冰島刺參縮醛磷脂和醚磷脂對神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的促神經(jīng)分化作用

李藝洋，丁 一，王曉旭，王昕岑，王 睿，叢培旭，徐 杰,，薛長湖,2

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東 青島 266235）

磷脂是一類廣泛存在于動物血液、大腦、心臟、骨骼肌和腎臟的含磷脂類，是生物細(xì)胞膜的重要組成部分[1]。根據(jù)結(jié)構(gòu)中頭部基團(tuán)的差異，磷脂可分為磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）等[2]。1924年Feulgen和Voigt發(fā)現(xiàn)了兩類特殊磷脂[3]：其中，在甘油骨架sn-1位上僅存在醚鍵的磷脂被稱為醚磷脂；除醚鍵外還含有一個雙鍵的磷脂被稱為縮醛磷脂；前者主要為烷氧型磷脂酰膽堿（plasmanylcholine，aPC），而后者主要為縮醛型磷脂酰乙醇胺（plasmenylethonoamine，pPE）。越來越多的研究表明，縮醛磷脂和醚磷脂都具有獨特的生物活性，如神經(jīng)保護(hù)、抗氧化應(yīng)激、信息轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗腫瘤等[4-6]。

冰島刺參（Cucumaria frondosa）屬于光參類、瓜參科，其體壁內(nèi)含有皂苷等多種活性成分及海參磷脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂等功能性脂質(zhì)[7]，是海參中品質(zhì)上乘的參種。本課題組前期實驗已發(fā)現(xiàn)冰島刺參是縮醛磷脂和醚磷脂的原料來源，并建立了縮醛磷脂及醚磷脂的分離純化方法[8]。研究表明，海參體內(nèi)提取的活性脂質(zhì)對阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病有良好的預(yù)防和治療作用，如海參中的腦苷脂可預(yù)防SAMP8小鼠和腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（pheochromocytoma，PC12）細(xì)胞的氧化應(yīng)激[9]，但其在神經(jīng)分化和營養(yǎng)方面的研究還較少。

神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)元延伸形成神經(jīng)突起（包括樹突和軸突）組成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)，對于維持機(jī)體正常生理活動至關(guān)重要[10]。如果由于某些原因造成神經(jīng)元和神經(jīng)突起數(shù)量減少，則會導(dǎo)致阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病[11]，這類疾病被證實與脂質(zhì)調(diào)控密切相關(guān)[12]。因此，尋找具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的活性物質(zhì)具有重要意義。

目前，大量的小分子天然海洋化合物（如二十二碳六烯酸、皂苷、海洋生物活性堿等）顯示出緩解和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛力[13-14]，但鮮見海洋源磷脂對神經(jīng)營養(yǎng)作用的報道。大鼠PC12細(xì)胞不僅具備神經(jīng)干細(xì)胞和成熟神經(jīng)細(xì)胞的雙重特性，且被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制方面的研究[15]。因此，本實驗選取冰島刺參為原料，提取、分離純化pPE和aPC，以PC12為體外細(xì)胞模型，研究不同結(jié)構(gòu)磷脂在促進(jìn)細(xì)胞分化、突觸生長方面的神經(jīng)營養(yǎng)作用及構(gòu)效關(guān)系，以期為海洋食品的加工利用、海洋活性脂質(zhì)的功效探索以及相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰島刺參 青島市南山水產(chǎn)市場。

冷丙酮、氯仿、甲醇（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Silica Gel 60（300～400 目） 加拿大Silicycle公司；氯仿、甲醇試劑（色譜純） 美國Muskegon 公司；Nucleosil 100-5 OH色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）德國Macherey-Nagel公司；PE（14∶0/14∶0）、PC（14∶0/14∶0）標(biāo)準(zhǔn)品美國Avanti Polar Lipids公司；PC12細(xì)胞（未分化）中國科學(xué)院上海生化與細(xì)胞研究所；RPMI-1640干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）（2.5S-NGF）美國Gibco公司；SYBR Green Master Mix美國Fermentas公司；β-actin抗體美國Sigma公司；突觸素（synaptophysin，SYN）抗體 英國Abcam公司。牛腦pPE為實驗室前期制備，純度為88.4%[8]。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀美國Thermo Fisher公司；HF90/HF240 CO2培養(yǎng)箱、HFsafe1200LC系列安全柜、Neufuge 13R臺式高速冷凍離心機(jī)上海力申科學(xué)儀器有限公司；iCycler iQ5系統(tǒng)實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）擴(kuò)增儀美國Bio-Rad公司；12V DC 30W倒置生物顯微鏡 蔡司科技（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pPE和aPC的分離、純化及純度鑒定

按照前期課題組研究方法[8]制備pPE和aPC。提取總脂，然后用2 倍體積冷丙酮沉淀并結(jié)合硅膠柱層析純化磷脂，得到的粗磷脂繼續(xù)通過硅膠柱（280 mm×800 mm）層析分離縮醛磷脂和醚磷脂。參考González-Domínguez等[16]的方法，采取液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對分離得到的縮醛磷脂和醚磷脂進(jìn)行鑒定。參考Zhou Li等[17]的方法，根據(jù)精確分子質(zhì)量、保留時間及二級質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，利用PE（14∶0/14∶0）、PC（14∶0/14∶0）標(biāo)準(zhǔn)品與峰面積歸一化方法相結(jié)合計算純度。

1.3.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞存活率的測定

按照Wang Xiaoxu等[18]的方法稍加改動。未分化的PC12細(xì)胞在含5%胎牛血清、10%馬血清及1×105μg/L青霉素及鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期，用完全培養(yǎng)基配成密度為1×105個/mL的細(xì)胞懸液并接種于96 孔板，孵育24 h待細(xì)胞貼壁后更換為含不同質(zhì)量濃度（10、20、40 μg/mL）磷脂的2%胎牛血清-RPMI-1640培養(yǎng)基，每孔200 μL，每個質(zhì)量濃度6 個復(fù)孔；以不添加磷脂的2%胎牛血清-RPMI-1640培養(yǎng)基為空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)48、96 h和144 h后，吸去培養(yǎng)基，加入終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）溶液。培養(yǎng)4 h后加入酸化異丙醇吹打至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測樣品和空白對照吸光度。細(xì)胞存活率按式（1）計算。

1.3.3 細(xì)胞分組

以二甲基亞砜為溶劑配制質(zhì)量濃度40 mg/mL的pPE和aPC母液，使用前用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋。未分化的PC12細(xì)胞按照如下形式進(jìn)行分組：常規(guī)培養(yǎng)的對照組；添加10 ng/mL NGF培養(yǎng)的分化模型組；添加10 ng/mL NGF和5、20 μg/mL或40 μg/mL pPE和aPC溶液培養(yǎng)的處理組。

1.3.4 pPE和aPC對NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的影響

常規(guī)培養(yǎng)的PC12細(xì)胞添加10 ng/mL NGF和40 μg/mL牛腦pPE、冰島刺參pPE或aPC持續(xù)孵育6 d，每組3 個復(fù)孔，每隔2 d換液。軸突長度大于等于胞體長度的細(xì)胞認(rèn)為是分化細(xì)胞。孵育第6天進(jìn)行拍照，每孔隨機(jī)選擇5 個區(qū)域，每個區(qū)域平均約有20 個PC12細(xì)胞，對每個區(qū)域的PC12細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分化率、軸突長度及數(shù)目統(tǒng)計，結(jié)果取平均值。細(xì)胞分化率按式（2）計算。

軸突長度為從一個細(xì)胞體伸出的最長軸突與胞體長度的比值；軸突數(shù)目為從一個胞體伸出的軸突個數(shù)[19]。

1.3.5 免疫熒光測定SYN的分布與表達(dá)

細(xì)胞布板后在含有40 μg/mL不同磷脂的10 ng/mL NGF-2%胎牛血清-RPMI培養(yǎng)基中孵育24 h后，冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 遍，加入4 g/100 mL多聚甲醛溶液，室溫固定40 min。PBS洗滌3 次后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4% Triton X-100溶液固定30 min以破壞細(xì)胞膜。用2 g/100 mL牛血清白蛋白溶液（PBS配制）37 ℃培養(yǎng)箱中封閉1 h。PBS洗滌3 次后分別加入對應(yīng)的一抗溶液（SYN按1∶1 000稀釋）4 ℃過夜[18]。清洗后添加熒光標(biāo)記的二抗室溫避光孵育40 min。2 μg/mL 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）染色液復(fù)染20 min，封片劑封片，避光4 ℃保存，待激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.6 qPCR測定syn和GAP-43mRNA的表達(dá)

PC12細(xì)胞經(jīng)冷PBS漂洗3 次，進(jìn)行總RNA的提取并計算純度和含量。采用SYBR Green I Master Mix通過qPCR檢測各目的基因mRNA的表達(dá)量。25 μL反應(yīng)體系：樣品cDNA 2.5 μL、SYBR Green 12.5 μL、上游和下游引物各0.75 μL、DEPC水8.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共45 個循環(huán)[20]。各基因mRNA表達(dá)量以β-actinmRNA表達(dá)量作為內(nèi)參校正，并將對照組表達(dá)量設(shè)為1。相關(guān)基因引物序列均由生工生物工程（上海）有限公司合成，具體序列如表1所示。

表 1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組實驗重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；空白對照組之間采用Student’st-test比較分析，多組之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05被認(rèn)為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰島刺參中縮醛磷脂和醚磷脂的純度鑒定

圖 1 冰島刺參中縮醛磷脂和醚磷脂的純度鑒定Fig. 1 Purification and identification of pPE and aPC from Cucumaria frondosa

圖1 A、C 分別為純化后冰島刺參P E 和P C 的總離子流圖；圖1B、D分別為pPE和aPC主要分子種類的提取離子流圖。在負(fù)離子模式下，根據(jù)aPC產(chǎn)生的[M-CH3]-特征碎片與pPE產(chǎn)生的140.009 3[C2H7O4P]-和196.036 2[C5H11O5NP]-二級特征碎片離子，可以對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析。計算得到純化后冰島刺參pPE和aPC純度分別為91.0%和89.1%，其中，PE（p18∶0/20∶5）和PC（a18∶1/20∶5）分別為冰島刺參提取PE和PC的主要分子種類，將其用于后續(xù)實驗。

2.2 冰島刺參pPE和aPC對PC12細(xì)胞存活率和分化率的作用

圖 2 冰島刺參pPE和aPC對PC12細(xì)胞活力和NGF誘導(dǎo)的細(xì)胞分化的影響Fig. 2 Effects of pPE and aPC on cell viability and NGF-induced differentiation of PC12 cells

為評價海洋源磷脂對PC12細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)作用，首先應(yīng)考察其對細(xì)胞的增殖或毒性效應(yīng)，以確保后續(xù)實驗過程不是由于磷脂本身的細(xì)胞毒性而引起細(xì)胞變化。MTT實驗測定細(xì)胞存活率可用于評價細(xì)胞活性[21]。pPE在大腦和腎臟中特別豐富[22]，牛腦可以作為提取pPE的良好來源，為對比海洋生物源縮醛磷脂與陸地動物源縮醛磷脂的效果差異，同時設(shè)置牛腦pPE組進(jìn)行對照實驗，結(jié)果如圖2A～C所示。在質(zhì)量濃度0～40 μg/mL下，牛腦pPE、冰島刺參pPE和aPC對細(xì)胞存活率沒有顯著影響，說明這3 種磷脂在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對PC12細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，不影響細(xì)胞增殖，因此可用于后續(xù)實驗。通過PC12細(xì)胞的分化率研究不同結(jié)構(gòu)磷脂的神經(jīng)營養(yǎng)作用，結(jié)果如圖2D所示。3 種磷脂均具有促進(jìn)細(xì)胞分化的作用；牛腦pPE、冰島刺參pPE和冰島刺參aPC組細(xì)胞分化率較模型組分別提高了10%、13%和8%，與模型組差異顯著（P＜0.05或P＜0.01）。這表明相比于醚磷脂，縮醛磷脂提高PC12細(xì)胞分化率的效果可能更佳，并且冰島刺參pPE較牛腦pPE對細(xì)胞分化的促進(jìn)作用也更為明顯。以上結(jié)果表明，海洋源縮醛磷脂促神經(jīng)細(xì)胞分化的效果可能優(yōu)于陸地源，但具體原因和差異機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步實驗研究。

2.3 冰島刺參pPE和aPC對PC12細(xì)胞軸突長度和數(shù)目的影響

通過向NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞模型中添加外源性不同結(jié)構(gòu)磷脂，觀察磷脂對該神經(jīng)樣細(xì)胞軸突生長和分支形成作用，結(jié)果如圖3所示。相比于模型組，冰島刺參pPE組細(xì)胞軸突長度大于4的細(xì)胞比例極顯著增多（P＜0.01），且冰島刺參pPE組具有更長軸突長度（4 倍胞體長度）的細(xì)胞比例相較于冰島刺參aPC組更高（圖3A）。此外，就軸突數(shù)目（圖3B）而言，所有磷脂處理組中軸突數(shù)目為2的細(xì)胞比例均較模型組極顯著提高（P＜0.01）；與模型組細(xì)胞相比，冰島刺參pPE組軸突數(shù)目為3的細(xì)胞比例提高了8%（P＜0.01），相比于牛腦pPE組與模型組的差異更為顯著，而冰島刺參aPC組軸突數(shù)目為3的細(xì)胞比例與模型組相比沒有顯著差異（P＞0.05），說明冰島刺參pPE比牛腦pPE能夠更有效地促進(jìn)突觸的伸出，這與圖2D中促細(xì)胞分化作用的結(jié)果一致，進(jìn)一步佐證了冰島刺參pPE在促神經(jīng)分化方面的作用。

圖 3 冰島刺參pPE和aPC（40 μg/mL）對NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的軸突長度（A）和數(shù)目（B）的影響Fig. 3 Effects of pPE and aPC (40 μg/mL) on neurite length (A) and neurite number (B) in NGF-induced PC12 cells

2.4 免疫熒光法測定冰島刺參pPE和aPC對SYN的影響

圖 4 冰島刺參pPE和aPC（40 μg/mL）孵育24 h后PC12細(xì)胞SYN免疫熒光染色Merge圖（×40）Fig. 4 Effect of pPE and aPC (40 μg/mL) on synaptophysin in PC12 cells evaluated by immunofluorescence staining (× 40)

圖4為添加不同海洋源磷脂處理孵育24 h后PC12細(xì)胞的分化情況，細(xì)胞核被DAPI染為藍(lán)色，SYN被標(biāo)記為紅色，二者重疊后為Merge圖。在40 倍物鏡下觀察到，常規(guī)培養(yǎng)對照組PC12細(xì)胞呈圓形且無軸突，SYN僅在胞體表達(dá)。經(jīng)NGF誘導(dǎo)后模型組細(xì)胞長出軸突，而在40 μg/mL的牛腦pPE和冰島刺參pPE作用下，不僅分化細(xì)胞數(shù)目變多，且SYN在胞體和軸突的表達(dá)更加顯著，與模型組差異明顯，冰島刺參aPC的作用效果沒有2 種pPE強(qiáng)。因此，SYN的免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步表明，冰島刺參pPE促PC12細(xì)胞軸突生長的效果更佳，能更有效刺激神經(jīng)的生長。

2.5 冰島刺參pPE和aPC對syn和GAP-43表達(dá)的影響

圖 5 冰島刺參pPE和aPC對NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞syn（A）和GAP-43 mRNA相對表達(dá)量（B）的影響Fig. 5 Effect of pPE and aPC on mRNA expression of syn (A) and GAP-43 (B) in NGF-induced PC12 cells

SYN是突觸囊泡的組成成分，GAP-43位于突觸前膜上，二者均與突觸的生長相關(guān)，在神經(jīng)元生長延伸、突觸囊泡形成等方面具有表征作用[23]。利用qPCR技術(shù)分析冰島刺參pPE和aPC處理對PC12細(xì)胞中syn、GAP-43mRNA相對表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖5所示。在NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞分化模型組中，syn和GAP-43的mRNA相對表達(dá)量較對照組分別升高了25%和74%，差異極顯著（P＜0.01）。與模型組相比，除5 μg/mL冰島刺參aPC組外，其余磷脂處理組均極顯著提高了NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中syn和GAP-43的mRNA相對表達(dá)量（P＜0.01），并呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系；并且，pPE效果優(yōu)于aPC，冰島刺參pPE效果明顯優(yōu)于牛腦pPE，在質(zhì)量濃度為20 μg/mL時尤為突出，此質(zhì)量濃度下牛腦pPE和冰島刺參pPE組GAP-43mRNA表達(dá)量較對照組分別提高了4.6 倍和5.5 倍。

3 討 論

縮醛磷脂水平變化與阿爾茨海默癥密切相關(guān)，患者腦內(nèi)的縮醛磷脂水平顯著降低，是阿爾茨海默癥早期變化之一[24-26]，但具體機(jī)制尚不清楚。外源性縮醛磷脂的神經(jīng)活性對于減輕阿爾茨海默癥病癥已有報道[27]，臨床實驗也證明口服縮醛磷脂能緩解輕度阿爾茨海默癥患者的認(rèn)知障礙[28]。

近幾年，海洋活性脂質(zhì)的作用逐漸受到關(guān)注。海參腦苷脂和海膽神經(jīng)節(jié)苷脂具有抗氧化[9]和神經(jīng)營養(yǎng)作用[20]，富含二十碳五烯酸的磷脂可改善Aβ42、Aβ1-40誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷[29-30]和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的帕金森癥癥狀[31]。這些研究結(jié)果表明海洋活性脂質(zhì)具有作為神經(jīng)營養(yǎng)膳食補(bǔ)充劑的潛力。目前，關(guān)于外源性磷脂神經(jīng)方面的活性研究主要集中在其對神經(jīng)損傷的保護(hù)作用上，對海洋源磷脂在促神經(jīng)分化方面的確切作用或功能鮮見報道，探究海洋源不同結(jié)構(gòu)磷脂的促分化效果十分必要。

鑒于此，本實驗通過柱層析法制備獲得冰島刺參pPE和aPC，并與牛腦pPE對比，研究冰島刺參pPE和aPC對PC12細(xì)胞神經(jīng)生長的活性。采用NGF誘導(dǎo)建立PC12細(xì)胞分化模型，結(jié)果表明，牛腦pPE、冰島刺參pPE和冰島刺參aPC在一定質(zhì)量濃度下均可顯著提高PC12細(xì)胞的分化率，顯著延長軸突長度、增加軸突數(shù)目。通過免疫熒光分析直接觀察pPE促神經(jīng)分化效果，進(jìn)一步從分子水平上測定syn和GAP-43的mRNA表達(dá)量，結(jié)果表明，pPE與aPC均能增加syn和GAP-43基因表達(dá)，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。pPE和aPC表現(xiàn)出顯著促進(jìn)神經(jīng)生長效果時所需劑量較海參腦苷脂更低[18]。總體分析，一方面，縮醛磷脂效果優(yōu)于醚磷脂，這種效果差異可能依賴于結(jié)構(gòu)的差異，推測可能與縮醛磷脂具有不同于醚磷脂的烯醚鍵結(jié)構(gòu)有關(guān)[32]，pPE的烯醚鍵具有更強(qiáng)的自由基清除能力，從而更好地保護(hù)細(xì)胞[33]；另一方面，冰島刺參pPE具有較牛腦pPE更好的促神經(jīng)分化作用，推測海洋源縮醛磷脂在促神經(jīng)分化方面比陸地源縮醛磷脂有更大的潛力。

綜上所述，冰島刺參縮醛磷脂具有顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞分化的作用，有望成為促進(jìn)神經(jīng)生長的功能性食品原料。但其具體促生長機(jī)制和通路尚不明確，需要后續(xù)實驗進(jìn)一步研究。