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    冰凍人血清α-淀粉酶催化活性濃度候選二級標準物質(zhì)的研制

    2021-03-30 04:54:40王建兵韓麗喬林海標張喬軒莊俊華黃憲章
    檢驗醫(yī)學 2021年3期
    關鍵詞:定值淀粉酶穩(wěn)定性

    王建兵,韓麗喬,林海標,張喬軒,嚴 君,莊俊華,黃憲章

    (廣東省中醫(yī)院檢驗醫(yī)學部,廣東 廣州 510120)

    血清、尿液α-淀粉酶測量是臨床上最常用的實驗室檢測指標之一,在胰腺疾病,特別是急性胰腺炎的診斷、療效觀察中具有重要作用。淀粉酶是急性胰腺炎早期診斷指標[1],為解決臨床檢驗血清淀粉酶測量結(jié)果的正確性,實現(xiàn)測量結(jié)果的可溯源性和臨床檢驗結(jié)果可比、互認,減少重復檢查,減輕患者負擔,本實驗室制備了2個水平的冰凍人血清α-淀粉酶催化活性濃度候選二級標準物質(zhì)。

    1 材料和方法

    1.1 儀器與試劑

    cobas 8000全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)及配套試劑、校準品和質(zhì)控品,U-3310分光光度計(日本日立公司)。參考方法試劑:N-2-羥基乙基哌嗪-N'-乙基磺酸(批號為017K5410,美國Sigma公司),4,6-亞乙基-4-硝基苯-α-(1->4)-D-麥芽七糖(批號為121214A,北京阿匹斯公司)。有證參考物質(zhì)IRMM/IFCC-456(歐盟參考物質(zhì)和測量研究中心)。

    1.2 標準物質(zhì)樣本制備

    選擇外觀清亮,無脂血、黃疸和溶血的樣本。乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋體抗體、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體檢測陰性。經(jīng)2次除菌過濾后,分裝至無菌收集管中,每支1 mL,共300支。制備了2個水平的標準物質(zhì),可-70 ℃冰箱保存。

    1.3 標準物質(zhì)評價

    按照JJF 1343—2012《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》和JJF 1644—2017《臨床酶學標準物質(zhì)的研制》要求進行均勻性、穩(wěn)定性、互換性評價[2-3],所有樣本均采用cobas 8000全自動生化分析儀測量。

    1.3.1 均勻性檢驗 取15支樣本,在1個批次內(nèi)完成測量,每支樣本重復測量3次。結(jié)果采用單因素方差分析進行評價。方差分析結(jié)果中的組間方差MSamong>組內(nèi)方差MSwithin時,樣本間均勻性的標準偏差sbb計算公式為:

    式中ubb,rel為α-淀粉酶由于樣本不均勻性引入的不確定度分量。

    1.3.2 穩(wěn)定性評價 采用同步穩(wěn)定性進行評估,結(jié)果采用回歸分析的t檢驗進行評價,基本模型為:Y=β0+β1X,式中β1、β0為回歸系數(shù),X為時間,Y為標準物質(zhì)的特性值。(1)短期穩(wěn)定性評價。評價運輸對標準物質(zhì)待定特性值的影響。分別于第1、2、3天從冰箱中取出樣本,放入干冰冷凍包裝箱,與第5天從儲存冰箱中取出的樣本同時進行測量。每個水平1個監(jiān)測點抽取2支樣本,4個監(jiān)測點合計8支樣本。在1個批次內(nèi)完成測量,每支樣本重復測量3次。(2)長期穩(wěn)定性評價。評價標準物質(zhì)-70 ℃保存1年的穩(wěn)定性。分別于第0、7、31、90、182天從-70 ℃冰箱中取出樣本,放入液氮瓶中,與第365天從-70 ℃冰箱中取出的樣本同時進行測量。每個水平1個監(jiān)測點抽取3支樣本,共6個監(jiān)測點,合計18支樣本,在1個批次內(nèi)完成測量,每支樣本重復測量3次。(3)使用時穩(wěn)定性評價。評價標準物質(zhì)使用時儲存于冰箱(2~8 ℃)或室溫(20~25 ℃)的穩(wěn)定性。分別于24、6、4、2 h從-70 ℃冰箱中取出4支樣本,冰箱或室溫各放置2支,與測量前從-70 ℃冰箱中取出的樣本同時進行測量。每個水平1個監(jiān)測點抽取4支樣本,冰箱或室溫環(huán)境各放置2支,進行穩(wěn)定性檢驗,共5個監(jiān)測點,合計20支樣本。在1個批次內(nèi)完成測量,每支樣本重復測量3次。(4)穩(wěn)定性引入的不確定度。由穩(wěn)定性引入的不確定度計算公式為:us=s(β1)×X,式中us為由穩(wěn)定性引入的不確定度,s(β1)為β1的標準偏差,X為給定的保存期限。

    1.3.3 互換性評價 互換性采用最小二乘法進行線性回歸分析。(1)參比檢測系統(tǒng)。實驗室參照2006年國際檢驗醫(yī)學溯源性聯(lián)合委員會推薦的α-淀粉酶參考測量程序(37 ℃)[4]建立一級參考方法[5]。(2)臨床評價檢測系統(tǒng)。系統(tǒng)1:瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀及配套試劑(AMY384295)、校準品(cfas,lot:305596)和測量程序;系統(tǒng)2:美國貝克曼庫爾特公司AU5800全自動生化分析儀及配套試劑(AMY6159)、校準品(lot:F6662)和測量程序;系統(tǒng)3:瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀、深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司試劑(AMY 142819001)、校準品(059318006)和測量程序;系統(tǒng)4:瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀、四川邁克生物股份有限公司試劑(AMY0518061)、校準品(Lot:366059)和測量程序。(3)樣本。共20份新鮮單供體人血清樣本,濃度范圍覆蓋標準物質(zhì)濃度范圍,每個樣本重復測量2次。

    1.4 定值

    1.4.1 定值方法 定值依據(jù)參考文獻[4-5]進行(同參比檢測系統(tǒng))。2個水平的標準物質(zhì)每日分別測量3次,連續(xù)測量3 d,共9個測量結(jié)果。

    1.4.2 定值方式 由6家通過中國合格評定國家認可委員會認可的參考(校準)實驗室聯(lián)合定值。

    1.4.3 定值及其引入的不確定度計算 根據(jù)測定數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布狀態(tài),組間數(shù)據(jù)是否為等精度進行計算[2]。

    1.4.4 結(jié)果檢驗 采用Shapiro-Wilk進行正態(tài)分布檢驗,采用格拉布斯(Grubbs)法進行組內(nèi)可疑值檢驗和各組數(shù)據(jù)平均值顯著性檢驗,組間數(shù)據(jù)等精度檢驗采用科克倫(Cochran)法。

    1.4.5 標準值的不確定度評定 標準物質(zhì)的合成標準不確定度(uCRM)計算公式為:

    式中ubb為由甁間不均勻性引入的標準不確定度,ults為由長期(1年)不穩(wěn)定性引入的標準不確定度,usts為由短期不穩(wěn)定性引入的標準不確定度,uchar為由定值引入的標準不確定度。擴展不確定度(UCRM)按照公式:UCRM=合成標準不確定度(uCRM)×κ計算,式中κ為包含因子,此處κ=2(置信水平為95%)。

    2 結(jié)果

    2.1 均勻性單因素方差分析

    根據(jù)自由度(14,30)及設定的顯著性水平(α=0.05),通過F值分布臨界值表查到臨界Fα=2.04,標準物質(zhì)的F值分別為1.232(水平1)、1.656(水平2),F(xiàn)<Fα,顯示標準物質(zhì)具有良好的均勻性。見表1。

    表1 α-淀粉酶標準物質(zhì)均勻性單因素方差分析結(jié)果

    2.2 穩(wěn)定性評價結(jié)果

    均值與時間關系的直線回歸方程為直線斜率|β1|<t0.95,n-2·s(b1),式中n-2為自由度,P=0.95,s(b1)為直線斜率的標準偏差,斜率不顯著,未觀測到不穩(wěn)定性,表明在規(guī)定的時間內(nèi)均穩(wěn)定。見表2。

    表2 穩(wěn)定性評價結(jié)果

    2.3 互換性評價結(jié)果

    各系統(tǒng)回歸方程的r2>0.009 5,測量結(jié)果位于95%可信區(qū)間上、下限內(nèi)。見表3。

    表3 標準物質(zhì)互換性評價結(jié)果

    2.4 定值結(jié)果和不確定度

    采用格拉布斯(Grubbs)法進行組內(nèi)可疑值檢驗和各組數(shù)據(jù)平均值顯著性檢驗,結(jié)果顯示組內(nèi)無可疑值。各實驗室平均值之間無顯著性差異,等精度檢驗的臨界值為0.422 9。其他結(jié)果見表4。

    表4 α-淀粉酶標準物質(zhì)定值結(jié)果和擴展不確定度

    3 討論

    利用冰凍混合人血清研制酶學二級標準物質(zhì),甚至一級標準物質(zhì),原料無基質(zhì)效應,均勻性良好,穩(wěn)定性可靠,但不易購買到。為解決我國同類產(chǎn)品供應不足的問題,本實驗室聯(lián)合其他5家參考實驗室,采用聯(lián)合定值的方法,研制了2個水平的α-淀粉酶冰凍混合人血清候選二級標準物質(zhì)。聯(lián)合定值實驗室均通過了中國合格評定國家認可委員會依據(jù)ISO/IEC 17025和ISO 15195標準的認可,定值使用的方法為國際檢驗醫(yī)學溯源性聯(lián)合委員會推薦的一級參考方法[4],所得結(jié)果直接溯源到國際單位,解決了我國商品化試劑盒校準品長期缺乏溯源性的問題。通過聯(lián)合定值,避免了單個實驗室產(chǎn)生的偏移,定值結(jié)果更可靠。

    穩(wěn)定性評估采用同步穩(wěn)定性評估,將所有樣本保存在液氮條件下,在同一時間使用同一檢測系統(tǒng)進行檢測,避免了檢測系統(tǒng)不同時間、不同批號試劑或校準品,甚至儀器不同狀態(tài)引起的偏移。在測量過程中,測量樣本較多,且放置于開口樣本杯中,應縮短測量批之間的時間,否則測量結(jié)果變異較大。本研究研制的2個水平α-淀粉酶冰凍混合人血清候選二級標準物質(zhì)的均勻性良好,可至少穩(wěn)定1年,但與美國國家標準和技術(shù)研究所研制的標準物質(zhì)909c相比,穩(wěn)定期仍然較短。本實驗室將繼續(xù)監(jiān)測,以分析標準物質(zhì)穩(wěn)定性的更長期限。

    本研究采用科克倫(Cochran)法檢驗各實驗室間數(shù)據(jù)的等精度。選取的顯著性水平α不同,其判斷標準也不同。若最大方差與所有實驗室方差和之比<α=0.05的科克倫(Cochran)檢驗臨界值C,表明各實驗室數(shù)據(jù)平均值為等精度;若>α=0.05、<α=0.01的科克倫(Cochran)檢驗臨界值C,表明該標準物質(zhì)被檢驗的最大方差組為歧離值,與各實驗室核實并確認測量方法、測量條件及操作過程均無誤后,仍按等精度處理;若>α=0.01的科克倫(Cochran)檢驗臨界值C在經(jīng)確認測量方法、測量條件及操作過程均無誤后,應慎重采用不等精度加權(quán)方式處理。

    本實驗室研制的冰凍混合人血清α-淀粉酶候選二級標準物質(zhì)均勻性好,穩(wěn)定性符合預期,具有可溯源性和互換性,對推動酶學檢驗的標準化進程意義重大。

    (致謝:感謝上海市臨床檢驗中心居漪,四川邁克生物科技股份有限公司孫可其,美康生物科技股份有限公司沈敏,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司王英國,北京利德曼生化股份有限公司劉春龍在標準物質(zhì)研制過程中給與的幫助。)

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