嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種共生關(guān)系的研究進(jìn)展

崔欣，孫亞琳，王開云，王哲，梁琰，徐振上，王婷

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

酸奶是最受歡迎的發(fā)酵乳，通常是由嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）共培養(yǎng)使牛奶酸化和凝膠化而成[1]。兩菌在牛乳環(huán)境中的協(xié)同共生是一個(gè)非常復(fù)雜的相互作用體系，產(chǎn)生多種相互作用關(guān)系。研究表明，兩菌混合發(fā)酵較單一菌種發(fā)酵更有利于酸奶風(fēng)味的形成。本文從主要代謝途徑、脲酶、NADH氧化酶、谷胱甘肽、雙組分系統(tǒng)等方面論述了兩菌的協(xié)同共生關(guān)系，并通過探究?jī)删采鷷r(shí)產(chǎn)酸能力、產(chǎn)黏能力及風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生等變化，闡明兩菌共生對(duì)酸奶風(fēng)味形成的影響，從而為研究發(fā)酵劑菌株的共生關(guān)系及提高酸奶的品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 兩菌混合發(fā)酵過程中的共生關(guān)系

1.1 營(yíng)養(yǎng)水平的共生關(guān)系

1.1.1 主要代謝途徑

1.1.1.1 蛋白質(zhì)代謝

S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus生長(zhǎng)所需氮源主要為小分子肽類和氨基酸，雖然牛乳中蛋白質(zhì)總量較高，但小分子肽類和游離氨基酸的含量較低，從而限制兩菌生長(zhǎng)。L.delbrueckiisubsp.bulgaricus含有胞外蛋白酶PrtB，兩菌共同培養(yǎng)時(shí)，能夠降解酪蛋白產(chǎn)生甲硫氨酸、組氨酸、脯氨酸等大量氨基酸[2-4]。而S.thermophilus的蛋白酶PrtS降解酪蛋白能力弱，不能直接從牛奶環(huán)境中獲取生長(zhǎng)所需氨基酸，但與L.delbrueckii subsp.bulgaricus共同培養(yǎng)后，可通過amiABCDE（一個(gè)負(fù)責(zé)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)的操縱子）上調(diào)等方式獲取L.delbrueckii subsp.bulgaricus水解產(chǎn)生的氨基酸，促進(jìn) S.thermophilus的生長(zhǎng)[5-8]。除此之外，S.thermophilus能合成L.delbrueckii subsp.bulgaricus無法合成的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸3種支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAA），在共同培養(yǎng)生長(zhǎng)高峰期，控制3種BCAA合成的酶含量均有所提高，故 L.delbrueckii subsp.bulgaricus通過促進(jìn) S.thermophilus合成BCAA滿足彼此對(duì)氨基酸的需求[3，9]。綜上所述，在共生條件下兩菌對(duì)氨基酸的需求得到滿足，從而促進(jìn)了發(fā)酵。而且很多的氨基酸和短肽能夠形成乳制品特有的風(fēng)味[10]，這對(duì)提高酸奶的品質(zhì)具有重要意義。

1.1.1.2 糖代謝

S.thermophilus依靠乳糖通透酶（lactose enzyme，LacS）運(yùn)輸乳糖，并通過β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，LacZ）水解產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖[11-13]。但S.thermophilus對(duì)半乳糖的代謝較弱，多數(shù)只能利用葡萄糖經(jīng)糖酵解（embden-meyerhof pathway，EMP）途徑產(chǎn)生乳酸[14-15]。L.delbrueckii subsp.bulgaricus依靠磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）運(yùn)輸乳糖，幾乎不利用半乳糖[2，8]。LIU等的研究表明，兩者混合發(fā)酵時(shí)S.thermophilus為L(zhǎng).delbrueckii subsp.bulgaricus提供丙酮酸，經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生乳酸[16]。乳糖被分解為葡萄糖和半乳糖，葡萄糖被用以產(chǎn)生乳酸，乳酸產(chǎn)生時(shí)pH值降低有利于酪蛋白沉降，并且半乳糖較乳糖容易被人體吸收。綜上所述，乳酸和半乳糖的產(chǎn)生提高了兩菌共同發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)黏能力，有助于酸奶獨(dú)特風(fēng)味的形成，有助于促進(jìn)人體對(duì)酸奶中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收。

1.1.1.3 核苷酸堿基代謝

核苷酸是合成RNA和DNA的前體，在細(xì)胞代謝中起重要作用[5]。其合成過程分為兩步：先由5-磷酸核糖-1-焦磷酸（phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP）合成次黃嘌呤核苷酸（hypoxanthine nucleotide，IMP），再由IMP經(jīng)過不同的途徑形成腺嘌呤核苷酸（adenosine monophosphate，AMP） 和鳥嘌呤核苷酸（guanosine monophosphate，GMP）。在牛乳環(huán)境中，限制S.thermophilus生長(zhǎng)的主要因素是嘌呤核苷酸類物質(zhì)?；旌习l(fā)酵時(shí)，S.thermophilus中合成嘌呤核苷酸類物質(zhì)相關(guān)酶的表達(dá)受抑制，同時(shí)編碼嘌呤類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因出現(xiàn)超表達(dá)現(xiàn)象，由此得出L.delbrueckii subsp.bulgaricus為S.thermophilus提供了嘌呤核苷酸類物質(zhì)[17]。限制L.delbrueckii subsp.bulgaricus生長(zhǎng)的主要因素是甲酸和葉酸。甲酸是嘌呤合成的前體，L.delbrueckii subsp.bulgaricus缺少丙酮酸甲酸裂解酶，無法合成嘌呤類物質(zhì)的前體甲酸[18]。兩菌混合發(fā)酵時(shí)，S.thermophilus可在缺氧條件下利用EMP途徑中的丙酮酸為L(zhǎng).delbrueckii subsp.bulgaricus提供甲酸[19]。此外葉酸是參與嘌呤和氨基酸生物合成的輔助因子，基因組序列分析顯示L.delbrueckii subsp.bulgaricus中葉酸的生物合成途徑不完整[20-22]。兩菌共生時(shí)，S.thermophilus能夠?yàn)長(zhǎng).delbrueckii subsp.bulgaricus提供生長(zhǎng)所需的葉酸。綜上所述，兩菌混合發(fā)酵時(shí)，S.thermophilus為L(zhǎng).delbrueckii subsp.bulgaricus提供了甲酸和葉酸，故L.delbrueckii subsp.bulgaricus可以大量合成嘌呤類物質(zhì)，滿足二者需求，從而有利于兩菌共生[23]。

1.1.2 脲酶

脲酶能夠催化尿素分解為氨和二氧化碳，多數(shù)研究表明S.thermophilus是唯一顯示出脲酶活性的乳酸菌[24]。無論是單獨(dú)培養(yǎng)還是與L.delbrueckii subsp.bulgaricus共同培養(yǎng)，脲酶都是限制其生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子[25-27]。脲酶能促進(jìn)S.thermophilus乳糖的利用和乳酸、乙醛的產(chǎn)生[26-27]。而且脲酶的活性越高，發(fā)酵過程中消耗的乳糖越多，產(chǎn)生的乳酸越多[27]。二氧化碳參與多數(shù)L.delbrueckii subsp.bulgaricus的酸化，Yamauchi等研究發(fā)現(xiàn)，兩菌共生時(shí)S.thermophilus的脲酶活性通過影響二氧化碳的含量，從而影響對(duì)二氧化碳響應(yīng)的L.delbrueckii subsp.bulgaricus的酸化[24]。兩菌共培養(yǎng)物的有效酸化對(duì)于酸奶地發(fā)酵非常重要，有效的酸化可以防止污染物的擴(kuò)散并降低發(fā)酵過程的生產(chǎn)成本[24]。

1.1.3 其他

兩菌共培養(yǎng)過程中，長(zhǎng)鏈脂肪酸（long chain fatty acid，LCFA）對(duì)兩菌共生作用也存在影響，如圖1所示。Partanen等[28]表明L.delbrueckii subsp.bulgaricus缺乏LCFA從頭合成所需的部分生物途徑，外源添加的LAFC對(duì)其生長(zhǎng)有刺激作用。Sander等[29]認(rèn)為S.thermophilus能合成LCFA，兩菌共生時(shí)S.thermophilus能夠向L.delbrueckii subsp.bulgaricus提供LCFA。

圖1 酸奶發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的共生關(guān)系Fig.1 Symbiotic relationship between yogurt starter Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus

盡管兩菌在牛乳環(huán)境中共生的現(xiàn)象非常普遍，但也有大量研究表明，部分S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus之間存在不同程度的拮抗作用。可能是受3個(gè)方面因素的影響：一是兩菌在產(chǎn)酸、酸脅迫耐受能力及最適生長(zhǎng)條件等方面存在差異；二是兩菌生長(zhǎng)過程中均需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，故兩者之間存在競(jìng)爭(zhēng)；三是L.delbrueckii subsp.bulgaricus代謝生成細(xì)菌素等生長(zhǎng)抑制物會(huì)對(duì)S.thermophilus產(chǎn)生抑制，從而影響兩菌之間的協(xié)同效果[30-31]。因此，S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus在牛乳環(huán)境中的共生作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

1.2 抵抗環(huán)境脅迫水平的共生關(guān)系

1.2.1 抵抗氧脅迫——NADH氧化酶

S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus是兼性厭氧菌，溶解氧（dissolved oxygen，DO）對(duì)兩菌的生長(zhǎng)存在影響。DO濃度超過1 mg/kg時(shí)即可抑制發(fā)酵[32-33]。YASUKO等[33]通過測(cè)定發(fā)酵乳中H2O2和DO濃度，發(fā)現(xiàn)兩菌共生時(shí)DO主要由S.thermophilus去除。但由于S.thermophilus缺乏血紅素導(dǎo)致無法合成細(xì)胞色素氧化酶，其通過NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）消耗DO。NADH氧化酶是一種氧化還原酶類，能夠催化NADH氧化為NAD+并消耗氧氣。MARTY等[34]研究發(fā)現(xiàn)，NADH氧化酶催化反應(yīng)過程中有H2O2生成。YASUKO等通過構(gòu)建S.thermophilus NADH氧化酶敲除突變體（△nox）證明了NADH氧化酶是主要耗氧酶[33]。綜上所述，兩菌共生時(shí)通過NADH氧化酶消耗DO值進(jìn)而主動(dòng)產(chǎn)酸，有利于兩菌共生。

1.2.2 抵抗氧、酸脅迫——谷胱甘肽

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵連接的三肽化合物，具有清除自由基、提高細(xì)胞脅迫抗性等作用[35-37]。與普通寡肽相比，GSH的特殊性在于它有一個(gè)γ-肽鍵，在生物體內(nèi)不會(huì)被一般的肽酶水解，從而提高其穩(wěn)定性[38]。S.thermophilus不僅可以吸收外源的GSH，還可以通過自身的谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GshF）一步合成GSH。WANG等研究證明不論S.thermophilus外源吸收還是自身合成的GSH均能保護(hù)其自身抵抗氧、酸脅迫[39-40]。同時(shí)，在研究中還發(fā)現(xiàn)，S.thermophilus將對(duì)其自身有利的GSH轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，提供給自身不能合成GSH的L.delbrueckii subsp.bulgaricus，促進(jìn)L.delbrueckii subsp.bulgaricus的生長(zhǎng)和抵抗酸脅迫能力，即兩菌有建立在GSH基礎(chǔ)上的共生作用[39]。

1.3 雙組分系統(tǒng)

雙組分系統(tǒng)（two-component system ，TCS）是細(xì)菌進(jìn)行環(huán)境傳感和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機(jī)制之一[41]。TCS主要是由檢測(cè)刺激的組氨酸蛋白激酶（histidine protein kinase，HPK）和充當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（response regulator，RR）兩部分組成，它們通過磷酸化和去磷酸化反應(yīng)進(jìn)行信號(hào)的傳遞[42]。THEVENARD等[43]研究發(fā)現(xiàn)，S.thermophilus LMD-9的基因組中存在8個(gè)反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，當(dāng)與L.delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC11842共培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)了rr02和rr09兩個(gè)反應(yīng)調(diào)節(jié)子的顯著表達(dá)。這表明兩菌共生時(shí)存在L.delbrueckii subsp.bulgaricus誘導(dǎo)S.thermophilus的調(diào)節(jié)變化。徐婷婷等[44]研究發(fā)現(xiàn)，混合發(fā)酵時(shí)兩菌部分TCS表達(dá)量發(fā)生明顯變化，其中TCShpk1/rr1對(duì)L.delbrueckii subsp.bulgaricus CH3的生長(zhǎng)、產(chǎn)乙醛、產(chǎn)黏能力具有顯著下調(diào)作用。但這些都是從TCS角度揭示了S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus兩菌的共生關(guān)系，尚未闡明TCS與兩菌的共生機(jī)制，因此還有待進(jìn)一步的研究探討。

2 兩菌共生對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）發(fā)酵牛奶時(shí)，會(huì)生成乳酸和其他揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)相互作用，產(chǎn)生具有獨(dú)特質(zhì)地和口感的酸奶[45]。目前用于制作酸奶的傳統(tǒng)發(fā)酵劑是S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus，發(fā)酵劑之間的關(guān)系對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)產(chǎn)生較大影響。相比于單一發(fā)酵，兩菌混合發(fā)酵具有產(chǎn)酸快、產(chǎn)黏好、風(fēng)味濃郁等優(yōu)良特點(diǎn)。因此探究S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus共生過程中的產(chǎn)酸、產(chǎn)黏和風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)提高酸奶品質(zhì)具有重要意義。

2.1 產(chǎn)酸

S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus共生時(shí)產(chǎn)生多種酸，對(duì)酸奶品質(zhì)影響較大的主要為乳酸。其主要產(chǎn)酸機(jī)制為兩菌將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，葡萄糖經(jīng)EMP途徑和同型乳酸發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乳酸（占轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的85%～98%），使牛乳得到有效酸化[46]。乳酸菌的產(chǎn)酸分兩個(gè)階段，即發(fā)酵產(chǎn)酸階段和后酸化階段。發(fā)酵產(chǎn)酸是指酸奶未包裝前發(fā)酵過程中LAB的產(chǎn)酸。在這一時(shí)期內(nèi)，S.thermophilus優(yōu)先生長(zhǎng)，隨pH值降低生長(zhǎng)速度逐漸變慢，而L.delbrueckii subsp.bulgaricus生長(zhǎng)速度逐漸加快。第二階段后酸化階段指包裝后貯存和運(yùn)輸過程中酸奶產(chǎn)酸的階段。但由于該過程溫度較低，故酸度增長(zhǎng)趨于緩和。綜上所述，兩菌在牛乳中共同培養(yǎng)時(shí)，S.thermophilus在發(fā)酵前期產(chǎn)酸過程中發(fā)揮重要作用，使pH值降低，有效促進(jìn)L.delbrueckii subsp.bulgaricus 生長(zhǎng)[47]。而 L.delbrueckii subsp.bulgaricus產(chǎn)生的多肽和游離氨基酸能夠促進(jìn)S.thermophilus的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酸[48]。從產(chǎn)酸特性來看，兩菌之間的共生關(guān)系促進(jìn)了彼此的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酸，故兩菌混合發(fā)酵的產(chǎn)酸能力較單一菌種發(fā)酵強(qiáng)，所以會(huì)對(duì)酸奶的品質(zhì)和風(fēng)味產(chǎn)生一定影響[23]。

2.2 產(chǎn)黏

酸奶黏度的增加有兩個(gè)原因：一是兩菌混合發(fā)酵產(chǎn)酸使pH值降低，有利于酪蛋白的沉淀；二是S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus產(chǎn)生的胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）多聚物可作為黏膠劑、增稠劑[49-50]。EPS是微生物在生長(zhǎng)代謝過程中分泌到胞外的一類糖類化合物，具有改善腸道微生態(tài)的益生特性。在發(fā)酵過程中，乳酸菌會(huì)產(chǎn)生EPS，它能將LAB與酪蛋白連接在一起，使酸奶具有細(xì)膩爽滑的口感[51]。由于S.thermophilus分泌的EPS較多，對(duì)酸奶質(zhì)構(gòu)特性影響較大，故酸奶黏度隨發(fā)酵劑中S.thermophilus所占比例的增加呈上升趨勢(shì)[46，52]。雖然L.delbrueckii subsp.bulgaricus分泌的EPS少，酸奶黏度低且有顆粒感，但兩菌共生時(shí)L.delbrueckii subsp.bulgaricus產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能夠促進(jìn)S.thermophilus的生長(zhǎng)和EPS的分泌，從而使得酸奶凝乳狀態(tài)均勻[29，53]。

2.3 產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)

S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus在發(fā)酵過程中通過相互作用產(chǎn)生的乳酸和多種揮發(fā)性芳香類化合物賦予了酸奶特有的風(fēng)味和口感。目前已發(fā)現(xiàn)一百多種對(duì)酸奶風(fēng)味產(chǎn)生重要影響的物質(zhì)，其中起關(guān)鍵作用的有乙醛、雙乙酰和乙偶姻等[54]，它們通過多種途徑（圖2）生成，使酸奶的口感更加獨(dú)特。乙醛產(chǎn)生的一個(gè)重要代謝途徑是具有g(shù)lyA基因編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠催化蘇氨酸生成乙醛[55]。白娜等[56]研究推測(cè)，基因 pdc（編碼丙酮酸脫羧酶）、ald（編碼乙醛脫氫酶）和pdh（編碼丙酮酸脫氫酶）具有促進(jìn)乙醛合成的作用，而基因ldh（編碼乳酸脫氫酶）可能不利于乙醛含量的積累。雙乙酰的生成主要來源于檸檬酸代謝途徑和糖酵解代謝途經(jīng)。其中α-乙酰乳酸是雙乙酰的前驅(qū)體，可以通過氧化脫羧反應(yīng)生成雙乙酰[57]。通過過量表達(dá)α-乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸合成酶等基因，能夠增加雙乙酰的產(chǎn)量[57]。但雙乙酰具有不穩(wěn)定性，在雙乙酰還原酶的作用下能夠生成乙偶姻，影響酸奶的發(fā)酵風(fēng)味。

圖2 影響酸奶發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生途徑Fig.2 The production route of flavoring substances affecting yogurt

3 總結(jié)

發(fā)酵劑是成功發(fā)酵的關(guān)鍵，其特性直接影響產(chǎn)品品質(zhì)。酸奶常用的發(fā)酵劑為S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus，兩菌在牛乳環(huán)境中形成的共生關(guān)系是非常復(fù)雜的作用體系，一方面體現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)供給的共生關(guān)系，如丙酮酸、甲酸、葉酸、脲酶、嘌呤等都發(fā)揮了積極的促進(jìn)作用；另一方面體現(xiàn)在抵抗環(huán)境脅迫的共生關(guān)系，如NADH氧化酶和谷胱甘肽能夠分別抵抗氧脅迫和酸脅迫。同時(shí)，乳酸、胞外多糖、乙醛、乙偶姻、雙乙酰等促進(jìn)了酸奶發(fā)酵風(fēng)味的形成。以上這些都是兩菌共生對(duì)酸奶發(fā)酵的積極作用，但有研究表明兩菌共生過程中還存在不同的拮抗作用[30-31]，且兩菌共生的作用機(jī)制還未完全闡明，特別是在抵抗脅迫方面。因此，繼續(xù)深入研究酸奶發(fā)酵劑S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus的共生關(guān)系，將有助于提高酸奶品質(zhì)、滿足消費(fèi)者需求。同時(shí)大量研究表明，酸奶在改善人體腸道環(huán)境方面有著積極作用，未來在飲食治療腸道菌群失衡和生物工程菌綜合利用方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。