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    芒柄花素對腦缺血再灌注后血腦屏障完整性影響

    2021-03-31 10:04:54陳莉莉韓真真孫精通
    天津藥學(xué) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:芒柄伊文思花素

    孫 瑜 ,劉 淼*,王 健,陳 磊,喬 夕,陳莉莉,韓真真,孫精通

    (1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;2.天津市兒童醫(yī)院,天津 300074)

    血腦屏障(BBB)是血-腦、血-腦脊液和腦脊液-腦三種屏障的總稱,是腦毛細血管阻止某些物質(zhì)由血液進入腦組織的結(jié)構(gòu)。腦缺血再灌注后,BBB 的一些微細結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使其開放性具有一定規(guī)律[1-5]。近年來,大量研究表明[8-10]芒柄花素(FMN)在抗腫瘤、降血脂、改善雌激素水平等方面有顯著效果,在腦缺血再灌注(I/R)損傷中具有抑制神經(jīng)炎癥、保護BBB 的作用。芒柄花素引入磺酸基,制成芒柄花素磺酸鈉(Sul-F),具有很好的水溶性。本研究擬進一步考查Sul-F 注射液對大鼠腦缺血再灌注后BBB 完整性的影響,以期進一步為其臨床用藥提供一定實驗數(shù)據(jù)。

    1 材料與儀器

    1.1 材料 SPF 級SD 大鼠,雄性,初始體重(250±20)g,生產(chǎn)許可證號:SCXK-(軍)2014-0001,購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所,飼養(yǎng)室溫度20~25 ℃、相對濕度50%~65%。Sul-F 對照品(河北國金藥業(yè)有限責任公司,批號09092602,純度95%以上);Sul-F(山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司,規(guī)格:5 ml∶100 mg,批號09092602)。Evans Blue(Solarbio,規(guī)格:1 g,批號619C049);甲酰胺(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號20150819);氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司,批號A15012304-2);水合氯醛(分析純,天津市瑞金特化學(xué)品有限公司,批號20020323)。

    1.2 儀器 激光多普勒及經(jīng)皮氧分壓測量儀PeriFlux System 5000 (Datavagen 9A,175 43 Jarfalla,Sweden);STRONG 90 牙科鉆(SAESHIN PRECISION IND.CO.);INFINITE 200 PRO 酶標儀(Tecan Austria GmbH);SIGMA 3K15 低溫高速離心機(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司);DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);T 18D S25 組織勻漿機(IKA,Germany);FA1004 上皿電子天平(中華人民共和國上海精科天平)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 BBB 通透性檢測 大鼠稱重后于手套內(nèi),處于清醒狀態(tài),于相應(yīng)時間點前0.5 h 尾靜脈注射2%EB(注射量:4.0 ml/kg,Sul-F 給藥量為20 mg/kg。2%EB 由注射用水稀釋4 倍的Sul-F 注射液配制)。0.5 h 后,10%水合氯醛麻醉大鼠,開胸用生理鹽水左心室灌注,直至右心耳流出液為清亮。取腦,生理鹽水沖洗干凈,紗布擦干,稱其濕重后放入試管中,加入甲酰胺至6 ml(約為腦重量的3 倍),蓋上蓋子45 ℃水浴24 h,冰浴中勻漿。取出后4 ℃、15 000 r/min 離心20 min,取上清液,于酶標儀620 nm 測吸光度,根據(jù)所測得的吸光度在繪制的標準曲線上查得EB 濃度。

    2.2 腦缺血再灌注動物模型(MCAO)的制備及評價 采用線栓法制備大鼠MCAO 模型。用栓線阻斷大鼠大腦中動脈,并于缺血60 min 后行再灌注。假手術(shù)組只分離、暴露血管,不結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈,不插入栓線。采用多普勒激光血流儀(laserdoppler flowmetry,LDF)監(jiān)測大鼠大腦中動脈栓塞及再灌注后的腦血流(cerebral blood flow,CBF)動態(tài)變化[6,7]。

    2.3 實驗動物分組 取SD 大鼠禁食不禁水12 h,復(fù)制大鼠腦缺血再灌注模型,隨機分為假手術(shù)組(n=5)、溶劑對照組(n=5)、給藥組(n=5)。分別于腦缺血1 h 及再灌注0、1、4、24 和48 h 實施心臟灌流后取腦組織進行勻漿(每組分別于取樣前0.5 h 按20 mg/kg 劑量尾靜脈注射Sul-F 注射液),按腦組織樣品預(yù)處理方法處理,使用酶標儀于620 nm 下測定EB 吸光度。

    2.4 標準曲線 稱取適量伊文思蘭加入空白腦勻漿液使其濃度依次為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 和80 μg/ml。置于45 ℃水浴箱24 h,以甲酰胺作為空白對照管,用熒光酶標儀在EB 最大吸收光譜620 nm 處測定各濃度(C 值)EB 溶液的吸光度(Y 值),根據(jù)所測數(shù)值計算出回歸方程。結(jié)果EB 在0.625~80 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其回歸方程為Y=0.020 9C-0.001 2(n=8,r=0.999 8)。

    2.5 Sul-F 對BBB 完整性影響 復(fù)制大鼠腦缺血再灌注模型,按實驗動物組別分別尾靜脈注射2%EB、Sul-F 注射液(以2%EB 配制)。分別測得腦缺血1 h 及再灌注0、1、4、24 和48 h 伊文思蘭濃度-時間數(shù)據(jù)見表1,濃度-時間曲線見圖1,BBB 透過率的比較見圖2。

    表1 模型大鼠溶劑組/給藥組伊文思蘭濃度-時間數(shù)據(jù)(,n=5)

    與溶劑組比較,*P<0.05

    圖2 血腦屏障透過率比較圖

    3 討論

    3.1 腦組織中EB 的提取 考查了甲酰胺、三氯乙酸提取腦組織中的EB。以甲酰胺為提取劑提取腦組織中的EB,可以對整個腦組織進行提取,而不必勻漿,大大避免了樣品損失,實驗結(jié)果顯示線性關(guān)系良好。

    3.2 Sul-F 對BBB 完整性的影響 伊文思蘭實驗表明Sul-F 具有降低腦缺血再灌注損傷中BBB 完整性的作用。根據(jù)相關(guān)研究表明[8],芒柄花素能顯著減少炎癥因子iNOS、TNF-α 和IL-1β 的表達,降低BBB 通透性和MMPs 活性,改善神經(jīng)功能損傷。本實驗研究結(jié)果顯示,Sul-F 能一定程度上降低腦缺血再灌注模型大鼠BBB 伊文思蘭透過率。

    腦缺血再灌注損傷后BBB 完整性受到一定破壞,并且呈開放、關(guān)閉波動式變化:腦缺血1 h 及再灌注0、4 和48 h 時,BBB 透過率相對較高,腦缺血1 h 及再灌注1 和24 h 時,BBB 透過率相對較低;且腦缺血1 h 及再灌注4 h 時,BBB 透過率最高。

    相應(yīng)時間點,給藥組比溶劑組EB 的透過率低7.0~9.0 μg/ml,提示在不同時間點給予Sul-F 后,均呈現(xiàn)明顯的降低BBB 通透性的作用,表明Sul-F 能一定程度上降低腦缺血再灌注模型大鼠BBB 伊文思蘭透過率。

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