EV71、CA16、CA10 三價 VP1 蛋白疫苗的有效性和安全性研究

牛棟趙彬彬武婧彭婉君張麗紅劉江寧

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所,衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)是由多種腸道病毒引發(fā)的常見病毒性傳染病,其主要傳播途徑為糞口傳播,多發(fā)于嬰幼兒及5 歲以下兒童[1-5]。手足口病傳染性強(qiáng),通常是自限性的,但少數(shù)患兒可迅速發(fā)展為重癥的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,如急性弛緩性麻痹、腦脊髓炎、無菌性腦炎、暴發(fā)性神經(jīng)性肺水腫等,病死率較高[6-7]。2008 年手足口病在我國開始暴發(fā)流行,此后發(fā)病病例呈逐年上升趨勢,到 2014 年至 2016 年累計(jì)已達(dá) 730 萬例病例[8-11]。人類腸道病毒(human enteroviruses)是手足口病的主要病原, 屬于小 RNA 病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus),為單股正鏈RNA 病毒,由蛋白外殼和核酸組成。人類腸道病毒EV71 (enterovirus 71) 和CA16 (coxsackievirus A16)是手足口病的主要流行病原;近年來,由CA10(coxsackievirus A10)、CA6(coxsackievirus A6)等病毒引起的手足口病病例有所增加[7-12]。其中,EV71和CA10 感染都可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如無菌性腦膜炎和病毒性腦膜炎,以及神經(jīng)源性肺水腫和心肺功能障礙等,最終可能導(dǎo)致死亡。CA16 感染癥狀雖多為輕癥或無癥狀病例,但有研究表明EV71 與CA16 混合型感染更易導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[13]。

目前在我國已上市了針對EV71 的滅活疫苗,然而EV71 疫苗并不能預(yù)防手足口病的其他病原,如CA16 和CA10[14-18]。因此,開發(fā)一種多價手足口病疫苗是更為有效的策略。由于腸道病毒感染可能與自身免疫性疾病有關(guān)[19-21],滅活病毒免疫有引起自身免疫性疾病的潛在風(fēng)險[22];而重組蛋白疫苗可以去掉有害抗原表位,自由編輯、重組抗原蛋白,具有更好的靈活性。腸道病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1 含有主要的抗原決定簇,在 EV71 和CA16 研究中都得到了證實(shí)。本文根據(jù)這一特性,將EV71、CA16 和 CA10 病毒的 VP1 蛋白制成三價蛋白疫苗,每隔2 周對 ICR 小鼠進(jìn)行1 次免疫,并定期檢測小鼠血清中特異性抗體的組成及中和活性,鑒定T 細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng),并評估對乳鼠的免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明:三價VP1 蛋白疫苗能夠有效地誘導(dǎo)出病毒特異的體液免疫和細(xì)胞免疫,能夠保護(hù)乳鼠抵御EV71 病毒感染,同時具有良好的安全性;從而說明該蛋白疫苗具有進(jìn)一步開發(fā)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

110 只 6 周齡 SPF 級 ICR 小鼠,其中雌性 90只,雄性20 只,體重約為25 g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2019-0008】。于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所動物生物安全二級實(shí)驗(yàn)室(ABSL-2)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)【SYXK(京)2019-0014】。飼養(yǎng)環(huán)境:室內(nèi)溫度22 ～ 25℃,濕度40%～70%,12 h 光照/黑暗循環(huán)。動物在籠內(nèi)自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用和管理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:LJN20013)。本 實(shí)驗(yàn) 所用 的 EV71 病 毒為FY0805 毒株經(jīng)小鼠傳代所獲得的適應(yīng)株 MP10(GenBank accession number:HQ712020),CA16 病毒為 shzh05-1 毒株 ( GenBank accession number:262658), CA10 病毒毒株( GenBank accession number:MF688814.1)。EV71 VP1 蛋白、CA10 VP1蛋白經(jīng)設(shè)計(jì)由北京義翹神州科技有限公司合成,蛋白濃度分別為0.57 mg/mL 和0.21 mg/mL。CA16 VP1 蛋白購自北京義翹神州科技有限公司,純度大于85%。

1.1.2 主要試劑與儀器

弗氏完全佐劑(Sigma-Aldrich,F5881-10ML),弗氏不完全佐劑(Sigma-Aldrich,F5506-10ML),山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)(Abcam,ab6789),山羊抗小鼠IgM mu chain(HRP)(Abcam,ab97230),單組分TMB 顯色液(Solarbio,PR1200),PMA+Ionomycin淋巴細(xì)胞刺激物(達(dá)優(yōu),20304210),Mouse IFN-gamma ELISpot PLUS(ALP),strips(MabTech,3321-4AST-2), PROCARTAPLEX 11 PLEX (Invitrogen,PPX-11), TRIzolTMReagent (Ambion, 15596018)QuantiTect Probe RT-PCR Kit (Qiagen, 204443),RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo ScientificTM,K1622),TB Green? Premix Ex TaqTMII(Takara,RR820A)。

多功能發(fā)光分析儀(FLUOstar Omega,德國),Mabtech IRIS ELISPOT 讀板儀(Mabtech,瑞典),T100TMThermal Cycler(Bio-rad,美國),QuantStudioTM3 Real-Time PCR System,96-well,0.2 mL(Applied BiosystemsTM,美國)

1.2 方法

1.2.1 動物分組及免疫

6 周齡 ICR 母鼠隨機(jī)分為 5 組,每組 16 只。三價VP1 蛋白疫苗組按照不同劑量分為3 組,CV-2.5組、CV-5 組和 CV-10 組:經(jīng)腹腔免疫 EV71、CA16、CA10 三種VP1 蛋白等比混合的三價VP1 蛋白疫苗(每種 VP1 蛋白 2.5、5、10 μg)。陰性對照組:腹腔免疫生理鹽水。陽性對照組:腹腔免疫 EV71、CA16、CA10 三種等比混合的陽性疫苗。各組在免疫后的14、28 d 時加強(qiáng)免疫,初次免疫用弗氏完全佐劑,加強(qiáng)免疫時用弗氏不完全佐劑。在每次免疫前采血分離血清,免疫后的35 d 無菌取脾。血清用于細(xì)胞因子、病毒特異性抗體、中和抗體效價檢測,脾用于細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測。每組的部分小鼠在14 d免疫后與雄鼠按2 ∶1進(jìn)行合籠。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測

采用Luminex 法檢測血清中細(xì)胞因子的水平。收集小鼠血液于EP 管中,分離血清,按照試劑盒說明進(jìn)行 IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13 細(xì)胞因子的檢測。

1.2.3 抗體陽性檢測

采用間接ELISA 的方法進(jìn)行檢測,用包被液(0.05 mol/L,PH=9.6 的碳酸鹽緩沖液)稀釋抗原,并加入到酶標(biāo)板中(每孔100 μL),4℃過夜;棄去包被液,洗滌后加入含有1% BSA 的PBST 封閉1 h;之后加入稀釋好(1 ∶100/1 ∶1000)的血清 37℃孵育2 h;棄去孔內(nèi)液體,洗滌后加入100 μL HRP 標(biāo)記的羊抗鼠抗體,37℃孵育1.5 h;洗滌后加入100 μL TMB 顯色液37℃顯色5 min,加入 50 μL 2 mmol/L的H2SO4終止顯色,酶標(biāo)儀測定A450。根據(jù) P/N 的值來判斷抗體是否為陽性,P/N 值(陽性孔/陰性孔OD 值)大于或等于2.1 為陽性;P/N 值小于2.1,但大于1.5 為可疑;P/N 值小于1.5 為陰性。

1.2.4 中和抗體水平檢測

采用體外微量中和試驗(yàn)進(jìn)行檢測。將血清放入56℃的金屬浴加熱30 min,滅活補(bǔ)體后的血清從23開始進(jìn)行2 倍系列稀釋,分別與100 TCID50的病毒進(jìn)行等體積混合,37℃中和80 min,將孵育好的混合液加入到長有80% RD 細(xì)胞的培養(yǎng)板中,正常RD細(xì)胞作為空白對照組,病毒感染對照組加入100 μL的100 TCID50病毒液;將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng) 3 d,在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE),并按照 Reed-Muench 法計(jì)算中和抗體的滴度。

1.2.5 脾中特異性分泌IFN-γ 的淋巴細(xì)胞檢測

第3 次免疫后7 d,每組隨機(jī)抽取6 只小鼠,無菌取脾并制備細(xì)胞懸液,按照每孔3 × 105個細(xì)胞放入96 孔板中,并加入PMA + Ionomycin 淋巴細(xì)胞刺激劑、滅活的EV71 病毒、滅活的CA16 病毒、滅活的CA10 病毒刺激24 h,按照ELISpot 試劑盒說明書檢測細(xì)胞分泌IFN-γ 時生成的斑點(diǎn)數(shù)。

1.2.6 新生乳鼠的病毒感染實(shí)驗(yàn)

經(jīng)免疫的雌鼠產(chǎn)生的1 日齡ICR 小鼠30 窩,每窩8 ～10 只,分別經(jīng)腹腔注射 LD50劑量的 EV71、CA16 或CA10 病毒,觀察組共觀察14 d,期間記錄臨床評分、生存率、體重;解剖組在3 ～5 d 時取小鼠血液和后肢肌肉用于病毒載量的檢測。

1.2.7 RNA 的提取以及qPCR 檢測病毒載量

血液與后肢肌肉采用TRIzol 法進(jìn)行總RNA 的提取,經(jīng)CA16 感染的小鼠樣本需在提取RNA 后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn),并利用染料法qPCR 制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣本中CA16 病毒核酸的拷貝數(shù)。經(jīng)EV71 或CA10 感染的組織樣本利用探針法qPCR 制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定其EV71 或 CA16 病毒核酸的拷貝數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用 IBM SPSS 23 和 GraphPad Prism 8 軟件處理,兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以P< 0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 三價VP1 蛋白疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒特異性的中和抗體

本實(shí)驗(yàn)采用6 周齡ICR 雌鼠對三價VP1 蛋白疫苗(EV71、CA16 和 CA10 三種病毒的 VP1 蛋白混合疫苗)進(jìn)行評價,蛋白疫苗按照劑量分為2.5 μg(CV-2.5)、5 μg(CV-5)和 10 μg(CV-10)3 個實(shí)驗(yàn)組,并以EV71、CA16 和CA10 三種滅活病毒混合形成的疫苗作為陽性對照(PC)、以生理鹽水作為陰性對照(NC)。初次免疫后,分別在14、28 d 進(jìn)行第2次和第 3 次加強(qiáng)免疫。一免后 14、28、35 d 分別檢測血清中IgG、IgM 抗體水平。

三價VP1 蛋白疫苗初次免疫后,在14 ～35 d的檢測期內(nèi)VP1 蛋白特異的IgG 和IgM 抗體均為陽性,同時抗體能與滅活病毒進(jìn)行特異性的結(jié)合(表1)。選取免疫后35 d 的血清來檢測抗體的中和滴度(neutralization titer,NT)。從結(jié)果可見(圖1A):三價VP1 蛋白疫苗的免疫血清對CA10 病毒的中和活性最高,3 種劑量都超過了26;對EV71 病毒中和活性次之,NT 在25～ 26之間;對CA16 病毒的中和能力較差,均不到25。與PC 組相比,蛋白疫苗免疫血清中和活性均下降約4 倍。以上結(jié)果證明,三價VP1 蛋白疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有中和活性,對EV71 和CA10 病毒的中和作用尤為明顯;同時,三價VP1 蛋白疫苗的不同劑量并未使疫苗血清的中和活性發(fā)生顯著性的差異。

2.2 三價VP1 蛋白疫苗能夠誘導(dǎo)病毒特異的T 細(xì)胞反應(yīng)

根據(jù)動物實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù),EV71、CA16 的滅活病毒疫苗能夠有效的激活細(xì)胞免疫反應(yīng)[23-24];在本研究中PC 組也得到了相似的結(jié)果,三種病毒特異的T 細(xì)胞反應(yīng)都得到了有效的誘導(dǎo)(圖1B、C)。同時,發(fā)現(xiàn)三價VP1 蛋白疫苗對T 細(xì)胞也具有活化作用:相對于陰性對照,接種過蛋白疫苗的小鼠有更多的脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ;其中EV71 VP1 蛋白的誘導(dǎo)作用最為突出,檢測到的IFN-γ 陽性點(diǎn)均超過130;三種蛋白劑量中CV-5 劑量組相對于NC 組,在不同病毒刺激下其表達(dá)的IFN-γ 均具有顯著性差異,說明其激活病毒特異的T 細(xì)胞反應(yīng)更為穩(wěn)定(圖1B、C)。研究表明,重組蛋白疫苗可通過被抗原遞呈細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、DC 細(xì)胞)吞噬、加工,再遞呈給T 細(xì)胞,產(chǎn)生特異的T 細(xì)胞反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中的中劑量三價VP1 蛋白疫苗能誘導(dǎo)出有效的、病毒特異的T 細(xì)胞反應(yīng),其中5 μg 的蛋白劑量表現(xiàn)更好;以EV71 VP1 蛋白效果最佳,CA16 VP1 蛋白次之;但是蛋白疫苗均未達(dá)到滅活病毒疫苗的誘導(dǎo)活性。

2.3 三價VP1 蛋白疫苗免疫未引發(fā)炎癥反應(yīng)

疫苗的安全性是疫苗研究的重要部分,由于在EV71 感染引起的腦干腦炎、肺水腫并發(fā)癥的患者體內(nèi),炎癥細(xì)胞因子水平明顯升高[25-26],因此在疫苗的開發(fā)使用中有必要考慮細(xì)胞因子的變化情況?；谝陨峡紤],滅活EV71 疫苗的研究中增加了對免疫前后的炎性細(xì)胞因子的檢測[27],結(jié)果表明接種疫苗引起的免疫應(yīng)答中未產(chǎn)生炎癥反應(yīng),從而支持了疫苗的安全性。同理,檢查了三價VP1 蛋白疫苗免疫后小鼠血清中10 種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的變化情況(圖2)。蛋白疫苗組血清中大部分炎癥相關(guān)細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70)的水平與同期采集的陰性對照組無顯著性差異;CV-2.5 組的IL-2 在14 d 時有短暫的升高,而到35 d 時又恢復(fù)到免疫前水平;IL-13 作為抑制炎癥的細(xì)胞因子,在蛋白免疫組(CV-2.5 組、CV-10組)檢測到了高水平的表達(dá)。PC 組免疫后IFN-γ 和TNF-α 的水平有短暫的升高,但最終降回至陰性對照水平。此外,在免疫后的小鼠日常觀察中未發(fā)現(xiàn)疫苗組小鼠與NC 組存在明顯差異。以上數(shù)據(jù)表明,三價VP1 蛋白疫苗以及滅活病毒疫苗均不會使機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),也未影響小鼠的正常生長,這些數(shù)據(jù)提示該疫苗具有良好的安全性。

表1 三價VP1 蛋白疫苗三次免疫血清中抗體持續(xù)陽性情況檢測結(jié)果Table 1 Test results of continuous positive antibodies in the three immunized serums of the trivalent VP1 protein vaccine

注:A:免疫35 d 后小鼠血清的中和抗體滴度變化情況,n=3;B:免疫35 d 后小鼠脾細(xì)胞中病毒特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)分泌IFN-γ 結(jié)果,n=4;C:免疫 35 d 后小鼠脾細(xì)胞中病毒特異性 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)分泌 IFN-γ 結(jié)果;與 PC 組相比,*P< 0.05,??P < 0.01,???P < 0.001;與 NC 組相比,#P< 0.05,##P < 0.01,###P < 0.001。圖1 三價VP1 蛋白疫苗免疫血清中中和抗體滴度變化情況及病毒特異性T 免疫細(xì)胞反應(yīng)檢測結(jié)果Note. A. Changes of neutralizing antibody titers in mouse serum after 35 d of immunization, n=3. B. IFN-γ secreted by virus-specific T cell immune response in mouse spleen cells after 35 d of immunization, n=4. C. The results of IFN-γ secreted by virus-specific T cell immune response in mouse spleen cells after 35 d of immunization,n=4. Compared with the PC group, *P < 0.05, ??P < 0.01, ???P < 0.001. Compared with the NC group,#P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001.Figure 1 Changes of neutralizing antibody titers in the immune serum of the trivalent VP1 protein vaccine and the detection results of virus-specific T immune cell responses

2.4 三價VP1 蛋白疫苗對新生乳鼠的免疫保護(hù)作用

由于免疫母鼠的母源抗體可以通過乳汁轉(zhuǎn)移到新生乳鼠中,從而使乳鼠具有抵抗病毒侵染的能力[28-29]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)滅活病毒疫苗(PC 組)對母鼠的免疫使其后代免受病毒的感染,且對三種病毒均有效(圖3)。與之相比,三價 VP1 蛋白疫苗只在EV71 病毒感染時表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用:5 μg 的VP1 蛋白劑量(CV-5)的保護(hù)效果最為顯著,其乳鼠的死亡率為0;臨床評分在感染后3 ～10 d 之間有短期的上升,而到第11 天即恢復(fù)正常;乳鼠的體重也接近于PC 組;在抑制病毒復(fù)制方面,CV-5 組的乳鼠血液和肌肉組織中的病毒載量也顯著降低。三價VP1 蛋白疫苗雖然激活了母鼠體內(nèi)對CA16 和CA10 的病毒特異性體液免疫和細(xì)胞免疫,但這些免疫反應(yīng)并未給乳鼠提供免疫保護(hù)作用,從生存率、臨床評分到病毒載量都沒有顯著改善。對三種病毒的不同反應(yīng),說明三價VP1 蛋白疫苗提供的免疫保護(hù)作用存在病毒差異,這可能是不同病毒VP1蛋白免疫原特性存在差異。

圖2 三價VP1 蛋白疫苗免疫血清中細(xì)胞因子變化情況(n=4)Figure 2 Changes of cytokines in the immune serum of trivalent VP1 protein vaccine(n=4)

注:A:1 日齡小鼠感染LD50病毒生存率變化結(jié)果,每種病毒感染乳鼠數(shù)量n=10;B:1 日齡小鼠感染LD50病毒體重變化結(jié)果,每種病毒感染乳鼠數(shù)量n=10;C:1 日齡小鼠感染LD50病毒臨床評分結(jié)果,每種病毒感染乳鼠數(shù)量n=10;D:1 日齡小鼠感染LD50病毒瀕臨死亡時血液病毒載量結(jié)果,每種病毒感染乳鼠數(shù)量n=5;E:1 日齡小鼠感染LD50病毒瀕臨死亡時肌肉病毒載量結(jié)果,每種病毒感染乳鼠數(shù)量 n=5;與 CV-5 組相比,△P< 0.05,△△P < 0.01;與 PC 組相比,*P< 0.05,??P < 0.01,???P < 0.001;與 NC 組相比,#P< 0.05,##P< 0.01。圖3 三P 價VP1 蛋白疫苗對新生乳鼠的免疫保護(hù)作用Note. A. Results of the survival rate of 1-day-old mice infected with LD50 virus, the number of neonatal mice infected by each virus was n=10.B. Results of the body weight changes of 1 d mice infected with LD50 virus, the number of neonatal mice infected by each virus was n=10. C.Results of clinical scoring of 1 d mice infected with LD50, the number of neonatal mice infected by each virus was n=10. D. Results of blood viral load when 1 d old mice were infected with LD50 virus and were dying, the number of neonatal mice infected by each virus was n=5. E.Results of muscle viral load when 1 d old mice were infected with LD50virus and were dying, the number of neonatal mice infected by each virus was n=5. Compared with the CV-5 group, △P < 0.05, △△P < 0.01. Compared with the PC group, *P < 0.05, ??P < 0.01, ???P <0.001. Compared with the NC group, #P <0.05, ##P <0.01.Figure 3 Immunoprotective effect of trivalent VP1 protein vaccine on neonatal mice

3 討論

預(yù)防性疫苗一直是防止傳染性疾病流行的重要手段,手足口病疫苗的研發(fā)也一向是我國疫苗研究的重要方向。目前,我國已上市了三種針對EV71病毒C4 亞型的滅活疫苗,分別由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所、北京科興生物制品有限公司和武漢生物制品研究所研發(fā)和生產(chǎn),臨床數(shù)據(jù)也證實(shí)了這些疫苗的有效性和安全性[14-18]。但是EV71 疫苗只針對EV71 感染有中和活性,對其他腸道病毒并無顯著的交叉反應(yīng),而作為多病原的手足口病還需要多價疫苗來實(shí)現(xiàn)更廣泛的保護(hù)作用。因此,近些年對于二價、三價、四價的手足口疫苗的研究越來越多,涉及的病毒包括流行最為廣泛且具有高重癥率的 EV71、CA16、CA10 和 CA6 病毒;疫苗類型常采用滅活病毒疫苗、 重組病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP)疫苗、多肽疫苗等[19-20,23-24,28-29]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合前期工作,發(fā)現(xiàn)腸道病毒的VP1蛋白含有病毒重要的抗原決定簇[21-22,30-31],因此合成了 EV71、CA16 和 CA10 病毒的 VP1 蛋白作為疫苗的候選蛋白,按照低劑量(2.5 μg,CV-2.5)、中劑量(5 μg,CV-5)和高劑量(10 μg,CV-10)對 ICR 小鼠進(jìn)行3 次免疫,并以滅活病毒疫苗作為陽性對照(PC)、以生理鹽水作為陰性對照(NC)。

從疫苗免疫后血清的抗體檢測結(jié)果看來,三價VP1 蛋白疫苗能夠持續(xù)性的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生VP1 蛋白特異的IgG、IgM 抗體和病毒特異的IgG、IgM 抗體,并且這些抗體對病毒具有中和活性,其中對EV71 和CA10 病毒的中和能力較強(qiáng);不過蛋白疫苗抗體的中和活性仍弱于滅活病毒疫苗,兩者中和抗體滴度相差約4 倍。除了誘導(dǎo)病毒特異性體液免疫反應(yīng),三價VP1 蛋白疫苗也能激活病毒特異的T 細(xì)胞反應(yīng),其中對EV71 病毒的反應(yīng)最為明顯。通過檢測免疫小鼠脾細(xì)胞中病毒特異的IFN-γ 分泌T 細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)CV-5 蛋白疫苗組具有有效、穩(wěn)定的T細(xì)胞免疫反應(yīng),對三種病毒的刺激都能產(chǎn)生顯著反應(yīng)。從這些體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可見,三價VP1 蛋白疫苗既能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒特異的抗體,又能活化病毒特異的T 細(xì)胞反應(yīng),其中中劑量的VP1 蛋白效果最佳。

除了疫苗的有效性,安全性也是疫苗關(guān)注的另一個重要方面。在臨床上,手足口患兒、尤其是重癥病人血液和腦脊液中能檢測到高水平的促炎細(xì)胞因子,例如 IFN-γ、IL-6 和 TNF-α;因此經(jīng)常將促炎因子與病程重癥性聯(lián)系在一起[25-26]。通過檢測10 種主要的、與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子在免疫血清中的水平,發(fā)現(xiàn)除了IL-2 和IL-13 其他細(xì)胞因子(IFN-γ、 TNF-α、 IL-1β、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-10、 IL-12p70)在蛋白疫苗免疫后并未發(fā)生顯著變化。而IL-2 只有短暫的上升,35 d 時已恢復(fù)到免疫前的水平;IL-13 是唯一在35 d 時表達(dá)水平仍處于高位的細(xì)胞因子,其作用常與IL-4 聯(lián)系在一起,具有抑制炎性反應(yīng)的作用[32]。另外,在小鼠免疫后的日常觀察中也未發(fā)現(xiàn)蛋白疫苗組小鼠的異常,這些結(jié)果提示三價VP1 蛋白疫苗具有良好的安全性。

與已上市的三家EV71 滅活疫苗相比[33],在動物實(shí)驗(yàn)中三價VP1 蛋白疫苗對EV71 保護(hù)有效性方面略低于滅活疫苗,但在中和抗體滴度方面三價VP1 蛋白疫苗表現(xiàn)出了對CA16、CA10 的保護(hù)作用,體現(xiàn)出了三價VP1 蛋白疫苗的優(yōu)勢。

對于三價VP1 蛋白疫苗的體內(nèi)功能,本文利用了乳鼠感染模型。免疫后母鼠的母源抗體通過乳汁轉(zhuǎn)移到新生乳鼠中,觀察乳鼠對病毒感染的抵抗能力可以判斷蛋白抗體的免疫保護(hù)作用[28-29],滅活疫苗的這種被動免疫保護(hù)作用非常顯著。根據(jù)存活率、臨床評分、乳鼠體重、以及血液和肌肉組織中病毒載量的數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)三價VP1 蛋白疫苗對乳鼠的被動免疫保護(hù)作用只針對EV71 感染有效,VP1 蛋白免疫劑量為5 μg 時不僅能使乳鼠全部存活,而且能夠有效抑制EV71 病毒的復(fù)制。但是,VP1 蛋白疫苗對CA16 和CA10 并未表現(xiàn)出足夠的免疫活性,未能使乳鼠對這兩種病毒的感染產(chǎn)生抵抗能力。綜上所述,三價VP1 蛋白疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒特異的中和性IgG、IgM 抗體,同時能激活病毒特異的T 細(xì)胞免疫反應(yīng);中劑量的VP1 蛋白可達(dá)到穩(wěn)定的免疫效果;此外,蛋白疫苗免疫并未造成炎性細(xì)胞因子的劇烈變化,其安全性也得到了證實(shí);從而表明三價VP1 蛋白疫苗對開發(fā)手足口多價疫苗具有一定的啟示性。但是,蛋白疫苗的免疫活性仍低于滅活病毒疫苗,尤其對乳鼠的免疫保護(hù)作用只發(fā)生在EV71 感染時,對其它兩種病毒保護(hù)作用較低。這些缺陷說明:對于 CA16 和 CA10 病毒,簡單的VP1 蛋白并不能提供有效的免疫原性,有必要結(jié)合其他免疫決定簇,以形成更為完善的蛋白疫苗。