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    L-茶氨酸對高蛋白飲食誘導(dǎo)大鼠行為變化的干預(yù)作用

    2021-03-31 06:50:56宋玉欣龔志華李蘭蘭陳美艷張楊玲屈青云肖文軍
    食品科學(xué) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:蛋白飼料暗箱曠場

    宋玉欣,龔志華,張 嬌,賀 麟,李蘭蘭,陳美艷,張楊玲,屈青云,肖文軍

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點實驗室,國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410128)

    隨著現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)的變化,公眾在提倡“低脂飲食”的同時,海鮮、魚類、肉類、奶類等動物蛋白食品的攝入與日俱增。研究表明,攝入相對過量的動物性蛋白易導(dǎo)致慢性疾病的發(fā)生[1],增加健康風(fēng)險,可能出現(xiàn)抑郁、焦慮癥狀,嚴(yán)重時可能產(chǎn)生自殺行為[2-3]。中樞神經(jīng)遞質(zhì)是抑郁發(fā)生、發(fā)展的重要病理物質(zhì)[4],研究發(fā)現(xiàn)多巴胺(dopamine,DA)[5]、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)[6]、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)[7]水平的降低,極易導(dǎo)致情緒低落以及動力、食欲明顯下降。雖然市面上有許多抗抑郁的西藥,但其常伴有毒副作用,因此,從植物中尋找安全、天然、高效的產(chǎn)物來防治抑郁、焦慮已成為社會需求和研究熱點[8]。研究發(fā)現(xiàn),合歡皮[9]、北五味子[10]、香附[11]等植物源天然產(chǎn)物具有抗焦慮作用,能降低鼠腦內(nèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量,改善自主行為。

    新食品原料L-茶氨酸是主要存在于茶葉中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸,具有抗氧化[12]、降血壓[13]、預(yù)防糖尿病[14]、提高免疫力[15-16]、提高學(xué)習(xí)能力[17]、改善大腦認(rèn)知能力[18]等多種生理功能,且安全、無毒副作用。研究表明,L-茶氨酸的谷氨酰γ-乙基酰胺結(jié)構(gòu)與谷氨酰胺的谷氨酸γ-羧基酰胺結(jié)構(gòu)十分類似,同時其分解代謝產(chǎn)物谷氨酸是合成谷氨酰胺的前體物質(zhì),可通過改變機(jī)體中谷氨酸、谷氨酰胺濃度達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用[19]。目前關(guān)于自主行為的營養(yǎng)干預(yù)研究主要集中于通過噪聲刺激、潮濕墊料、夾尾等[20]方法建立大鼠或小鼠慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型,鮮見高蛋白飲食所致抑郁或焦慮的營養(yǎng)干預(yù)研究。為此,本研究通過對不同水平高蛋白飲食的SPF級6 周齡SD雄性大鼠進(jìn)行40 d的灌胃實驗,采用曠場和明暗箱行為學(xué)實驗觀察以及生理生化表征的方法,探究不同劑量L-茶氨酸對不同水平高蛋白飲食SD大鼠自主行為的影響,以期為高蛋白飲食的多元化營養(yǎng)干預(yù)及L-茶氨酸深層次利用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動物、材料與試劑

    SPF級6 周齡雄性SD大鼠160 只,購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2016-0002,實驗動物質(zhì)量合格證編號:43004700063552。

    普通維持飼料(蛋白質(zhì)供能比20%)、低水平高蛋白飼料(蛋白質(zhì)供能比30%)、中水平高蛋白飼料(蛋白質(zhì)供能比40%)及高水平高蛋白飼料(蛋白質(zhì)供能比50%)[21]均由北京華阜康生物科技有限公司提供,飼料配方如表1所示。

    表 1 不同水平高蛋白飼料組分及三大供能營養(yǎng)素比例Table 1 Components and proportions of three major energy-supplying nutrients in high-protein diets

    L-茶氨酸(純度≥98%)湖南省三福生物科技公司;0.9%氯化鈉注射液湖南科倫制藥有限公司;5-HT、NE、DA酶聯(lián)免疫吸附測定(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒上海茁彩生物科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    多功能酶標(biāo)儀賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;MIKRO22R型臺式冷凍離心機(jī)德國Hettich公司;自制曠場箱(100 cm×100 cm×50 cm)的無蓋木箱,箱子底部用實線劃分為2 5 個長寬均為20 cm×20 cm的小方格,中間9 格為中央?yún)^(qū)域,其余16 格為外周區(qū)域)、自制明暗箱(實驗裝置由兩個40 cm×40 cm×40 cm的正方形紙箱組成,其中一個紙箱為暗箱,全遮光;另一個紙箱去蓋;中間由一條不透光的紙質(zhì)通道連接,使大鼠可以無阻礙地在兩個紙箱走動)。

    1.3 方法

    1.3.1 動物實驗設(shè)計

    參考文獻(xiàn)[17,22-23]結(jié)果確定L-茶氨酸劑量。將160 只大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為16 組,每組10 只,每3、3、4 只飼養(yǎng)于同一籠中,籠底鋪墊楊木墊料,大鼠于溫度(25±2)℃、相對濕度50%~70%、普通維持飼料、自由飲食飲水的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,依據(jù)飼料種類及L-茶氨酸低(100 mg/(kgmb·d))、中(200 mg/(kgmb·d))、高(400 mg/(kgmb·d))灌胃劑量的區(qū)別,將各組分別編號:普通維持飼料組(P2CK)、普通維持飼料+L-茶氨酸低劑量組(P 2 L L)、普通維持飼料+L-茶氨酸中劑量組(P 2 M L)、普通維持飼料+L-茶氨酸高劑量組(P2HL);低水平高蛋白飼料組(P3CK)、低水平高蛋白飼料+L-茶氨酸低劑量組(P3LL)、低水平高蛋白飼料+L-茶氨酸中劑量組(P3ML)、低水平高蛋白飼料+L-茶氨酸高劑量組(P3HL);中水平高蛋白飼料組(P4CK)、中水平高蛋白飼料+L-茶氨酸低劑量組(P4LL)、中水平高蛋白飼料+L-茶氨酸中劑量組(P4ML)、中水平高蛋白飼料+L-茶氨酸高劑量組(P4HL);高水平高蛋白飼料組(P5CK)、高水平高蛋白飼料+L-茶氨酸低劑量組(P5LL)、高水平高蛋白飼料+L-茶氨酸中劑量組(P5ML)、高水平高蛋白飼料+L-茶氨酸高劑量組(P5HL)。

    將L-茶氨酸干預(yù)組的相應(yīng)L-茶氨酸劑量溶解于生理鹽水中,依據(jù)體質(zhì)量進(jìn)行灌胃,其他組灌胃生理鹽水;每日上午8∶00灌胃,連續(xù)灌胃40 d。每只大鼠隔天稱體質(zhì)量、記錄,及時按體質(zhì)量調(diào)整灌胃量,每日定時稱量當(dāng)日剩余日糧并定時添加日糧。

    1.3.2 明暗箱實驗

    實驗第40天給藥3 h后進(jìn)行明暗箱實驗,將整組大鼠放在暗箱中,頭部朝明箱,立刻關(guān)閉蓋子,給予無光條件,通過攝像裝置觀察并記錄5 min內(nèi)從暗箱到明箱的大鼠穿越次數(shù)以及在明箱的活動時間。實驗過程中保持外界環(huán)境安靜,每次放入大鼠前要清理糞便并噴灑酒精去除氣味,以便進(jìn)行下一組測試,確保每次檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    1.3.3 曠場實驗

    在實驗第40天下午進(jìn)行曠場實驗,保持室內(nèi)安靜,捏住大鼠尾巴,輕放于格內(nèi)迅速離開,將大鼠置于中央方格同一位置,且每次放置時確保頭部固定同一朝向;通過攝像裝置觀察并記錄大鼠在5 min內(nèi)活動的水平移動格數(shù)和后肢站立次數(shù),結(jié)束后將大鼠放回飼養(yǎng)籠中,清掃糞便等殘留物,噴灑酒精消毒并擦拭干凈,以防影響后續(xù)實驗。

    1.3.4 樣本采集

    所有行為學(xué)觀察實驗完成后,大鼠禁食12 h。第41天,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛溶液麻醉大鼠,腹部主動脈取血。血樣在室溫下靜置30 min后,3 500 r/min離心10 min,吸取上清液,分裝移至1 mL潔凈EP管,置于-80 ℃保存,留待檢測。

    1.3.5 生化指標(biāo)檢測

    按試劑盒說明書要求,檢測大鼠血清DA、5-HT、NE質(zhì)量濃度。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    采用SPSS 25.0軟件對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,各組間采用最小顯著性差異法和鄧肯檢驗(P<0.05表示有顯著性差異,為具有統(tǒng)計學(xué)意義),統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;對于不符合正態(tài)分布或正態(tài)轉(zhuǎn)化無效的數(shù)據(jù),采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠體質(zhì)量及采食量的影響

    表 2 不同水平高蛋白飲食對SD大鼠體質(zhì)量和采食量的影響Table 2 Effect of high-protein diet on body mass and feed intake of SD rats

    表2表明,與P2CK相比,P3CK、P4CK、P5CK各組大鼠的平均日采食量均顯著減少(P<0.05),主要原因是高蛋白飲食可引起大鼠厭食[24]。在第1天各組間體質(zhì)量差異不顯著,經(jīng)過40 d不同水平蛋白飼料的喂養(yǎng)后,與P2CK相比,隨蛋白質(zhì)供能比的增加,不同水平高蛋白飼料組體質(zhì)量逐漸減少,其中P5CK體質(zhì)量減少達(dá)顯著水平(P<0.05),說明高水平高蛋白飲食可產(chǎn)生飽食感,減少采食量,減輕大鼠體質(zhì)量,這與French等[25]的結(jié)論一致。

    表 3 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠體質(zhì)量和采食量的影響Table 3 Effect of L-theanine on body mass and feed intake of SD rats fed with high-protein diet

    如表3所示,通過不同劑量L-茶氨酸對不同水平高蛋白飲食大鼠營養(yǎng)干預(yù)40 d后,與P5CK相比,P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠的平均日采食量均減少,但不顯著,而其體質(zhì)量則有所增加,其中P5LL的體質(zhì)量增加顯著(P<0.05),說明L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠具有增加體質(zhì)量的作用。

    2.2 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠曠場自主行為的影響

    圖 1 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠曠場自主行為的影響Fig. 1 Effect of L-theanine on autonomous behavior of SD rats fed high-protein diet in open field

    曠場實驗是檢測動物情緒行為的一種常用的方法,其結(jié)果的升高或降低會有不同的行為學(xué)解釋[26]。圖1A表明,與P2CK相比,P5CK大鼠的水平移動格數(shù)減少,但差異不顯著;與P3CK、P4CK相比,P5CK大鼠的水平移動格數(shù)顯著減少(P<0.05)。由圖1C可知,與P3CK、P4CK相比,P5CK大鼠在曠場箱的后肢站立次數(shù)顯著減少(P<0.05),這可能是低水平高蛋白飲食有利于提高認(rèn)知能力,而高水平高蛋白飲食可能導(dǎo)致自主行為障礙的緣故[27]。

    圖1B顯示,與P5CK相比,P5LL、P5ML大鼠的水平移動格數(shù)顯著增加(P<0.05),同時由圖1D可知,P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠在曠場箱的后肢站立次數(shù)均增加,其中P5LL、P5ML顯著增加(P<0.05),說明L-茶氨酸的干預(yù)可以改善大鼠因高蛋白飲食所致的曠場自主行為[28]。

    2.3 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠明暗箱自主行為的影響

    圖 2 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠明暗箱自主行為的影響Fig. 2 Effect of L-theanine on autonomic behavior of SD rats fed high-protein diet in light/dark boxes

    明暗箱是利用實驗動物喜歡探究新奇環(huán)境,但又因厭惡明室中的亮光而退卻,由此形成矛盾沖突狀態(tài),使穿箱次數(shù)減少,以此評價是否抑郁的行為學(xué)實驗[29]。圖2表明,與P2CK相比,P5CK大鼠在明箱中的停留時間顯著縮短,進(jìn)入明箱的次數(shù)顯著減少(P<0.05);L-茶氨酸干預(yù)40 d后,P5LL大鼠在明箱中的停留時間顯著延長(P<0.05),同時P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠進(jìn)入明箱的次數(shù)顯著增加(P<0.05),說明L-茶氨酸具有改善大鼠因高蛋白飲食所致的明暗箱自主行為的作用。

    2.4 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)的影響

    表 4 L-茶氨酸對不同水平高蛋白飲食SD大鼠血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)的影響Table 4 Effect of L-theanine on monoamine neurotransmitters in serum of SD rats fed high-protein diet

    單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說[30]中,抑郁癥的發(fā)病與DA、5-HT、NE等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其受體含量、敏感度等密切相關(guān)。表4表明,與P2CK相比,P5CK大鼠血清中DA、5-HT、NE質(zhì)量濃度減少無顯著差異,但L-茶氨酸干預(yù)后,與P5CK相比,P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠血清中DA、NE質(zhì)量濃度顯著升高(P<0.05),且P5LL大鼠血清中5-HT質(zhì)量濃度顯著升高(P<0.05),說明L-茶氨酸能夠提高高蛋白飲食大鼠血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT、NE的質(zhì)量濃度,達(dá)到抗抑郁效果,這與彭彬等[28]的研究結(jié)果一致。

    3 討 論

    隨著生活水平的提高,人體攝入蛋白質(zhì)的比例逐漸增大,長期高蛋白的攝入對人體的影響值得探討。有研究指出,長期進(jìn)食高蛋白食物可以產(chǎn)生腎臟損害[31]、肝臟損害[32]、降低免疫力[33]、增加患糖尿病風(fēng)險[34]等,還會破壞血腦屏障的完整性[35],導(dǎo)致認(rèn)知水平下降、神經(jīng)元變性[36]等神經(jīng)疾病。

    人體研究結(jié)果表明L-茶氨酸對高焦慮傾向的受試者有更好的抗抑郁或焦慮作用,能夠起到神經(jīng)保護(hù)功能[37];Yin Cui等[38]通過小鼠行為學(xué)實驗證明L-茶氨酸對小鼠的抗抑郁作用可能是由中樞單胺能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo);彭彬等[28]通過建立慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激抑郁大鼠模型,發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸組大鼠DA、5-HT、NE的質(zhì)量濃度增高。同時,大多現(xiàn)有的抗抑郁藥物主要是作用于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)[30],在神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵信號突觸傳遞作用的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT、NE的釋放水平與抑郁癥的發(fā)生有直接關(guān)系??梢姡琇-茶氨酸具有神經(jīng)保護(hù),改善因抑郁、焦慮等所致自主行為的作用。

    為了明確何種高蛋白飲食水平可誘導(dǎo)焦慮或抑郁自主行為,本研究設(shè)置了4 個不同蛋白水平飼料組。通過對體質(zhì)量測定、行為學(xué)觀察及生化指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn),只有蛋白質(zhì)供能比為50%的高水平高蛋白飲食對大鼠自主行為及神經(jīng)遞質(zhì)含量產(chǎn)生了顯著的不良影響。因此,結(jié)果中只涉及到L-茶氨酸干預(yù)高水平高蛋白組的數(shù)據(jù)。一方面,高水平高蛋白飲食大鼠進(jìn)入曠場箱的水平移動格數(shù)以及后肢站立次數(shù)均顯著減少(P<0.05),說明大鼠對新環(huán)境的探索能力受到影響;進(jìn)入明箱的次數(shù)以及在明箱中的時間也顯著縮短(P<0.05),說明大鼠對新環(huán)境的好奇程度降低;L-茶氨酸干預(yù)能夠提高大鼠的探索能力,改善大鼠因高蛋白飲食所致的曠場和明暗箱自主行為。另一方面,各水平高蛋白飼料組大鼠血清中DA、5-HT、NE質(zhì)量濃度無顯著差異,而L-茶氨酸干預(yù)的高蛋白飲食各組大鼠血清中DA、NE質(zhì)量濃度顯著升高(P<0.05),且P5LL組大鼠血清中5-HT質(zhì)量濃度顯著升高(P<0.05)。

    因此,綜合本研究中L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠體質(zhì)量、采食量以及在曠場和明暗箱中的自主行為影響結(jié)果,可以認(rèn)為,低水平高蛋白飲食有利于提高認(rèn)知能力,而高水平高蛋白飲食則可能導(dǎo)致抑郁、焦慮等自主行為障礙;同時L-茶氨酸的干預(yù)可以改善大鼠因高蛋白飲食所致自主行為障礙的作用。后續(xù)可通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)方法,從各組間的差異基因、蛋白及代謝產(chǎn)物等方面進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究。

    低水平高蛋白飲食有利于提高認(rèn)知能力,而高水平高蛋白飲食則可能導(dǎo)致抑郁、焦慮等自主行為障礙,L-茶氨酸具有改善高蛋白飲食所致焦慮或抑郁SD大鼠自主行為的作用,其機(jī)制可能與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝相關(guān)。

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