12]，并去除barcode序列，通過PRINSEQ軟件去除短于50 bp的片段和reads尾部質(zhì)量值在20以下的堿基，只保留長(zhǎng)度大于400 bp（細(xì)菌）或者300 bp（真菌）的序列，然后過濾低復(fù)雜度序列，去除非擴(kuò)增區(qū)域[13]。最后利用Mothur[14]軟件中的pre.cluster算法進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤校正，同時(shí)利用chimeras.uchime算法去除序列中的嵌合體。

利用Uclust軟件對(duì)可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）進(jìn)行聚類分析（屬的序列相似性閾值為0.97，種的序列相似性閾值為0.99），并選擇OTU數(shù)目變化與Uclust參數(shù)之間最佳相似性值[15]。對(duì)于細(xì)菌序列通過Mothur對(duì)α多樣性包括Chao1指數(shù)、Observed指數(shù)以及Shannon指數(shù)進(jìn)行分析[16]，同時(shí)基于Unifrac metric計(jì)算方法對(duì)其β多樣性指數(shù)進(jìn)行分析[17]。最后采用RDP classifier軟件對(duì)處理后的序列進(jìn)行物種分類、群落變化的分析[18]。對(duì)于真菌序列則從每個(gè)OTU中選擇代表性序列，與NCBI的GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定真菌序列的分類信息。最后利用Excel 2016、GraphPad Prism8軟件繪制樣品各分類水平下的群落結(jié)構(gòu)圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

圖 1 樣品中細(xì)菌和真菌的OTU數(shù)量分析Fig. 1 Numbers of bacterial and fungal OTUs and ratio between them in samples

測(cè)序后對(duì)14 個(gè)樣品的原始序列進(jìn)行篩選，除去不合格的序列后，基于97%相似性得到的細(xì)菌和真菌OTU數(shù)量如圖1A、B所示。臭莧菜梗固形物中鑒定出的細(xì)菌OTU最多，為384 個(gè)，酸筍固形物中的細(xì)菌OTU最少，為72 個(gè)（圖1A）；而臭冬瓜培養(yǎng)物和酸茭白固形物中鑒定出的真菌OTU最多（48 個(gè)），臭莧菜梗培養(yǎng)物中的真菌OTU最少（5 個(gè)），而酸茭白汁中未檢測(cè)出真菌存在（圖1B）。14 個(gè)樣品微生物中的細(xì)菌比例均高于真菌。其中，鹵水、臭莧菜梗汁、固形物、培養(yǎng)物和酸茭白汁中的細(xì)菌占93%以上，其余樣品的細(xì)菌占比在62.39%～88.07%之間（圖1C）。

表 1 樣品中細(xì)菌和真菌的α多樣性Table 1 Alpha diversities of bacteria and fungi in samples

如表1所示，在14 個(gè)樣品中，細(xì)菌的Chao1指數(shù)在110.00～479.51之間，Shannon指數(shù)在2.19～6.23之間，覆蓋率為0.97；真菌的Chao1指數(shù)在5.00～53.00之間，Shannon指數(shù)在0～3.20之間，覆蓋率為0.99。通過計(jì)算樣品的多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，臭莧菜梗固形物的細(xì)菌Chao1指數(shù)（479.51）和Shannon指數(shù)（6.23）最高，說明它的物種豐度最高，菌群結(jié)構(gòu)更復(fù)雜；相反地，酸茭白培養(yǎng)物中的細(xì)菌豐度最低（Chao1指數(shù)為110.00），酸筍汁中的菌群結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單（Shannon指數(shù)為2.19）。鹵水培養(yǎng)物中的真菌豐度最高（Chao1指數(shù)為53.00），酸筍汁中的菌群結(jié)構(gòu)最復(fù)雜（Shannon指數(shù)為3.20），而臭莧菜梗培養(yǎng)物中的真菌豐度和多樣性均最低（Chao1指數(shù)為5.00，Shannon指數(shù)為0.03）。其余樣品的豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)表現(xiàn)出不同的差異，說明這些樣品中細(xì)菌和真菌種類和數(shù)量分布上也有所不同。

2.2 菌群結(jié)構(gòu)分析

利用UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）方法對(duì)樣品進(jìn)行聚類，14 個(gè)樣品共聚為兩大支，酸筍3 個(gè)樣品的細(xì)菌屬聚為一類，差異較小，其余11 個(gè)樣品的細(xì)菌屬另聚為一類；而鹵水與臭莧菜梗3 個(gè)樣品的真菌屬聚為一類，差異較小，其余樣品的真菌屬另聚為一類（圖2）。

圖 2 樣品UPGMA層次聚類分析Fig. 2 UPGMA hierarchical cluster analysis of bacterial and fungal communities in samples

2.3 樣品間微生物組成分析

2.3.1 細(xì)菌群落組成

圖 3 各樣品在門分類水平的細(xì)菌組成Fig. 3 Composition of bacterial community at phylum level in different samples

如圖3所示，鹵水中主要細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria，58.21%）、厚壁菌門（Firmicutes，12.06%）、螺旋體門（Spirochaetes，12.05%）和熱孢菌門（Thermotogae，3.45%）；而鹵水經(jīng)厭氧培養(yǎng)后，F(xiàn)irmicutes的相對(duì)豐度增加到62.06%，Proteobacteria、Spirochaetes和Thermotogae的相對(duì)豐度分別降低到31.86%、0.26%和2.44%。臭冬瓜汁中的優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門（Bacteroidetes，75.00%）、Firmicutes（11.12%）和Proteobacteria（5.61%）；臭冬瓜固形物中的優(yōu)勢(shì)菌門與汁液中相同，但相對(duì)豐度發(fā)生變化，為Bacteroidetes（45.93%）、Firmicutes（37.31%）和Proteobacteria（14.42%）；而臭冬瓜培養(yǎng)物中的主要優(yōu)勢(shì)菌門為Firmicutes（64.44%）、Bacteroidetes（24.06%）和Proteobacteria（9.93%）。臭莧菜梗汁中的優(yōu)勢(shì)菌為Bacteroidetes（61.8%）、Firmicutes（13.47%）和Proteobacteria（11.75%）；其固形物中的優(yōu)勢(shì)菌門為Bacteroidetes（34.51%）、Firmicutes（32.52%）、Proteobacteria（26.96%）和互養(yǎng)菌門（Synergistetes，5.05%）；臭莧菜梗培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度與固形物相比無明顯變化，除Synergistetes的相對(duì)豐度降低到1.18%。酸筍汁和培養(yǎng)物中均只有Firmicutes一種優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度為98.85%和98.28%；酸筍固形物的優(yōu)勢(shì)菌門為Firmicutes和放線菌門（Actinobacteria），相對(duì)豐度為94.43%和5.34%。酸茭白汁、固形物和培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌門均為Firmicutes（78.70%、80.39%和59.10%）、Bacteroidetes（18.02%、78.70%和2.56%）和Proteobacteria（2.56%、6.07%和36.52%）。

圖 4 各樣品在屬分類水平的細(xì)菌組成Fig. 4 Composition of bacterial community at genus level in different samples

14 個(gè)樣品共鑒定出256 個(gè)屬（圖4）。其中，鹵水中125 個(gè)，鹵水培養(yǎng)物中108 個(gè)，臭冬瓜汁中74 個(gè)，臭冬瓜固形物中93 個(gè)，臭冬瓜培養(yǎng)物中77 個(gè)，臭莧菜梗汁中140 個(gè)，臭莧菜梗固形物中139 個(gè)，臭莧菜梗培養(yǎng)物中102 個(gè)，酸筍汁中34 個(gè)，酸筍固形物中33 個(gè)，酸筍培養(yǎng)物中39 個(gè)，酸茭白汁102 個(gè)，酸茭白固形物中94 個(gè)，酸茭白培養(yǎng)物中58 個(gè)。其中，鹵水中的優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus（44.69%）和Clostridium（6.77%）；鹵水培養(yǎng)物中為Clostridium（27.4%）、普雷沃氏菌屬（Prevotella，13.81%）、嗜鹽單胞菌屬（Halomonas，13.09%）、Lactobacillus（11.83%）和Caproiciproducens（8.18%）；臭冬瓜汁中為L(zhǎng)actobacillus（55.55%）、Bacteroides（12.46%）、Clostridium（7.52%）和Prevotella（4.35%）；臭冬瓜固形物中為L(zhǎng)actobacillus（17.88%）、Aminipila（13.50%）、Prevotella（13.28%）、Bacteroides（11.45%）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella，7.15%）；臭冬瓜培養(yǎng)物中為脫硫弧菌屬（Desulfovibrio，33.90%）、Prevotella（12.91%）、Klebsiella（8.09%）、Lactobacillus（8.00%）和Bacteroides（5.85%）；臭莧菜梗汁中為Bacteroides（17.22%）、Paraclostridium（11.19%）、氨基酸球菌屬（Acidaminococcus，9.06%）、顫桿菌克屬（Oscillbacter，8.35%）和厭氧菌屬（Anaerofilum，5.58%）；臭莧菜梗固形物中為Bacteroides（14.28%）、Klebsiella（10.41%）、Anaerotignum（8.85%）、Lactobacillus（8.17%）和Prevotella（7.83%）；臭莧菜梗培養(yǎng)物中為Bacteroides（19.10%）、Prevotella（16.64%）、Anaerotignum（7.73%）和變形菌屬（Proteus，5.98%）；酸筍汁中為Klebsiella（83.87%）；酸筍固形物中為埃希菌屬（Escherichia，28.67%）、Klebsiella（24.97%）、紫單胞菌屬（Porphyromonas，15.67%）、Bacteroides（9.66%）、Lactobacillus（6.58%）和Pectinatus（5.34%）；酸筍培養(yǎng)物中為Coenonia（35.49%）、Bacteroides（30.04%）、Escherichia（16.59%）和Clostridium（7.11%）；酸茭白汁中為Caproiciproducens（59.13%）、Bacteroides（12.96%）、Clostridium（8.75%）和Prevotella（5.07%）；酸茭白固形物中為Clostridium（52.56%）、Bacteroides（13.52%）、Aminipila（12.10%）和Paraclostridium（11.82%）；酸茭白培養(yǎng)物中為Clostridium（49.36%）、Klebsiella（30.82%）和Paraclostridium（9.36%）。

2.3.2 真菌群落組成分析

圖 5 各樣品在門分類水平的真菌組成Fig. 5 Composition of fungal community at phylum level in different samples

除酸茭白汁中未檢測(cè)出真菌外，其余所有樣品的優(yōu)勢(shì)菌門只有2 種，分別是子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。其中鹵水、臭莧菜梗汁、臭莧菜梗固形物和臭莧菜梗培養(yǎng)物中Ascomycota相對(duì)豐度為98%以上，而其余9 個(gè)樣品中Ascomycota相對(duì)豐度為62.09%～67.84%，Basidiomycota相對(duì)豐度為30.57%～36.70%（圖5）。

圖 6 各樣品在屬分類水平的真菌組成Fig. 6 Composition of fungal community at genus level in different samples

14 個(gè)樣品中共鑒定出47 個(gè)屬（圖6），分別為鹵水中10 個(gè)，鹵水培養(yǎng)物中31 個(gè)，臭冬瓜的汁、固形物和培養(yǎng)物中各28 個(gè)，臭莧菜梗汁中12 個(gè)，臭莧菜梗固形物中8 個(gè)，臭莧菜梗培養(yǎng)物中5 個(gè)，酸筍汁中27 個(gè)，酸筍固形物中25 個(gè)，酸筍培養(yǎng)物中26 個(gè)，酸茭白固形物中29 個(gè)，酸茭白培養(yǎng)物中27 個(gè)。其中，鹵水培養(yǎng)物、臭冬瓜汁、臭冬瓜固形物、臭冬瓜培養(yǎng)物、酸筍汁、酸筍固形物、酸筍培養(yǎng)物、酸茭白固形物和酸茭白培養(yǎng)物中優(yōu)勢(shì)菌屬相同，均為布勒擔(dān)孢酵母屬（Bulleromyces）、假絲酵母屬（Candida）、Leptospora和擲孢酵母屬（Sporobolomyces），且在鹵水培養(yǎng)物中相對(duì)豐度分別為Bulleromyces（27.07%）、Candida（5.62%）、Leptospora（53.38%）和Sporobolomyces（6.57%）；臭冬瓜汁中為Bulleromyces（27.38%）、Candida（4.22%）、Leptospora（50.57%）和Sporobolomyces（8.34%）；臭冬瓜固形物中為Bulleromyces（25.58%）、Candida（8.18%）、Leptospora（54.48%）和Sporobolomyces（4.80%）；臭冬瓜培養(yǎng)物中為Bulleromyces（29.68%）、Candida（7.21%）、Leptospora（50.68%）和Sporobolomyces（6.05%）；酸筍汁中為Bulleromyces（20.49%）、Candida（22.63%）、Leptospora（36.29%）和Sporobolomyces（3.31%）；酸筍固形物中為Bulleromyces（27.47%）、Candida（6.49%）、Leptospora（51.94%）和Sporobolomyces（7.10%）；酸筍培養(yǎng)物中為Bulleromyces（29.59%）、Candida（9.68%）、Leptospora（45.99%）和Sporobolomyces（6.97%）；酸茭白固形物中為Bulleromyces（29.27%）、Candida（6.94%）、Leptospora（50.59%）和Sporobolomyces（6.62%）；酸茭白培養(yǎng)物中為Bulleromyces屬（29.79%）、Candida（6.08%）、Leptospora（51.91%）和Sporobolomyces（6.36%）；而Candida在臭莧菜梗的汁、固形物和培養(yǎng)物中的比例均占97%以上；除此之外，柯達(dá)酵母屬（Kodamaea，84.17%）和Candida（10.49%）是鹵水中的優(yōu)勢(shì)菌屬。

3 討 論

根據(jù)14 個(gè)樣品UPGMA層次聚類結(jié)果（圖2），發(fā)現(xiàn)酸筍的汁、固形物和培養(yǎng)物細(xì)菌結(jié)構(gòu)相似，并且與其他樣品細(xì)菌結(jié)構(gòu)具有差異性，而同屬酸味食品的酸茭白與臭味食品的細(xì)菌結(jié)構(gòu)有相似之處，這可能是原材料不同導(dǎo)致后期在發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；另一方面，樣品中真菌的層次聚類分析結(jié)果顯示，鹵水、莧菜梗的汁、固形物和培養(yǎng)物的真菌結(jié)構(gòu)相似，而與其余樣品真菌結(jié)構(gòu)具有差異性，這可能是因?yàn)辂u水來源于臭莧菜梗汁，而在貯藏過程中其真菌結(jié)構(gòu)變化不大所致。

從14 個(gè)樣品中均檢測(cè)出Lactobacillus，但其相對(duì)豐度有所差異，在“臭”味食品中豐度較高而在“酸”味食品中豐度較低。乳酸的形成離不開Lactobacillus的作用[19]。另外，Lactobacillus對(duì)有機(jī)酸具有一定的耐受能力[20]，能降低酵母菌的好氧代謝速度，從而延長(zhǎng)前發(fā)酵期，有利于有益菌的生長(zhǎng)[21-22]。對(duì)于蔬菜而言，發(fā)酵蔬菜品質(zhì)的形成與乳酸菌在發(fā)酵過程中的生長(zhǎng)代謝作用有重要的關(guān)系，如增進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善食品風(fēng)味、抑制雜菌生長(zhǎng)等[23]，因此，乳酸菌也被作為一種發(fā)酵劑投入到一些發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)中，如腌冬瓜[24]、泡菜[25]、酸菜[26]等。

臭冬瓜、臭莧菜梗屬于“臭”味發(fā)酵食品，用鹵水作為發(fā)酵劑。賀靜等[27]利用454高通量測(cè)序技術(shù)分析了湖南地區(qū)鹵水主要是厭氧球菌屬（Anaerococcus）、卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）、放線桿菌屬（Actinobacteria）、肉桿菌屬（Sarcobacterium）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）、四體球菌屬（Tetrasporium）、Acidaminococcus、Bacteroides、依格納季氏菌屬（Ignatella）、Lactobacillus和Halomonas等；趙國(guó)忠等[28]鑒定出安徽地區(qū)鹵水為漫游球菌（Roamcoccus）、嗜冷桿菌屬（Psychobacterium）、沙克乳桿菌（L. saccharomyces）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）和鳥腸球菌（Enterococcus avium）；而本研究中的浙江地區(qū)鹵水中檢測(cè)出的優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng)actobacillus、Clostridium、鹽厭氧菌屬（Haloanaerobic）和Sediminispirochaeta，此外Porphyromonas、Bacteroides、Lactobacillus和Halomonas也被檢測(cè)出，但相對(duì)豐度較低，由此說明不同地區(qū)的鹵水菌群多樣性存在差異，這可能是由于原材料和發(fā)酵環(huán)境所致。鹵水經(jīng)培養(yǎng)后，Clostridium、Prevotella、Halomonas和Caproiciproducens相對(duì)豐度增加，而Lactobacillus相對(duì)豐度降低。冬瓜中含有較多的碳水化合物和蛋白質(zhì)，而莧菜梗中更多的是纖維素，鹵水在冬瓜和莧菜梗中發(fā)酵，由于提供鹵水發(fā)酵的培養(yǎng)基不同，微生物多樣性也發(fā)生了改變。趙永威等[29]采用16S rDNA測(cè)序?qū)Χ想缰七^程中的微生物多樣性解析，得到其在腌制后期的優(yōu)勢(shì)菌為Weissella、Bacillus和Staphylococcus。在本研究中，門水平下，臭冬瓜汁和臭莧菜梗汁中的Bacteroidetes相對(duì)豐度分別是鹵水中的37 倍和31 倍，而Proteobacteria相對(duì)豐度分別是鹵水中的1/10和1/5；在屬水平下，與鹵水相比，臭冬瓜汁中的Bacteroides和Lactobacillus相對(duì)豐度分別增加了12.38%和10.86%，而鹵水中的Sediminispirochaeta和Haloanaerobic在臭冬瓜汁中未被檢測(cè)出；臭莧菜梗汁中的Lactobacillus降低了41.22%，Bacteroides和Aminococcus分別增加了17.14%和9.06%，而Acidaminococcus在鹵水和臭冬瓜汁中均未被檢測(cè)出。除此之外，臭冬瓜汁和臭莧菜梗汁中還產(chǎn)生了新的菌屬：Paraclostridium（2.86%、11.19%）、顫桿菌屬（Oscillacus，2.68%、8.35%）、Anaerofilum（0.01%、5.58%）和Anaerotignum（0.27%、0.22%）。而臭冬瓜固形物和培養(yǎng)物中的Lactobacillus的相對(duì)豐度比臭冬瓜汁分別降低了37.67%和47.55%，臭冬瓜固形物中含有較多的Aminipila（13.50%）和Prevotella（13.28%），臭冬瓜培養(yǎng)物中含有大量的Desulfovibrio（33.90%）；臭莧菜梗固形物和培養(yǎng)物與汁液相比，Klebsiella、Prevotella和Anaerotignum相對(duì)豐度增加，Acidaminococcus、Oscillacus、Anaerofilum和Paraclostridium相對(duì)豐度降低。鹵水中的真菌數(shù)量遠(yuǎn)小于細(xì)菌。鹵水中的真菌主要是酵母菌，酵母菌在發(fā)酵前期與細(xì)菌共生，主要起到分解的作用，隨著后期蔬菜浸鹵、鹽濃度的上升以及密封導(dǎo)致的氧氣減少，細(xì)菌逐漸占優(yōu)勢(shì)地位，而真菌數(shù)量慢慢減少，這在臭豆腐鹵液的研究中也被證實(shí)[22]。在本研究中，鹵水的優(yōu)勢(shì)真菌為奧默柯達(dá)酵母（Kodamaea ohmeri，84.17%）和C. tropicalis（8.90%）。陶森等[30]從腌魚中分離出的K. ohmeri耐鹽能力達(dá)到12%，劉建利等[31]在民間面引子中也檢測(cè)出了C. tropicalis。然而，鹵水在冬瓜和莧菜梗發(fā)酵后，其優(yōu)勢(shì)真菌發(fā)生改變。臭冬瓜汁中的優(yōu)勢(shì)真菌為L(zhǎng)eptospora rubella、白布勒彈孢酵母（Bullera pseudoalba）和赤色擲孢酵母（Sporobolomyces ruberrimus），而臭莧菜梗中為C. tropicalis（96.84%）。此外，臭冬瓜和臭莧菜梗的固形物和培養(yǎng)物與汁液的真菌組成相似。

酸筍和酸茭白屬于“酸”味食品，是竹筍和茭白浸沒在符合飲用要求的水中自然發(fā)酵而形成的發(fā)酵食品[32]。雖然是相同的發(fā)酵方式，但由于原材料不同，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的微生物有所差異。在門水平，酸筍3 種樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門只有Firmicutes，而酸茭白3 種樣品中優(yōu)勢(shì)菌門除Firmicutes還有Bacteroidetes和Proteobacteria，尤其在酸茭白培養(yǎng)物中，Proteobacteria的相對(duì)豐度達(dá)到36.52%；在屬水平，酸筍和酸茭白的汁液、固形物及培養(yǎng)物的細(xì)菌結(jié)構(gòu)均不同，酸筍汁中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Klebsiella，而酸茭白汁中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Caproiciproducens、Bacteroides和Clostridium，其中Caproiciproducens是一種產(chǎn)己酸菌[33]；酸筍固形物中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Klebsiella、Escherichia和單胞菌屬，而酸茭白固形物中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Clostridium、Paraclostridium、Bacteroides和Aminipila；酸筍培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Bacteroides、Escherichia和Coenonia，而酸茭白培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Clostridium、Pectinatus和Klebsiella?！八帷蔽妒称返恼婢M成很相似，但酸筍汁中的Candida的豐度相對(duì)于其他樣品較高。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)4 種江浙傳統(tǒng)發(fā)酵食品的14 個(gè)樣品的微生物多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus和Candida在所有樣品中都存在，說明在“臭”和“酸”兩類發(fā)酵食品中，Lactobacillus占據(jù)主要作用；其次，發(fā)酵食品的汁、固形物和培養(yǎng)物中的菌群結(jié)構(gòu)和多樣性也存在部分差異，這可能歸因于菌群的生長(zhǎng)環(huán)境不同。通過本研究對(duì)江浙傳統(tǒng)發(fā)酵食品不同部位及培養(yǎng)物的微生物菌群組成與多樣性有了一定了解，也為其他發(fā)酵食品微生物多樣性探究進(jìn)一步提供參考。