去勢(shì)抵抗性前列腺癌PDX 模型研究進(jìn)展

稅雪許榮趙菊梅?師長(zhǎng)宏?

(1. 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院,陜西延安 716000; 2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,西安 710032)

前列腺癌(prostate cancer,Pca)的發(fā)病率與死亡率呈現(xiàn)逐年攀升趨勢(shì),已成為我國(guó)泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅老年男性健康[1]。通過藥物或手術(shù)等手段進(jìn)行雄激素剝奪(androgen deprivation therapy,ADT)是目前治療Pca 的主要方法,但隨著醫(yī)治時(shí)間延長(zhǎng),大多數(shù)患者都將會(huì)復(fù)發(fā),發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC),而CRPC 患者預(yù)后較差,平均中位生存期不滿2 年[2]。已證實(shí),大多數(shù)CRPC仍依賴于AR 信號(hào)通路[3],因此,一些新型的雄激素合成抑制劑和雄激素受體(androgen receptor,AR)通路抑制劑如:阿比特龍和恩雜魯胺等在臨床廣泛使用[4-5]。但患者最終也會(huì)對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性。因此,迫切需要開發(fā)有效的模擬臨床特征的動(dòng)物模型,開展CRPC 的發(fā)病機(jī)制和新型藥物的研究。

目前常應(yīng)用于CRPC 研究的動(dòng)物模型主要包括細(xì)胞系異種移植模型(cell line-derived xenografts,CDX),遺傳工程小鼠模型(genetically-engineered mouse models,GEMM) 和人源化異種移植模型(patient-derived xenograft,PDX)。常用的 CRPC 細(xì)胞系22RV1,C4-2 和DU145 等經(jīng)過長(zhǎng)期體外培養(yǎng),其基因譜表達(dá)水平和異質(zhì)性較原發(fā)瘤會(huì)發(fā)生明顯的變化[6];GEMM 模型也由于成本較高且與臨床差異較大等限制了其應(yīng)用[7]。PDX 模型的出現(xiàn),很好的彌補(bǔ)了上述模型的不足。該類模型是通過將患者新鮮的腫瘤組織經(jīng)皮下、腎包膜等不同方法移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立。因其較好的保留了原發(fā)瘤的生物學(xué)特征和異質(zhì)性,在臨床藥物篩選方面體現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[8]。本文重點(diǎn)介紹利用臨床腫瘤標(biāo)本建立的不同類型的CRPC PDX 模型,闡述該類模型的主要表型特征和病理生理學(xué)特征,以期為CRPC 的發(fā)生機(jī)制和靶向藥物篩選研究提供良好的實(shí)驗(yàn)工具。

1 CRPC PDX 模型的表型特征

1.1 PDX 模型的激素非依賴表型特征

前列腺癌初期呈激素依賴性生長(zhǎng),在經(jīng)ADT 治療以后,體內(nèi)雄激素水平下降使腫瘤體積逐漸縮小,但CRPC 的激素非依賴特性使腫瘤能在雄激素剝奪的情況下復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9]。近年來已有多個(gè)研究小組直接將復(fù)發(fā)后患者的腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠中構(gòu)建了多例 CRPC 的 PDX 模型[10-12]。然而,也有研究發(fā)現(xiàn)通過這種途徑構(gòu)建的PDX 模型并非總表現(xiàn)為激素非依賴特性。Corey等[13]在LuCaP 35 模型中分析發(fā)現(xiàn),CRPC 腫瘤組織中的激素非依賴性細(xì)胞在雄激素存在的條件下,又恢復(fù)為激素依賴性表型。因此,這種方法構(gòu)建的模型結(jié)果不穩(wěn)定,人們開始探索其它方法。有研究小組嘗試通過對(duì)激素依賴性的腺癌PDX 模型進(jìn)行ADT 干預(yù)誘導(dǎo)CRPC 的發(fā)生,該模型可以更好的展現(xiàn)臨床CRPC 患者向激素非依賴特性轉(zhuǎn)變的動(dòng)態(tài)發(fā)展過程。LAPC-9[14]、PC-310[15]和 KuCaP-2[16]就是激素依賴性的 PDX 模型通過去勢(shì)誘導(dǎo)獲得的CRPC PDX 模型。該類模型保持了與原發(fā)腫瘤相似的遺傳特征,其生長(zhǎng)不依賴于雄激素,表達(dá)AR 和前列腺癌特異抗原(prostate specific antigen,PSA),很好地模擬了臨床CRPC 的進(jìn)展過程,即激素依賴向非依賴性的轉(zhuǎn)變[15-16]。更為重要的是,通過比對(duì)前列腺癌PDX 模型CRPC 發(fā)生前后的基因表達(dá)水平變化,可以深入研究CRPC 形成的分子機(jī)制。比如,有研究者通過該動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化模型,發(fā)現(xiàn)前列腺素E 受體蛋白4(EP4)水平在CRPC 后顯著升高,且與PSA水平呈正相關(guān),這提示EP4 可能是治療CRPC 的潛在靶點(diǎn)[16]。綜上所述,使用去勢(shì)誘導(dǎo)的CRPC PDX研究前列腺癌由激素依賴表型向激素非依賴性表型的轉(zhuǎn)化過程,將有助于探索CRPC 的發(fā)生發(fā)展,從而為臨床患者的治療提供新策略。

1.2 PDX 模型的雄激素受體相關(guān)表型特征

阻斷雄激素-雄激素受體信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以抑制前列腺癌PDX 模型腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。但外源誘導(dǎo)使AR 發(fā)生基因突變與變異,或表達(dá)上調(diào)時(shí),該信號(hào)通路可再次被激活從而發(fā)揮促瘤作用[17]。有研究者比對(duì)PDX 模型在去勢(shì)和給予外源性雄激素的不同條件下腫瘤的生長(zhǎng)情況,發(fā)現(xiàn)AR 突變和剪接變異的CRPC PDX 模型在補(bǔ)充外源性雄激素的情況下生長(zhǎng)速度增快,而AR 缺失的模型生長(zhǎng)速度沒有變化[10],這提示CRPC PDX 模型的發(fā)展與AR 有關(guān)。因此,越來越多的研究者在建立CRPC PDX 模型的同時(shí),將模型中AR 的表達(dá)作為一個(gè)重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。利用PDX 模型研究發(fā)現(xiàn),一方面AR 基因變異可能是去勢(shì)抵抗發(fā)生的潛在機(jī)制[11]。例如,雄激素受體剪接變體7(AR splice variant 7,AR-V7)作為CRPC 中檢出頻率最高的剪切變異體之一,可以促進(jìn)LuCaP 96CR 模型腫瘤的發(fā)展[18];另一方面,AR 基因變異與新型內(nèi)分泌治療藥物的耐藥性產(chǎn)生也有關(guān)[19-21]。Lawrence 等[10]在 CRPC PDX 模型中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)缺失的雄激素受體剪接變異體AR-s567es,并證實(shí)AR 缺失和AR 突變可能是原發(fā)腫瘤患者對(duì)阿比特龍和恩雜魯胺耐藥的重要分子機(jī)制。也有人使用LuCaP 35CR 模型發(fā)現(xiàn)ARV7 的變異與CRPC 耐藥性相聯(lián)系,進(jìn)而揭示AR-V7可作為指導(dǎo)CRPC 患者藥物選擇的分子標(biāo)志物[12],同樣的結(jié)果也在CWR22 模型中得到印證[22]。

1.3 PDX 模型的神經(jīng)內(nèi)分泌(neuroendocrine,NE)表型特性

神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌(neuroendocrine prostatecancer,NEPC)是一種 CRPC 亞型,惡性度極高,不表達(dá) PSA 和 AR,而突觸素(SYP)、嗜鉻粒蛋白 A(CgA)、CD56 和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)等神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物為陽(yáng)性。研究表明,NEPC 多發(fā)生于AR 抑制劑治療之后,且與臨床不良預(yù)后明確相關(guān)[23]。目前對(duì)于NEPC 的起源尚未形成共識(shí),Lin等[24]對(duì)前列腺腺癌 PDX 模型 LTL331 和 NEPC PDX 模型LTL331R 進(jìn)行了比對(duì)研究,相應(yīng)的DNA和RNA 測(cè)序結(jié)果支持NEPC 可以通過適應(yīng)性反應(yīng)直接從腺癌轉(zhuǎn)分化而來的假說,并且在這過程中可能產(chǎn)生了一組參與神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)分化(neuroendocrine differentiation,NED)的基因。該結(jié)果引起了眾多學(xué)者的關(guān)注,研究者陸續(xù)發(fā)起了多個(gè)NED 分子機(jī)制的研究?；谙嚓P(guān)CRPC PDX 模型和NEPC PDX 模型的實(shí)驗(yàn)證實(shí),異染色質(zhì)蛋白1α(HP1α)[25]、SRRM4[26]及 PEG10[27]的異常表達(dá)可能是介導(dǎo)NEPC 發(fā)生的新機(jī)制。此外,也有一部分人支持另一種假說,即NEPC 來源于前列腺腺體正常的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞癌變及前列腺腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化。van Haaften-Day 等[28]對(duì)其所建立的 NEPC 模型UCRU-PR-2 的綜合分析結(jié)果,支持該假說。

截至目前,NEPC 的起源仍在探索中,研究的熱點(diǎn)主要集中于激素依賴性前列腺癌(hormone-na?ve prostate cancer,HNPC)/CRPC 模型向 NEPC 模型動(dòng)態(tài)演化過程。有人直接利用NEPC 患者腫瘤組織建立了靜態(tài)NEPC PDX 模型。這類模型的制備主要是通過將患者新鮮腫瘤組織剪碎后植入6 ～8 周免疫缺陷的雄性小鼠體內(nèi),待瘤體長(zhǎng)至適當(dāng)體積時(shí)行去勢(shì)手術(shù),去勢(shì)后小鼠瘤體繼續(xù)生長(zhǎng)并能穩(wěn)定傳代視為建模成功。如LuCaP 49 模型[29]。這類靜態(tài)模型雖然較好地展現(xiàn)出與原發(fā)瘤相似的病理學(xué)結(jié)構(gòu)和遺傳特征,但對(duì)于模擬前列腺癌臨床動(dòng)態(tài)進(jìn)展過程具有一定的局限性。在將去勢(shì)后腫瘤再?gòu)?fù)發(fā)的激素依賴性前列腺癌PDX 模型誘導(dǎo)為CRPC PDX模型的基礎(chǔ)上,取該模型的小鼠瘤體接種至已提前去勢(shì)的雄性小鼠皮下并給予藥物等處理因素進(jìn)而誘導(dǎo)為NEPC PDX 模型。這種體現(xiàn)疾病動(dòng)態(tài)過程的模型制備方法,能夠完整地再現(xiàn)臨床病人的特征,是理想的動(dòng)物模型。Jongsma 等[30]建立的 NE分化模型PC-310,為HNPC PDX 模型轉(zhuǎn)變?yōu)镹EPC表型奠定了良好基礎(chǔ)。Wu 等[31]使用多西紫杉醇誘導(dǎo)B45354 模型出現(xiàn) NE 特征,為研究 NE 細(xì)胞在Pca 進(jìn)展過程中的作用提供了優(yōu)良的動(dòng)物模型。但由于缺乏大量的PDX 模型進(jìn)行支撐和考證,上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步確認(rèn),因此,建立NEPC 動(dòng)態(tài)研究模型仍然需要不斷地努力。

2 CRPC PDX 模型的腫瘤病理生理學(xué)特征

為了更好的了解臨床患者腫瘤的病理生理學(xué)特征,在CRPC PDX 模型上進(jìn)行擴(kuò)散,轉(zhuǎn)移和耐藥等病理研究,能夠?yàn)檗D(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路識(shí)別和靶向藥物測(cè)試提供重要參考。

2.1 PDX 模型的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移特性

擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移是前列腺癌重要的生物特征。據(jù)調(diào)查顯示, 轉(zhuǎn)移性 CRPC (metastatic castration resistant prostate cancer,mCRPC)腫瘤細(xì)胞最常定植于骨骼(55%), 其次是淋巴結(jié)(52%) 和肝(48%)[32]。CRPC 患者一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移,其死亡風(fēng)險(xiǎn)將顯著升高。因此,mCRPC 的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移機(jī)制已成為前列腺癌防治研究的重要環(huán)節(jié),成功建立真實(shí)模擬人CRPC 組織細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為及特征的 PDX 模型已成為研究的重點(diǎn)。目前,制備mCRPC PDX 的方法多是通過將CRPC PDX 模型的瘤體制成單細(xì)胞懸液,再經(jīng)原位注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi),觀察注射部位腫瘤生長(zhǎng)情況[32]。這種制備方法的優(yōu)勢(shì)在于能在較短的時(shí)間內(nèi)成模,并且人為決定腫瘤生長(zhǎng)部位,從而提高mCRPC PDX 模型的成功率。該模型主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)移機(jī)制和新藥開發(fā)研究。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),成骨細(xì)胞表型CRPC PDX 模型在前列腺癌轉(zhuǎn)移研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。例如,Kiefer 等[33]使用骨保護(hù)素Fc-OPG(osteoprotegerin,Fc-OPG)作用于骨轉(zhuǎn)移PDX 模型LuCaP 23.1,明確了Fc-OPG 的使用可減慢骨骼瘤的生長(zhǎng)速度并降低血清PSA 水平。Chiang 等[34]利用前列腺癌轉(zhuǎn)移性LTL-313H 和非轉(zhuǎn)移性LTL-313B 模型的基因表達(dá)譜差異,篩選出與轉(zhuǎn)移相關(guān)的驅(qū)動(dòng)基因GATA2。同樣,這兩種模型也被用于 TMEM45B 基因的篩選[35],并確認(rèn)上述基因的過表達(dá)與前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),從而為預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移提供了新的生物標(biāo)志物。

2.2 PDX 模型的耐藥特性

CRPC 的臨床治療方法以激素治療和化療居多,此外還包括免疫治療和放射核素治療。目前已有研究將CRPC PDX 模型應(yīng)用于以上不同治療方案的臨床前研究。由于PDX 模型缺乏免疫細(xì)胞,無法準(zhǔn)確模擬機(jī)體免疫系統(tǒng)與腫瘤之間的相互作用關(guān)系,因此該模型在腫瘤免疫治療研究中具有一定的局限性。但免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的成功建立為該類研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)工具[36]。在激素治療藥物的相關(guān)研究中,PDX 模型也體現(xiàn)出良好的優(yōu)勢(shì),如阿比特龍(abiraterone)能阻斷腫瘤內(nèi)外雄激素的合成,適用于聯(lián)合治療等,從而顯著提高進(jìn)展期 mCRPC 患者的生存期,但也可能導(dǎo)致耐藥[12,37]。最近有研究將阿比特龍作用于不同系列LuCaP 模型以評(píng)估腫瘤對(duì)藥物敏感性程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LuCaP 35CR 作為耐阿比特龍的PDX 模型,表達(dá)了一系列與持續(xù)低水平AR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的生物遺傳標(biāo)志物[38]。因此,開發(fā)這類耐藥表型的 CRPC PDX 具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值,具有代表性的一個(gè)例子是Lee 等[39]應(yīng)用 MDA PCa 118b PDX 模型發(fā)現(xiàn)了CRPC 骨轉(zhuǎn)移的耐藥機(jī)制,結(jié)果顯示骨轉(zhuǎn)移灶中也存在對(duì)卡博替尼耐藥的腫瘤細(xì)胞,其耐藥原因是因?yàn)楸磉_(dá)了整聯(lián)蛋白配體。另外,這類耐藥模型還可用于新治療方案的開發(fā)。Suominen 等[40]通過耐阿比特龍的LuCaP 58 模型成功測(cè)定出放射性藥物鐳223 的作用方式和抗腫瘤功效,結(jié)果顯示鐳223 能夠在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的DNA 雙鏈發(fā)生斷裂以及PSA 水平下降,從而成功抑制腫瘤誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞生長(zhǎng)。Low 等[41]利用耐恩雜魯胺的CRPC PDX 模型證實(shí)RNA 聚合酶 I 抑制劑 BMH-21 可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)并降低Ki67 的增殖指數(shù)。并有研究者將RNA 聚合酶I 抑制劑與PIM 激酶抑制劑聯(lián)合作用于PDX 模型,從而開發(fā)出一種新型的CRPC 治療方法[42]。同樣,Lawrence 等[10]也發(fā)現(xiàn)核糖體靶向劑能對(duì)耐恩雜魯胺和阿比特龍的CRPC PDX 模型重新敏感。此外,隨著近年來對(duì)CRPC 耐藥機(jī)制的深入探索,相關(guān)通路的治療靶標(biāo)也在不斷被開發(fā)。如針對(duì)CRPC 對(duì)mTOR 途徑的依賴性,La等[43]將mTOR 途徑抑制劑Rapalink-1 作用于CRPC PDX 和體外腫瘤類器官發(fā)現(xiàn),Rapalink-1 可以導(dǎo)致小鼠腫瘤消退,具有明顯的抗腫瘤效力。

3 展望

成功建立模擬臨床特征的高保真CRPC PDX模型已成為CRPC 病理機(jī)制研究和靶向藥物篩選的重要前提。理想的CRPC PDX 模型不僅需要準(zhǔn)確模擬原發(fā)腫瘤的生物學(xué)特征及其異質(zhì)性,而且其疾病的進(jìn)展過程及特定基因的表達(dá)情況也應(yīng)與臨床結(jié)果高度相似。但目前CRPC PDX 模型的構(gòu)建仍存在諸多問題,如模型的總體成功率較低,成本較高,建模周期長(zhǎng)等,這些因素限制了CRPC PDX 模型的發(fā)展與應(yīng)用。為此,研究者們正嘗試采取補(bǔ)充外源性雄激素[44],從激素依賴的前列腺癌模型逐步誘導(dǎo)等不同策略,改進(jìn)現(xiàn)階段模型存在的不足,以增加動(dòng)物模型和人類疾病之間的相似性,更好的促進(jìn)臨床前研究成果向臨床的轉(zhuǎn)化。