復(fù)方芪參提取物對(duì)糖尿病足潰瘍模型大鼠創(chuàng)面愈合及HIF-1α/VEGF/VEGFR2通路的影響

于澤洋，李天博，王江寧

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院矯形外科，北京 100038)

糖尿病(DM)是全球普遍存在的健康問(wèn)題。2000年全球約有1.71億人患有DM，這一數(shù)字預(yù)計(jì)到2030年將增加近一倍[1]。據(jù)估計(jì)，DM患者中有15%至25%在其一生中會(huì)患上足部潰瘍，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，可能危及生命，這也是大部分糖尿病患者住院的原因。糖尿病足潰瘍(DFU)構(gòu)成嚴(yán)重感染和截肢的重大風(fēng)險(xiǎn)，在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家都構(gòu)成主要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。與需要截肢的DFU相關(guān)的5年死亡率為39%至80%，其已經(jīng)非常接近最具侵略性的癌癥。因此，正在不斷研究促進(jìn)糖尿病足疾病治愈的新方法，以降低發(fā)病率和死亡率。局部新血管形成減少和外周血流減少是導(dǎo)致DFU傷口愈合延遲的關(guān)鍵因素。大量證據(jù)表明，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)的功能受損是與糖尿病相關(guān)的血管生成受損的主要機(jī)制[2]。HIF-1α是氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑，在正常的氧條件下，HIF-1α迅速羥基化和降解并翻譯，這是由HIF脯氨酰羥化酶(PHD)的氧依賴性酶家族介導(dǎo)的[3]。在缺氧的組織條件下，PHD減少了HIF-1α的羥基化作用，其結(jié)果是HIF-1α蛋白得以穩(wěn)定并啟動(dòng)了多個(gè)對(duì)血管生成至關(guān)重要的基因的表達(dá)，最顯著的是VEGF[4,5]。在糖尿病患者中，HIF-1α的功能活性降低。這種變化導(dǎo)致傷口無(wú)法響應(yīng)軟組織缺血而下調(diào)VEGF，從而導(dǎo)致血管生成和傷口愈合受損。復(fù)方芪參提取物是一種新型的口服活性藥物，在貧血中發(fā)揮作用的基本機(jī)制涉及其介導(dǎo)的HIF-1α的瞬時(shí)穩(wěn)定。此外，復(fù)方芪參提取物還具有益氣活血，化瘀止痛的功效。目前尚無(wú)報(bào)道復(fù)方芪參提取物在血管生成和糖尿病傷口愈合中的功能。因此，本研究擬探討復(fù)方芪參提取物對(duì)糖尿病足潰瘍模型大鼠創(chuàng)面愈合及HIF-1α/VEGF/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)通路的影響，為糖尿病足潰瘍的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)成年SD大鼠，雌雄各半，7～8周齡，體重200～250g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(冀)2020-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(冀)2020-0003，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：HBHG2020041603，大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度(22～26℃)、光照(12h:12h光照/黑暗循環(huán))、濕度60%～70%。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要藥物、試劑與儀器:復(fù)方芪參提取物(原料藥，純度98.5%，河南省新誼藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)CSA1019)；鹽酸二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格0.85g/片，批號(hào)20200109)；高糖高脂飼料(上海帆泊生物技術(shù)有限公司，批號(hào)K00019)；鏈脲佐菌素(STZ)(南京沃博生物科技有限公司，批號(hào)M5623)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)C0904L)；TRIzol試劑(美國(guó)Ambion公司，批號(hào)WE471-36)；PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，批號(hào)471UY)；SYBR Green I Master Mix熒光定量PCR試劑盒(北京生東科技有限公司，批號(hào)A25741)；RIPA裂解緩沖液(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)SA748536)；BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司，批號(hào)KK4156)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司，批號(hào)PPJC0517)；HIF-1α、VEGF、VEGFR2、GAPDH單克隆抗體、羊抗鼠二抗(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)C2168-50、C1782-50、C1779-100、C1319-100、PL10016)；ECL化學(xué)發(fā)光液(上海李記生物科技有限公司，批號(hào)AP34L029)；ImageJ軟件(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)；CX21BIM-SET5型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；StepOnePlus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；ChemiDoc XRS +型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.3造模、分組及給藥:71只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)選取12只大鼠作為對(duì)照組喂以普通飼料，其它59只大鼠喂以高糖高脂飼料，喂養(yǎng)4周后，對(duì)照組大鼠一次性腹腔注射0.1moL/L的檸檬酸鈉緩沖液，其它59只大鼠一次性腹腔注射STZ(60mg/kg，溶解在pH 4.5的0.1moL/L檸檬酸鈉緩沖液中)，并于72h后檢測(cè)血糖水平，空腹血糖水平≥16.7mmoL/L的大鼠為糖尿病模型大鼠[6]。59只大鼠成功造模48只，將48只糖尿病模型大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、二甲雙胍組(0.2g/kg)、復(fù)方芪參提取物低劑量組(4g/kg)、復(fù)方芪參提取物高劑量組(8g/kg)，每組12只。隨后將對(duì)照組、模型組、二甲雙胍組、復(fù)方芪參提取物低劑量組、復(fù)方芪參提取物高劑量組大鼠通過(guò)腹腔注射4%的水合氯醛麻醉，在無(wú)菌條件下使用5mm皮膚活檢打孔器在大鼠背側(cè)后足形成單個(gè)圓形全層皮膚潰瘍創(chuàng)面?zhèn)?，以建立糖尿病足潰瘍模型大鼠[7]。造模成功后第1天，二甲雙胍組大鼠灌胃0.2g/kg的二甲雙胍[8](將二甲雙胍在生理鹽水中溶解，配制成濃度0.02g/mL的溶液，灌胃體積10mL/kg)；復(fù)方芪參提取物低劑量組、復(fù)方芪參提取物高劑量組大鼠分別灌胃4g/kg、8g/kg的復(fù)方芪參提取物[8](將復(fù)方芪參提取物在生理鹽水中溶解，配制成濃度分別為0.4g/mL、0.8g/mL的溶液，灌胃體積10mL/kg)；對(duì)照組和模型組大鼠灌胃10mL/kg的生理鹽水；每天灌胃1次，連續(xù)給藥4周。

1.4大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合率的測(cè)定:分別于造模完成后和給藥結(jié)束后對(duì)創(chuàng)面照相，并通過(guò)ImageJ軟件測(cè)量創(chuàng)面面積，使用以下公式確定創(chuàng)面愈合情況：創(chuàng)面愈合率=(造模完成后創(chuàng)面面積-給藥周期結(jié)束后創(chuàng)面面積)/造模完成后創(chuàng)面面積×100%。

1.5糖尿病足大鼠和正常大鼠潰瘍創(chuàng)面組織病理觀察:腹腔注射4%的水合氯醛麻醉大鼠，分別獲取糖尿病足大鼠和正常大鼠潰瘍創(chuàng)面組織，常規(guī)HE染色，觀察大鼠潰瘍創(chuàng)面病理情況。

1.6糖尿病足大鼠和正常大鼠潰瘍創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平測(cè)定:取1.5中剩余的創(chuàng)面組織，使用TRIzol試劑提取組織中的總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄程序合成cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和SYBR Green I Master Mix熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，引物由金唯智生物科技(北京)有限公司合成。引物序列如下：HIF-1α正向5'-CTGTGCATGCACAGAAGTGTGTGCTA-3'，HIF-1α反向5'-TGTGACTGACTTGCGCTCGACTGTAG-3'；VEGF正向5'-TGTGACTGACTTGCTGTGTGTCGTA-3'，VEGF反向5'-GTACTACCTGGCTCTGTGTGCGCGT-3'；VEGFR2正向：5'-TGTACGTGAAGCATGCCGTGACCGTA-3'，VEGFR2反向：5'-GGTGACGTGATTTTCTGTTCGTTACAC-3'；β-actin正向：5'-TTGTGACGTGACGCGAGATGTGCGT-3'，β-actin反向：5'-CTGTGCGTGACGTACAGGTTGTGCG-3'。PCR擴(kuò)增條件如下：95℃持續(xù)1min，然后進(jìn)行40個(gè)75℃持續(xù)10s和60℃持續(xù)20s的循環(huán)。并使用2-ΔΔCt方法分析HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。

1.7糖尿病足大鼠和正常大鼠潰瘍創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平測(cè)定:取1.5中剩余的創(chuàng)面組織，在RIPA裂解緩沖液中裂解，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒確定蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)(30μg)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后在TBST緩沖液中用5%脫脂奶粉封閉膜2h，并與HIF-1α(1∶1000)、VEGF(1∶1000)、VEGFR2(1∶1500)、GAPDH(1∶1500)一抗孵育過(guò)夜，之后與羊抗鼠二抗(1:5000)孵育1h，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，收集蛋白帶圖像，并用凝膠成像分析系統(tǒng)分析相對(duì)光密度。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合率比較:與對(duì)照組比較，模型組大鼠創(chuàng)面愈合率降低(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組、復(fù)方芪參提取物低、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率升高(P<0.05)，且復(fù)方芪參提取物高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率高于復(fù)方芪參提取物低劑量組(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，復(fù)方芪參提取物低劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率降低(P<0.05)，復(fù)方芪參提取物高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合率比較

2.2各組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織病理學(xué)比較:對(duì)照組創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)正常，可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管；模型組創(chuàng)面組織大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管數(shù)目明顯減少；二甲雙胍和復(fù)方芪參提取物干預(yù)后，創(chuàng)面組織成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管增加，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織病理圖(HE染色，×200)注:A：對(duì)照組，B：模型組，C：二甲雙胍組，D：復(fù)方芪參提取物低劑量組，E：復(fù)方芪參提取物高劑量組

2.3各組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平比較:與對(duì)照組比較，模型組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組相比，二甲雙胍組、復(fù)方芪參提取物低、高劑量組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平升高(P<0.05)，且復(fù)方芪參提取物高劑量組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平高于復(fù)方芪參提取物低劑量組(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，復(fù)方芪參提取物低劑量組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平降低(P<0.05)，復(fù)方芪參提取物高劑量組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α VEGF VEGFR2 mRNA水平比較

2.4各組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平比較:與對(duì)照組比較，模型組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組相比，二甲雙胍組、復(fù)方芪參提取物低、高劑量組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平升高(P<0.05)，且復(fù)方芪參提取物高劑量組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平高于復(fù)方芪參提取物低劑量組(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，復(fù)方芪參提取物低劑量組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平降低(P<0.05)，復(fù)方芪參提取物高劑量組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

表3 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α VEGF VEGFR2蛋白水平比較

圖2 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平表達(dá)注A：對(duì)照組，B：模型組，C：二甲雙胍組，D：復(fù)方芪參提取物低劑量組，E：復(fù)方芪參提取物高劑量組

3 討 論

糖尿病足潰瘍是全世界重要的衛(wèi)生保健負(fù)擔(dān)。據(jù)估計(jì)，每年約有912-2610萬(wàn)人患此病。糖尿病足潰瘍的中位愈合時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12周，與截肢風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)。局部新生血管形成減少和外周血流減少是導(dǎo)致糖尿病患者傷口愈合延遲的關(guān)鍵因素。由于氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移不足，廣泛的微血管病會(huì)延遲細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原蛋白合成、血管生成、肉芽組織形成和再上皮形成。有研究證實(shí)，復(fù)方芪參提取物可抑制肝癌進(jìn)展[9]。復(fù)方芪參提取物主要成分為黃酮類、異黃酮類、生物堿、三萜類植物，這些成分對(duì)糖尿病傷口愈合的促進(jìn)作用有廣泛的研究[10]。復(fù)方芪參提取物作為促進(jìn)糖尿病傷口愈合的潛在療法具有多種優(yōu)勢(shì)，除其促進(jìn)血管生成作用外，據(jù)報(bào)道復(fù)方芪參提取物還可以改善表皮干細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)能力，加速角質(zhì)形成細(xì)胞的再上皮形成，從而促進(jìn)皮膚傷口的愈合[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，二甲雙胍組、復(fù)方芪參提取物低、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率升高，創(chuàng)面組織成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管增加，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。這說(shuō)明，復(fù)方芪參提取物可促進(jìn)糖尿病足潰瘍模型大鼠創(chuàng)面愈合，減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，與上述研究結(jié)論相符。

糖尿病傷口的延遲愈合特性是由于缺氧導(dǎo)致新生血管形成受損的結(jié)果。研究報(bào)道了新生血管形成受損的潛在機(jī)制是缺氧誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)降低，這是由于HIF-1α的反式激活所致[12]。這種變化是由于高糖暴露降低了HIF-1α結(jié)合其共激活因子p300，主要原因是活性氧簇(ROS)誘導(dǎo)的乙二醛酶1底物(甲基乙二醛)對(duì)p300的修飾而引起的。證明高血糖通過(guò)干擾HIF-1α的穩(wěn)定性，從而抑制HIF-1α和其下游基因VEGF的表達(dá)。因此，HIF-1α/VEGF信號(hào)功能受損被認(rèn)為是糖尿病足患者血管生成受損和傷口愈合延遲的主要原因[13]。研究證明，HIF-1α的穩(wěn)定對(duì)于逆轉(zhuǎn)這種病理過(guò)程至關(guān)重要[14]。高壓氧(HBO)療法激活了HIF-1α，其目標(biāo)基因VEGF和VEGFR2以及局部HIF-1α在糖尿病傷口中的轉(zhuǎn)移與HBO有協(xié)同作用。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，二甲基草酰甘氨酸可上調(diào)HIF-1α，改善血管生成并顯著加速糖尿病創(chuàng)面愈合過(guò)程[15]。本研究結(jié)果顯示，使用二甲雙胍和復(fù)方芪參提取物治療后，二甲雙胍組、復(fù)方芪參提取物低、高劑量組大鼠潰瘍創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白水平高于模型組。這說(shuō)明，復(fù)方芪參提取物促進(jìn)糖尿病足大鼠潰瘍創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2通路，從而促進(jìn)糖尿病足潰瘍模型大鼠創(chuàng)面愈合，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，復(fù)方芪參提取物可促進(jìn)糖尿病足潰瘍模型大鼠創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能與復(fù)方芪參提取物促進(jìn)大鼠糖尿病足潰瘍創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2通路有關(guān)。