電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清雌二醇的性能驗(yàn)證

張偉娟,江雅平,陳永傳,任颯爽

1.北京善方醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100027;2.北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034

雌二醇(E2)是一種甾體雌激素,主要由卵巢產(chǎn)生，睪丸和腎上腺皮質(zhì)也可產(chǎn)生少量E2。在妊娠期，雌激素主要產(chǎn)生部位為胎盤(pán)，胎盤(pán)生成的E2可在胎兒體內(nèi)轉(zhuǎn)化為雌三醇。E2可參與女性的整個(gè)生殖過(guò)程，其中17β-雌二醇(17β-E2)的生物活性最強(qiáng)。E2在月經(jīng)周期中可對(duì)下丘腦和垂體起到雙向調(diào)節(jié)作用，不僅影響卵泡的募集和優(yōu)勢(shì)卵泡的排出，還影響卵母細(xì)胞著床。E2還可作為一種治療劑，對(duì)女性卵巢17β-E2分泌不足進(jìn)行補(bǔ)充。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)E2在下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂性疾病、卵巢或睪丸腫瘤、腎上腺皮質(zhì)增生癥、不孕不育和輔助生殖中均有著非常重要的臨床意義[1-2]。本研究對(duì)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECLIA)檢測(cè)E2的正確度、精密度、分析測(cè)量范圍、臨床可報(bào)告范圍、功能靈敏度、生物參考區(qū)間進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以明確其是否滿足實(shí)驗(yàn)室用途和臨床需求。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選取北京善方醫(yī)院2019年9月20日—12月20日采集的健康男性、卵泡期女性、排卵期女性、黃體期女性、絕經(jīng)后女性血液標(biāo)本各60份作為研究對(duì)象。

1.2儀器與試劑 羅氏Cobas 6000 e601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、配套的E2檢測(cè)試劑(批號(hào)39402903)、配套校準(zhǔn)品(批號(hào)36605901)、配套質(zhì)控品(批號(hào)33009700、33009900)，以及2019年國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心發(fā)放的第二次室間質(zhì)量評(píng)價(jià)質(zhì)控品(批號(hào)201921～201925)。

1.3方法

1.3.1正確度驗(yàn)證 參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI) EP15-A2文件[3]、《臨床實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)》[4]及文獻(xiàn)[5]，采用2019年國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心發(fā)放的第二次室間質(zhì)量評(píng)價(jià)質(zhì)控品(批號(hào)201921～201925)進(jìn)行正確度驗(yàn)證，每個(gè)批號(hào)檢測(cè)3次，計(jì)算平均值，將實(shí)測(cè)值與靶值進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)偏移，相對(duì)偏移≤±25%為可接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2精密度驗(yàn)證 參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)EP5-A2文件[6]，采用兩個(gè)水平的質(zhì)控品進(jìn)行精密度驗(yàn)證。每天對(duì)兩個(gè)水平質(zhì)控品檢測(cè)兩批，每批重復(fù)檢測(cè)兩次，每批檢測(cè)間隔時(shí)間>2 h，共檢測(cè)20 d，得到80個(gè)可接受數(shù)據(jù)。計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)、均值、標(biāo)準(zhǔn)差，當(dāng)符合國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),即批內(nèi)CV<1/4允許總誤差(6.25%)，批間CV<1/3允許總誤差(8.33%)，以及基于生物學(xué)變異設(shè)定的質(zhì)量規(guī)范(批內(nèi)及批間CV<11.4%)時(shí)，通過(guò)驗(yàn)證。同時(shí)比較本研究得出的批內(nèi)及批間CV與廠家聲明的批內(nèi)和批間CV間的差異。

1.3.3分析測(cè)量范圍驗(yàn)證 參考NCCLS EP6-A文件[7]和文獻(xiàn)[8]，選取新鮮高水平標(biāo)本(H)和低水平標(biāo)本(L)各1份，按如下比例配制成7份不同水平的待測(cè)標(biāo)本：6H+0L、5H+1L、4H+2L、3H+3L、2H+4L、1H+5L、0H+6L。在2 h內(nèi)對(duì)每份標(biāo)本檢測(cè)4次，求其均值，以實(shí)測(cè)值作為縱坐標(biāo)，預(yù)期值作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，排除非線性數(shù)據(jù)點(diǎn)，得出最佳擬合方程。

1.3.4臨床可報(bào)告范圍驗(yàn)證 選擇E2水平在分析測(cè)量范圍內(nèi)的3份高水平標(biāo)本S1、S2、S3，所對(duì)應(yīng)的E2水平分別為10 371.0、9 220.0、5 945.0 pmol/L，用E2原裝稀釋液分別將上述標(biāo)本稀釋2、5、10倍，并進(jìn)行檢測(cè)，將實(shí)測(cè)值和預(yù)期值進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)偏差，以相對(duì)偏差<1/3美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正法案(CLIA)′88允許總誤差為可接受標(biāo)準(zhǔn)。選取E2水平在分析測(cè)量范圍外的標(biāo)本S4(E2水平為11 568.0 pmol/L)，用E2原裝稀釋液進(jìn)行2、5、10倍稀釋?zhuān)⑦M(jìn)行檢測(cè)，將實(shí)測(cè)值與預(yù)期值進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)偏差，以相對(duì)偏差<1/3 CLIA′88允許總誤差為可接受標(biāo)準(zhǔn)。臨床可報(bào)告范圍上限=可接受的最大稀釋倍數(shù)×分析測(cè)量范圍上限。

1.3.5功能靈敏度驗(yàn)證 依據(jù)NCCLS EP17-A文件[9]，選擇水平略高于檢測(cè)下限的標(biāo)本5份(A1、A2、A3、A3、A5)，每份標(biāo)本每天檢測(cè)1次，連續(xù)檢測(cè)10 d，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和CV。選取CV最接近20%的標(biāo)本的平均水平作為功能靈敏度。

1.3.6生物參考區(qū)間驗(yàn)證 參考CLSI C28-A3c文件[10]和WS/T 402-2012[11]，將健康男性、卵泡期女性、排卵期女性、黃體期女性、絕經(jīng)后女性的血液標(biāo)本各60份用于生物參考區(qū)間驗(yàn)證，檢測(cè)其血清E2水平，并與廠家給定的參考區(qū)間比較，以≤2例的檢測(cè)結(jié)果在給定的參考區(qū)間外作為可接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用簡(jiǎn)單線性回歸進(jìn)行回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1正確度驗(yàn)證 5個(gè)批號(hào)質(zhì)控品實(shí)測(cè)值與靶值的相對(duì)偏移均在可接受范圍內(nèi)(≤±25%)，驗(yàn)證通過(guò)。見(jiàn)表1。

表1 正確度驗(yàn)證結(jié)果

2.2精密度驗(yàn)證 低水平質(zhì)控品批內(nèi)和批間CV分別為1.40%和1.80%，高水平質(zhì)控品批內(nèi)和批間CV分別為0.80%和0.86%，符合國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[批內(nèi)CV<1/4允許總誤差(6.25%)，批間CV<1/3允許總誤差(8.33%)]及基于生物學(xué)變異設(shè)定的質(zhì)量規(guī)范(批內(nèi)及批間CV<11.4%)。將本研究得出的批內(nèi)和批間CV結(jié)果與廠家聲明的批內(nèi)和批間CV(低水平質(zhì)控品批內(nèi)和批間CV分別為2.40%和3.80%，高水平質(zhì)控品批內(nèi)和批間CV分別為1.20%和2.10%)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，驗(yàn)證通過(guò)。見(jiàn)表2。

表2 精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.3分析測(cè)量范圍驗(yàn)證 實(shí)測(cè)值與預(yù)期值的線性回歸方程為Y=1.018 2X+19.5，R2=0.999 8，E2檢測(cè)結(jié)果在17.8～11 992.0 pmol/L范圍內(nèi)呈線性，證明廠家提供的分析測(cè)量范圍(18.4～11 010.0 pmol/L)符合要求。見(jiàn)圖1。

圖1 E2預(yù)期值與實(shí)測(cè)值的線性回歸圖

2.4臨床可報(bào)告范圍驗(yàn)證 E2在分析測(cè)量范圍內(nèi)稀釋2倍和5倍時(shí)相對(duì)偏差均<1/3 CLIA′88允許總誤差，可接受；而稀釋10倍后相對(duì)偏差>1/3 CLIA′88允許總誤差，不可接受，因此高水平標(biāo)本稀釋后的檢測(cè)值必須>881.0 pmol/L(廠家聲明的稀釋后最低檢測(cè)值)。E2在分析測(cè)量范圍外時(shí)，當(dāng)稀釋倍數(shù)為2、5、10倍時(shí)相對(duì)偏差均<1/3 CLIA′88允許總誤差，因此可接受最大稀釋倍數(shù)為10倍，與廠家聲明的最大稀釋倍數(shù)一致，臨床可報(bào)告范圍上限=可接受的最大稀釋倍數(shù)×分析測(cè)量范圍上限=10×11 010.0 pmol/L=110 100.0 pmol/L。見(jiàn)表3。

表3 臨床可報(bào)告范圍驗(yàn)證結(jié)果

2.5功能靈敏度驗(yàn)證 5份標(biāo)本的CV如表4所示，CV最接近20%的標(biāo)本水平為43.5 pmol/L，與廠家聲明的功能靈敏度一致。

表4 功能靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

2.6生物參考區(qū)間驗(yàn)證 卵泡期女性有2例檢測(cè)結(jié)果超出參考區(qū)間，排卵期女性有2例檢測(cè)結(jié)果超出參考區(qū)間，黃體期女性有1例檢測(cè)結(jié)果超出參考區(qū)間，健康男性、絕經(jīng)后女性檢測(cè)結(jié)果均在參考區(qū)間范圍內(nèi)，結(jié)果均符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表5。

表5 生物參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

E2在人體血液中水平較低，但卻起著非常重要的作用，尤其是在內(nèi)分泌調(diào)節(jié)方面，許多內(nèi)分泌相關(guān)疾病均與其有關(guān)，因此，E2的準(zhǔn)確檢測(cè)就顯得尤為重要[12]。根據(jù)《臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)法規(guī)修正案》和ISO15189要求，必須在儀器運(yùn)用于臨床實(shí)驗(yàn)室前對(duì)儀器進(jìn)行分析性能驗(yàn)證[13]。

本研究評(píng)價(jià)的E2檢測(cè)系統(tǒng)正確度驗(yàn)證采用的是2019年國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心發(fā)放的第二次室間質(zhì)量評(píng)價(jià)質(zhì)控品，其靶值是根據(jù)728個(gè)實(shí)驗(yàn)室的E2平均值計(jì)算而來(lái)，本研究5個(gè)批號(hào)的質(zhì)控品實(shí)測(cè)值與靶值的相對(duì)偏移均在可接受范圍內(nèi)(≤±25%)，正確度驗(yàn)證通過(guò)。檢測(cè)系統(tǒng)的精密度用于反映重復(fù)檢測(cè)值間的一致性，本研究參考NCCLS EP5-A2文件，采用兩個(gè)水平的質(zhì)控品進(jìn)行精密度驗(yàn)證，結(jié)果符合國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及基于生物學(xué)變異設(shè)定的質(zhì)量規(guī)范。分析測(cè)量范圍驗(yàn)證是從統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床要求兩個(gè)方面判定線性，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到最佳擬合方程[14]。本研究中，在17.8～11 992.0 pmol/L范圍內(nèi)E2檢測(cè)結(jié)果呈線性，證明廠家提供的分析測(cè)量范圍(18.4～11 010.0 pmol/L)符合要求。臨床可報(bào)告范圍上限為110 100.0 pmol/L，最大稀釋倍數(shù)為10倍，當(dāng)檢測(cè)標(biāo)本的水平超過(guò)臨床可報(bào)告范圍上限時(shí)需稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)，最大稀釋倍數(shù)不能超過(guò)10倍，否則結(jié)果不可靠；高水平標(biāo)本稀釋后的檢測(cè)值必須>881.0 pmol/L(廠家聲明的稀釋后最低檢測(cè)值)，如果稀釋后的檢測(cè)值<881.0 pmol/L應(yīng)把稀釋倍數(shù)縮小，以保證稀釋后的檢測(cè)準(zhǔn)確性。功能靈敏度是在低水平標(biāo)本的基礎(chǔ)上，用于區(qū)分“從有到無(wú)”的分析能力，本研究選擇水平略高于E2檢測(cè)下限的5份標(biāo)本進(jìn)行功能靈敏度驗(yàn)證，結(jié)果顯示，CV最接近20%的標(biāo)本水平為43.5 pmol/L，符合廠家聲明的功能靈敏度標(biāo)準(zhǔn)[15]。生物參考區(qū)間是指項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果在健康人群中的分布范圍，是標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果正常與否的參考依據(jù)。本研究隨機(jī)選取健康男性、卵泡期女性、排卵期女性、黃體期女性、絕經(jīng)后女性的血液標(biāo)本各60份進(jìn)行生物參考區(qū)間驗(yàn)證，與廠家給定的參考值比較，結(jié)果均通過(guò)驗(yàn)證，證實(shí)該生物參考區(qū)間可應(yīng)用于臨床。

綜上所述，ECLIA檢測(cè)血清E2的各項(xiàng)性能基本能滿足臨床實(shí)驗(yàn)室要求，且其簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定性高、便于自動(dòng)化，可為臨床診療提供可靠的E2檢測(cè)結(jié)果。