李 卿,居 漪,唐麗萍,金中淦,孫賀偉
(上海市臨床檢驗(yàn)中心,上海 200126)
載脂蛋白(apolipoprotein,apo) B是致動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白的成分之一,其含量可體現(xiàn)低密度脂蛋白的顆粒數(shù),尤其在評(píng)價(jià)伴有代謝綜合征和糖尿病的動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病時(shí)有重要的臨床意義[1]。apo A1作為抗動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志物,與apo B的比值可用于特定人群的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和臨床決策[2]。
目前,apo A1和apo B的檢測(cè)主要采用免疫透射比濁法(immunoturbidimetry,ITA)。試劑盒中的抗體對(duì)apo抗原親和力的差異、抗原決定簇的異質(zhì)性、apoA-I和apoB在不同脂蛋白中的結(jié)構(gòu)等因素,造成不同品牌試劑盒檢測(cè)結(jié)果存在差異。實(shí)驗(yàn)室在采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)人血清apo進(jìn)行絕對(duì)定量方面已經(jīng)積累了一定的經(jīng)驗(yàn)[3-4]。apo A1和apo B的質(zhì)譜定量方法一般為同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(isotope dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry,ID-LC-MS)技術(shù),即采用同位素標(biāo)記多肽,結(jié)合可溯源的血清校準(zhǔn)品,對(duì)apo A1和apo B進(jìn)行絕對(duì)定量[5]。目前尚未見(jiàn)ID-LC-MS/MS技術(shù)應(yīng)用于apo A1和apo B室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(external quality assessment,EQA)的報(bào)道。本研究在前期建立相關(guān)技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上,結(jié)合EQA結(jié)果,探討ID-LC-MS/MS賦值作為EQA靶值的應(yīng)用潛力。
1.1.1 血清樣本 血清樣本質(zhì)譜法定量所使用的校準(zhǔn)品為人血清制品,由荷蘭萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心提供;apo A1和apo B由美國(guó)西北脂類(lèi)代謝和糖尿病研究實(shí)驗(yàn)室賦值,分別溯源至世界衛(wèi)生組織參考物質(zhì)SP1-01和SP3-08;5份EQA樣本為人血清制品(編號(hào)分別為EQA1、EQA2、EQA3、EQA4和EQA5),購(gòu)自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司,用于上海市臨床檢驗(yàn)中心組織的2017年EQA活動(dòng)。樣本經(jīng)過(guò)均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn),符合要求。
1.1.2 同位素標(biāo)記物質(zhì)和試劑 合成肽段VQPYLDDFQK和肽段TEVIPPLIENR中的亮氨酸(L)為同位素標(biāo)記的氨基酸(13C15N)[吉爾生化(上海)有限公司],二硫鍵還原劑三膦鹽酸鹽(美國(guó)Thermo Fisher公司),碘乙酰胺、脫氧膽酸鈉、Tris緩沖液、甲醇、甲酸(美國(guó)Sigma-Aldrich公司),Promega胰蛋白酶(測(cè)序級(jí),上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)。
1.1.3 儀器 Agilent 1290 超高效液相系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司),AB5500 QTRAP三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)。稱(chēng)量使用賽多利斯型分析天平(美國(guó)Sartorius公司)。色譜柱使用Zorbax eclipse SB-C18(2.1 mm×150 mm,1.8 μm,美國(guó)Agilent公司)。
1.2.1 目標(biāo)肽選擇 定量肽段用于定量apo A1和apo B的絕對(duì)含量。定性肽段用于確認(rèn)和排除干擾。肽段選擇見(jiàn)表1。
表1 apo A1和apo B的肽段及母離子/子離子對(duì)
1.2.2 樣本前處理 用胰蛋白酶酶解5份人血清EQA樣本,所有的溶液均為新鮮配制,按照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行操作。(1)變性:樣本20倍稀釋后,使用0.523%脫氧膽酸鈉Tris溶液增溶,加入還原劑三膦鹽酸鹽,使其在反應(yīng)體系中的終濃度為0.46%,56 °C 變性30 min,打開(kāi)二硫鍵。(2)烷基化:取出變性樣本放置于室溫冷卻。每支樣本加入4.6 mmol/L碘乙酰胺20 μL,室溫避光放置30 min。(3)酶解:每支樣本加入胰蛋白酶酶液24 μL,37 ℃酶解3 h,加入終止液(4.7%甲醇和0.6%甲酸的水溶液)終止。
1.2.3 ID-LC-MS/MS分析 (1)液相色譜部分。流動(dòng)相A為5%甲醇和0.05%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為95%甲醇和0.05%甲酸水溶液,流速為0.3 mL/min。洗脫梯度:流動(dòng)相B為0.0~6.0 min 15%~85%;6.0~8.0 min 85%;8.0~8.1 min 85%~100%;8.1~10.0 min 100%;10.1~15.0 min 100%~15%。(2)質(zhì)譜部分。使用正離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法,母離子/子離子對(duì)的選擇見(jiàn)表1。
1.2.4 ITA分析 EQA參加者按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,采用ITA分析5份EQA樣本。
建立ID-LC-MS/MS校準(zhǔn)方程,以待測(cè)樣品的未標(biāo)記定量肽和同位素標(biāo)記定量肽的比值為自變量,通過(guò)校準(zhǔn)方程計(jì)算含量并進(jìn)行校準(zhǔn)。使用統(tǒng)計(jì)軟件JMP 13.2繪制箱線(xiàn)圖。采用Minitab 18.0軟件進(jìn)行Deming回歸分析。
共有340家實(shí)驗(yàn)室使用ITA檢測(cè),apo A1和apo B的EQA結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 apo A1和apo B的EQA結(jié)果
ID-LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果為重復(fù)檢測(cè)3次得到的均值。apo A1項(xiàng)目EQA1、EQA2、EQA3、EQA4、EQA5的定量檢測(cè)結(jié)果分別為2.36、1.71、2.52、0.86和1.47 g/L;apo B項(xiàng)目EQA1、EQA2、EQA3、EQA4、EQA5的定量檢測(cè)結(jié)果分別為1.36、1.07、1.50、0.57和0.84 g/L。
apo A1項(xiàng)目,EQA2、EQA3、EQA4 IDLC-MS/MS的結(jié)果均低于ITA的中位數(shù),EQA1和EQA5 ID-LC-MS/MS的結(jié)果高于ITA的中位數(shù);apo B項(xiàng)目,除EQA4外,其他樣本IDLC-MS/MS的結(jié)果均低于ITA的中位數(shù);見(jiàn)圖1??紤]到ID-LC-MS/MS和ITA的誤差,采用Deming回歸分析,結(jié)果顯示apo A1項(xiàng)目斜率的95%可信區(qū)間為0.977~0.992,截距的95%可信區(qū)間為0.008~0.035;apo B項(xiàng)目斜率的95%可信區(qū)間為0.828~1.054,截距的95%可信區(qū)間為-0.122~0.144。見(jiàn)圖2。
圖1 ID-LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果和EQA結(jié)果箱線(xiàn)圖
圖2 Deming回歸分析結(jié)果
目前正在運(yùn)行的apo標(biāo)準(zhǔn)化體系使用的參考物質(zhì)包括世界衛(wèi)生組織參考物質(zhì),編號(hào)分別是SP1-01和SP3-08,此二級(jí)參考物質(zhì)由國(guó)際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)的apo標(biāo)準(zhǔn)化工作組研制,由該工作組的組織方——美國(guó)西北脂類(lèi)代謝和糖尿病研究實(shí)驗(yàn)室賦值,采用免疫法測(cè)定。定值所使用的一級(jí)參考物質(zhì)包括BCR-CRM393(純化apo A1)和密度為1.03~1.05的超速離心純化的低密度脂蛋白(用于apo B)。但是免疫法作為參考方法可能會(huì)受交叉反應(yīng)、自身抗體[7]、親和力減弱、抗原表位變性等因素干擾。近年來(lái),有學(xué)者嘗試使用質(zhì)譜來(lái)更準(zhǔn)確地測(cè)定apo A1和apo B[8-9],其中Cobbaert教授團(tuán)隊(duì)建立的質(zhì)譜定量方法最為成熟[5],是國(guó)際臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)apo質(zhì)譜檢測(cè)工作組的指定檢測(cè)方法。
ID-LC-MS/MS是對(duì)靶向蛋白質(zhì)絕對(duì)定量的重要方法,其將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽加入到胰酶酶切產(chǎn)生的多肽中,由于內(nèi)標(biāo)肽和內(nèi)源性肽具有相同的序列,因此具有相同的液相色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜離子化效率和碎裂模式。通過(guò)比較兩者子離子信號(hào)強(qiáng)度,可計(jì)算出目標(biāo)蛋白質(zhì)的量。基于ID-LC-MS的apo參考方法和標(biāo)準(zhǔn)化研究是近年來(lái)的研究熱點(diǎn),但尚未見(jiàn)將該技術(shù)應(yīng)用于EQA樣本定值和評(píng)價(jià)的研究報(bào)道。
對(duì)于定義分析質(zhì)量,2014年米蘭戰(zhàn)略會(huì)議提出了3個(gè)模型,即基于檢測(cè)性能對(duì)臨床結(jié)果影響的模型1、基于被測(cè)量生物變異的模型2和基于現(xiàn)有最高技術(shù)水平的模型3[10-11]?!吨袊?guó)成人血脂異常防治指南(2016年修訂版)》(簡(jiǎn)稱(chēng)指南)對(duì)apo A1和apo B的偏移規(guī)定為靶值±5%[12],該指南明確說(shuō)明“靶值一般指參考(標(biāo)準(zhǔn))物質(zhì)定值或參考方法測(cè)定值”。因此,當(dāng)以靶值±5%作為判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí),所有參與者檢測(cè)5個(gè)EQA樣本的平均合格率分別為61.5%(apo A1)和41.0%(apo B)。從最新的生物變異數(shù)據(jù)庫(kù)中計(jì)算偏移[13],得出apo A1的最低偏移要求為4.6%(適中為3.0%,最優(yōu)為1.5%),與指南規(guī)定的5%接近;而apo B的最低偏移要求為8.1%(適中為5.4%,最優(yōu)為2.7%),比指南規(guī)定的5%要求更松,此時(shí)所有參與者檢測(cè)5個(gè)EQA樣本的平均合格率上升至61.8%。值得注意的是,WS/T 403—2012《臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量指標(biāo)》指出,中等和低等偏移造成錯(cuò)誤診斷的發(fā)生率分別為14%和32%,但apo A1和apo B的偏移與錯(cuò)誤診斷發(fā)生率仍需進(jìn)一步研究。若采用美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)使用的標(biāo)準(zhǔn),即靶值±15%,所有參與者檢測(cè)5個(gè)EQA樣本的平均合格率分別為95.1%(apo A1)和89.7%(apo B)。
綜上所述,在需要使用靶值評(píng)價(jià)的臨床指南或者EQA工作中,基于ID-LC-MS/MS的候選參考方法具有一定的應(yīng)用潛力。