雞Apob基因組織表達與CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)的構建

吉 琳，楊秋月，方斐旻，竇 虹，郁建鋒，徐 璐，顧志良

(常熟理工學院生物與食品工程學院,蘇州 215500)

載脂蛋白B(apolipoprotein B，Apob)是血漿中低密度脂蛋白(low density lipoproteins，LDL)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)的主要蛋白質(zhì)成分[1]。哺乳動物的Apob主要由肝和小腸合成，在脂類代謝、膽固醇轉(zhuǎn)運[2]、吸收代謝等過程中發(fā)揮重要作用。Apob異常與冠心病[3]、糖尿病[4]、脂肪肝[5]、代謝綜合癥[6-8]等疾病的發(fā)生相關性較高，同時也是評估動脈粥樣硬化風險的重要指標之一[9-10]。另外，近年來在家禽上的研究表明，Apob基因不僅在家禽能量代謝[11]、生長繁殖[12]、脂質(zhì)代謝[13-14]等生命活動中發(fā)揮重要作用，而且可作為家禽選育的分子遺傳標記。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術作為第三代基因編輯工具，相較于鋅指核酸酶技術(zinc-finger nucleases，ZFNs)[15]和類轉(zhuǎn)錄激活效應因子技術(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)[16]，具有短時高效、價格實惠、靶向特異性強等優(yōu)點。并且可同時靶向多個基因，因而在大量研究中被廣泛應用。自CRISPR系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)以來，科學家不斷探索將其從細胞分裂與增殖的基本生物學研究應用到癌癥[17-19]、精神病[20]和糖尿病[21-22]等疾病的研究，為疾病的治療提供了新思路和新方向。Schmitt等[23]運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在Vemurafenib敏感的細胞中敲除NES(Nestin)證明，Nestin與黑色素瘤細胞獲得性Vemurafenib耐藥有關。Gao等[24]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除突變Tmc1基因，保留正常Tmc1基因，成功修復了小鼠模型的顯性突變并緩解了聽力喪失。隨著更多Cas系統(tǒng)的開發(fā)，該系統(tǒng)在各種遺傳性神經(jīng)疾病[25]的治療中也存在巨大的潛力。在植物研究領域，編碼CRISPR/Cas系統(tǒng)的載體以往主要是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轟擊的方法導入植物細胞，應用于作物改良。近期，Lin等[26]構建了適用于植物的引導編輯器(plant prime editor, PPE)系統(tǒng)，并在重要作物中完成了引導編輯。另有研究表明，直接使用CRISPR/Cas核糖核蛋白[27-28]能更有效地導入植物細胞，介導植物基因組編輯。目前，CRISPR技術比以往任何技術都更加易用，并且在生物學、農(nóng)業(yè)、微生物等研究領域都顯示出了強大的優(yōu)勢與應用價值。隨著CRISPR技術研究的不斷深入和技術的不斷改進，其應用會越來越廣泛。

隨著居民收入水平的不斷提高，家禽養(yǎng)殖效益向好，我國家禽飼養(yǎng)規(guī)模持續(xù)擴大。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2019年全國家禽出欄146.41億只，較上年增長11.9%。禽肉已成為世界上第二大消費肉類，由于禽肉價格低于其他肉類，禽肉消費快速增長。據(jù)統(tǒng)計，2019年，我國禽肉產(chǎn)量2 239萬噸，較2018年增長5.8%。未來隨著居民肉品消費結構升級，禽肉消費量還將進一步增加。禽肉消費中雞肉消費量占比最大，約為50%。但雞體內(nèi)過度的脂質(zhì)沉積，不僅削減了雞肉的品質(zhì)和收益[29]，而且對雞的生長和繁殖性能[30]也有一定影響。因此，本試驗圍繞雞的脂代謝相關基因——Apob展開，旨在探明其在雞肝脂代謝中的作用，從分子層面為解決家禽的脂質(zhì)沉積問題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

采集9只4周齡黃羽肉雞的心、腦、肝、脾、肺、腎、脂肪、腺胃、腿肌、胸肌、肌胃和小腸等12個組織，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

大腸桿菌 (Escherichiacoli) DH5α、雞胚胎成纖維細胞系(douglas foster-1，DF-1)、pMD-19T Vector、pX330/Cas9質(zhì)粒為本實驗室購買并保存；引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成；限制性內(nèi)切酶BbsI、T7核酸內(nèi)切酶I (T7 endonuclease I，T7EI)均購于New England Biolabs公司；轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE-9購于Roche公司；100×雙抗(青霉素和鏈霉素均為10 000 U·mL-1)、胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM/F12基礎培養(yǎng)基均購于賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗儀器

冷凍離心機5804R(Eppendorf)，PowerPacTMBasic電泳儀(Bio-Rad)，7500 Real time PCR儀(ABI)，制冰機SIM-F140AY6(SANYO)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，超低溫冰箱(Thermo)，Biospectrum 410凝膠成像系統(tǒng)(UVP)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，全溫搖瓶柜 HYG-A(太倉博萊特)，立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-75KBS(上海申安醫(yī)療器械廠)，電熱恒溫水浴鍋DK-8AX(上海一恒科技)，電子天平(上海梅特勒-托利多儀器)。

1.3 試驗方法

1.3.1 雞Apob蛋白理化性質(zhì)分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中雞Apob蛋白氨基酸序列，利用ExPASy數(shù)據(jù)庫分析該蛋白質(zhì)理化性質(zhì),接著通過Pfam數(shù)據(jù)庫進行蛋白結構域分析。

1.3.2 雞各組織中Apob基因mRNA表達情況分析 采用Trizol法[31]提取各組織總RNA，使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit將其反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，按SYBRRPremix Ex TaqTM說明書進行RT-qPCR。結果使用2-ΔCt值分析，采用GraphPad Prism軟件進行作圖。

1.3.3 雞Apob基因敲除載體的構建 本試驗在蛋白N端結構域?qū)耐怙@子上選取3個待敲除位點，設計合成3對sgRNA(表1)。將合成的寡核苷酸鏈(oligonucleotides，oligos)退火形成雙鏈。反應體系：TE Buffer 8 μL，正、反義鏈各1 μL。退火程序：沸水處理5 min后，自然冷卻至室溫。使用T4 DNA連接酶將雙鏈DNA與線性載體pX330/Cas9于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含50 μg·mL-1氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的LB平板。培養(yǎng)12 h后挑取單菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，菌液PCR鑒定后提取陽性菌質(zhì)粒進行測序。將測序成功的陽性菌擴大培養(yǎng)后，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒。

表1 sgRNA序列

1.3.4 DF-1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 DF-1細胞在含1% FBS和1% 100×鏈霉素-青霉素的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞匯合度達90%左右時，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌后，加入0.25% Tyrpsin-EDTA消化。細胞脫落后加入不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基，將細胞吹散后計數(shù)，以3×105個·孔-1的濃度鋪于24孔板。當細胞匯合度約為70%～90%時，使用脂質(zhì)體X-tremeGENE 9 DNA進行轉(zhuǎn)染。以未轉(zhuǎn)染的細胞為空白對照。將1 μg質(zhì)粒按X-tremeGENE 9 DNA(V)∶質(zhì)粒(μg)= 3∶1的比例，轉(zhuǎn)染至DF1細胞。轉(zhuǎn)染48 h后使用3 μg·mL-1嘌呤霉素(puromycin，puro)篩選2～3 d至對照組細胞全部死亡。去除培養(yǎng)基中puro，對陽性細胞擴大培養(yǎng)并提取基因組DNA。

1.3.5 T7EI酶切檢測 以酚氯仿法[32]抽提細胞基因組DNA。利用T7EI酶可識別并切割錯配雙鏈DNA的特點，驗證靶位點敲除活性。根據(jù)靶位點上、下游序列分別設計3對PCR引物(表2)，以基因組DNA為模板擴增靶位點上、下游序列。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴增的目的片段退火后，加入T7EI酶進行酶切。反應體系：PCR退火產(chǎn)物5 μL，NE buffer 1.1 μL，T7EI酶0.5 μL，ddH2O補足體系至11 μL。37 ℃酶切30 min后通過2.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

表2 靶位點的PCR引物序列

1.3.6 TA克隆測序 將擴增的目的片段純化回收后，與pMD-19T載體于16 ℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH5α，涂布于含50 μg·mL-1Amp的LB平板培養(yǎng)12 h后，取20管菌液進行測序。并計算靶位點實際敲除效率。計算公式：敲除效率=發(fā)生突變序列的菌液數(shù)/測序菌液總數(shù)×100%。

1.3.7 熒光定量PCR檢測 分別提取對照組和試驗組細胞RNA，通過RT-qPCR檢測Apob基因敲除后其表達量變化情況。RT-qPCR方法同“1.3.2”。采用公式2-ΔΔCt值分析計算，使用GraphPad Prism軟件進行作圖。并用非配對t檢驗進行數(shù)據(jù)分析。

2 結 果

2.1 雞Apob蛋白理化性質(zhì)分析

Pfam數(shù)據(jù)庫分析結果表明，雞Apob有4個關鍵結構域，2個未知功能結構域以及位于C端和N端的結構域。ExPASy數(shù)據(jù)庫顯示，雞Apob分子式為 C23449H37206N6214O7051S136，相對分子質(zhì)量為523.356 ku，理論pI為8.44。蛋白由4 631個氨基酸組成，其中，亮氨酸含量最多，為10.6%，絲氨酸含量次之，為8.6%，半胱氨酸與色氨酸含量最少，均為0.6%。帶負電荷的殘基總數(shù)為533，帶正電荷的殘基總數(shù)為554。根據(jù)計算結果，Apob不穩(wěn)定性系數(shù)為37.61，歸類為穩(wěn)定蛋白。其脂肪系數(shù)為90.07，平均親水性為-0.300。

以Hphob./Kyte & Doolittle為刻度，利用ProtScale分析蛋白親水性和疏水性(圖1)，該蛋白質(zhì)第10位氨基酸得分最高，為3.289，表明該位點疏水性較強；第285和286位氨基酸得分最低，為-3.122， 表明該位點親水性較強。

2.2 雞Apob基因mRNA組織表達分析

選取9只4周齡雞為試驗材料，取其心、腦、肝、脾、肺、腎、脂肪、腺胃、腿肌、胸肌、肌胃和小腸組織。提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以其為模板進行3次 平行RT-qPCR檢測。檢測結果表明，Apob基因主要在雞的肝、腎和小腸組織中表達(圖2)。

2.3 雞Apob基因Cas9/gRNA敲除載體構建

合成的oligos退火后，瓊脂糖凝膠電泳檢測。泳道2、4、6退火產(chǎn)物與單鏈引物條帶相比差異明顯(圖3)，表明雙鏈DNA形成，退火成功。將雙鏈DNA與線性載體pX330/Cas9連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH5a進行涂板。次日在含50 μg·mL-1Amp平板上，挑取4個單克隆菌落接種于含50 μg·mL-1Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)。泳道2、3、4、5、6試驗組的菌液PCR在100 bp左右有較明顯條帶(圖4)，與預測位置一致。質(zhì)粒測序比對結果表明，基因敲除載體構建成功。

圖1 雞Apob蛋白親水性和疏水性分析Fig.1 Hydrophilic and hydrophobic analysis of chicken Apob protein

圖2 Apob基因在雞各組織中相對表達量Fig.2 Relative expression of Apob gene in chicken tissues

M.DNA相對分子質(zhì)量標準； 1、3、5. sgRNA6～8上游引物； 2、4、6. sgRNA6～8雙鏈產(chǎn)物 M.DL2000 DNA marker； 1,3,5. sgRNA6-8 forward primers； 2，4，6. sgRNA6-8 double strand products圖3 退火產(chǎn)物驗證Fig.3 Verification of annealed products

M.DNA相對分子質(zhì)量標準; 1.對照組; 2～6. sgRNA6～8陽性克隆 M.DL2000 DNA marker; 1.Control; 2-6. Positive clones of sgRNA6-8圖4 PCR 驗證陽性克隆Fig.4 PCR confirmed positive clones

2.4 Cas9/gRNA敲除載體活性驗證

將Cas9/gRNA質(zhì)粒通過X-tremeGENE 9 DNA轉(zhuǎn)染至DF-1，48 h后使用puro篩選陽性細胞，提取基因組。以基因組DNA為模板擴增靶位點6附近500 bp序列、靶位點7附近600 bp序列,靶位點8附近800 bp序列(圖5)，PCR結果顯示，擴增的目的條帶與預測大小一致。接著利用T7EI酶切法驗證Cas9/gRNA的切割活性。在泳道2、4、6試驗組中均檢測到切割片段(圖6)，而在對照組則無切割條帶。說明sgRNA6、sgRNA7、sgRNA8均具有切割活性。

2.5 TA克隆分析敲除效率

將2.4中擴增的目的片段回收后連至pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5a后涂布于Amp抗性的平板上，培養(yǎng)12 h后挑取20個單克隆菌落進行測序。其中，Cas9/gRNA6測序的20管菌液中有6管發(fā)生了突變，突變率為33.3%。Cas9/gRNA7測序的20管菌液中有13管發(fā)生了突變，突變率為65%。Cas9/gRNA8測序的20管菌液中有16管發(fā)生了突變，突變率為80%。其中，突變類型以堿基缺失為主，并且靶位點上、下游的雙鏈均發(fā)生斷裂(圖7)。上述結果表明，Cas9/gRNA6、Cas9/gRNA7、Cas9/gRNA8均具有靶向切割活性，且Cas9/gRNA8靶向切割活性最強。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1、3、5.對照組；2、4、6. sgRNA6～8 PCR產(chǎn)物 M.DL2000 DNA marker; 1,3,5.Control; 2,4,6.sgRNA6-8 products of PCR圖5 PCR 擴增sgRNA靶位點上、下游序列Fig.5 PCR amplified the upstream and downstream sequences of sgRNA targets

M.DNA相對分子質(zhì)量標準; 1、3、5.對照組; 2、4、6. sgRNA6～8酶切產(chǎn)物 M.DL2000 DNA marker; 1, 3, 5. Control; 2, 4, 6. sgRNA6-8 enzyme-digested products圖6 T7EI酶切驗證結果Fig.6 The result of T7EI enzyme digestion

2.6 Apob基因敲除后其mRNA表達水平變化分析

提取對照組和敲除組亞克隆細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后利用RT-qPCR檢測Apob基因mRNA的表達水平。進行3次平行試驗，數(shù)據(jù)采用非配對t檢驗進行分析。結果顯示(圖8)，轉(zhuǎn)染Cas9/gRNA7的細胞中Apob基因mRNA表達水平約下調(diào)99.96%(P<0.01)；轉(zhuǎn)染Cas9/gRNA6的細胞中Apob基因mRNA的表達水平約下調(diào)85%(P<0.01)；轉(zhuǎn)染Cas9/gRNA8的細胞中Apob基因mRNA表達水平約下調(diào)47%(P<0.05)。表明成功敲除了DF-1細胞中Apob基因，并篩選到基因缺陷的亞克隆細胞。

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

圖7 TA克隆測序檢測靶位點突變結果Fig.7 Detection of target site mutation results by TA clone sequencing

****. P<0.01；**. P<0.05圖8 敲除Apob基因的DF-1中Apob mRNA的表達情況Fig.8 Expression of Apob in DF-1 after gene knockout

3 討 論

載脂蛋白家族通過與脂類和膽固醇的結合穩(wěn)定脂蛋白結構，在血漿與組織之間轉(zhuǎn)運脂質(zhì)。隨著研究的不斷深入，載脂蛋白在脂蛋白代謝過程中的功能也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，其不僅調(diào)節(jié)脂蛋白代謝關鍵酶活性，而且還參與脂蛋白受體的識別[33]。其中，Apob在載脂蛋白家族中分子量最大，疏水性也最強，主要參與LDL和VLDL的生成，負責轉(zhuǎn)運內(nèi)源性甘油三酯和膽固醇。

對雞Apob基因mRNA的研究發(fā)現(xiàn)，雞與哺乳動物Apob基因mRNA的大小大致相同，約為14 kb。雞Apob的mRNA負責編碼4 631個氨基酸的Apob。預測分析顯示，Apob共有4個關鍵結構域，其N端和C端分布著兩個重要結構域，分別負責結合脂類和細胞膜上的LDL受體。另外兩個為未知功能結構域。雞Apob為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其脂肪系數(shù)為90.07，平均親水性為-0.300。

哺乳動物中ApobmRNA主要存在于肝和小腸中。Funahashi等[34]檢測表明，Apob基因在大鼠肝、小腸、腎上腺中表達量較高。另外胚胎大鼠在發(fā)育過程中，小腸和胎膜中Apob含量會顯著增加，且高于肝含量。與哺乳動物不同的是，雞Apob的mRNA在腎中含量也較高。Zhang等[11]研究表明，白羽雞Apob基因主要表達于腎、肝和小腸中。蛋雞和肉雞肝中Apob基因的表達量一致，但該基因在蛋雞腎和小腸中表達量高于肉雞。為檢測Apob基因在黃羽肉雞中的表達情況，本試驗選取4周齡雞的12個組織提取RNA進行RT-qPCR。檢測結果表明，Apob基因主要在雞肝、腎及小腸組織中表達，與Zhang等[11]的研究結果一致。肝是禽類生長發(fā)育與能量交換的重要場所，而內(nèi)源性脂類也主要由肝和脂肪合成釋放進入血液。雞的脂肪組織本身不能或者只能少量合成脂酸，Apob可將肝合成和小腸吸收的脂肪轉(zhuǎn)運至肝外組織，用于氧化供能或儲存堆積。另外，禽類肝內(nèi)Apob的合成還受到雌激素的調(diào)節(jié)，但在腎和小腸組織中的表達卻不受雌激素影響[35]。

脂肪沉積是由多基因控制的復雜過程。家禽體內(nèi)不同部位脂肪沉積速度和量并不相同，肉雞以腹脂沉積量為最高，其次是頸部脂肪和腿部皮下脂肪[36]。研究表明，8周齡仔雞腹脂重量是頸部脂肪的3.4倍，腿部脂肪的4倍[37]。雞的腹脂性狀遺傳力較為穩(wěn)定[38]，從遺傳育種方面選育優(yōu)質(zhì)肉雞效果較為理想[39-40]。因此，為探究Apob基因在雞肝脂代謝過程中的作用，對雞Apob基因進行敲除試驗具有重要意義。與以往的基因編輯技術相比，CRISPR/Cas技術具有明顯的優(yōu)勢，研究人員只要設計和制造用于基因組定位的RNA序列，就能精準靶向目標基因，實現(xiàn)對特定基因的破壞、修復、關閉和啟動。因此本試驗利用CRISPR/Cas9技術，設計合成靶向Apob基因的3對sgRNA，構建重組表達載體，在DF-1細胞系上進行敲除活性驗證。將構建成功的Cas/gRNA轉(zhuǎn)染至DF-1細胞后，提取基因組DNA，通過PCR擴增、T7EI酶切驗證靶位點敲除活性。T7EI酶切顯示，Cas/gRNA載體均可發(fā)揮敲除活性，且sgRNA6切割活性最強。為明確基因編輯類型，利用TA克隆測序進行檢測。測序結果表明，突變類型以堿基缺失為主，且Cas/gRNA8敲除效率高達80%。RT-qPCR結果顯示，轉(zhuǎn)染Cas9/gRNA7、Cas9/gRNA6和Cas9/qRNA9的細胞中Apob基因mRNA表達水平分別約下調(diào)99.96%(P<0.01)、85%(P<0.01)和47%(P<0.05)。

4 結 論

本研究揭示了雞Apob是相對分子質(zhì)量為523.356 ku，平均親水性為-0.300的穩(wěn)定蛋白質(zhì)；Apob基因主要在雞肝、腎及小腸組織中表達；另外成功構建了雞Apob基因的敲除載體，并檢測到基因敲除的亞克隆細胞中Apob基因mRNA水平顯著下調(diào)；為探明Apob基因在雞肝脂代謝中的功能及家禽的良種選育提供了新方向。