山蠟梅葉酚性成分的研究

郭 娜，田燕元，舒任庚，劉嘉麗

(江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西 南昌 330004)

山蠟梅ChimonanthusnitensOliv.，為蠟梅科蠟梅屬多年生常綠灌木，產于我國多個省區(qū)，為中國所特有的藥用植物[1]?！吨袊幍洹穂2]早有記載山蠟梅葉可用于防治感冒和流行性感冒，民間有以山蠟梅葉泡茶飲來防治感冒的風俗[3]，已有山蠟梅葉顆粒、山蠟梅葉片、山蠟梅葉膠囊、山蠟梅清感茶等產品用于治療風熱感冒、發(fā)熱咽痛等癥。此外，另有研究表明，山蠟梅在減肥降脂、抑菌抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗抑郁[3-5]等方面均有良好的作用。目前，國內外學者對于山蠟梅植物化學成分的研究，重點在其揮發(fā)油[6]、黃酮類[7]、香豆素類[8]、生物堿類[9]等成分。本研究從中分離得到了13個酚性化合物，其中化合物1、3、6～7、9～12為首次從該屬植物中分離得到，化合物1、3～4、6～12為首次從該植物中分離得到。

1 材料

Bruker Avance Ⅲ HD 600 MHz 型核磁共振儀(TMS為內標)；AB SCIEX TripleTOF 5600+型高分辨質譜儀(美國AB公司)；Waters-2489半制備HPLC(美國Waters公司)；ODS(日本三菱化工)；薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)；薄層層析硅膠板HSGF254(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；Sephadex LH-20(瑞士Pharmacia公司)；AB-8大孔吸附樹脂(東鴻化工有限公司)；半制備HPLC所用試劑為色譜純；其余試劑為分析純(西隴化工股份有限公司)。

山蠟梅葉于2018年6月采自江西省婺源縣曉起鎮(zhèn)達江嶺山坡，經江西中醫(yī)藥大學藥學院葛菲教授鑒定為蠟梅科蠟梅屬植物山蠟梅ChimonanthusnitensOliv.的葉，標本(20180617)保存在江西中醫(yī)藥大學藥學院標本館。

2 提取與分離

取干燥山蠟梅葉20 kg，粉碎，用90%乙醇滲濾提取，合并提取液，減壓濃縮得浸膏 9 kg。取浸膏3 kg，用1%HCl溶液反復溶解，直至生物堿顯色反應為陰性，得酸溶性、酸不溶性成分。將酸不溶性成分進行硅膠柱層析，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇洗脫。將各部分洗脫液減壓濃縮，得石油醚部位浸膏260 g、二氯甲烷部位浸膏140 g、乙酸乙酯部位浸膏130 g、丙酮部位浸膏80 g、甲醇部位浸膏400 g。取乙酸乙酯部位浸膏(130 g)，采用濕法裝柱，干法上樣的方法進行硅膠柱色譜分離，采用二氯甲烷-甲醇(60∶1～0∶1)梯度洗脫，得到10個組分Fr.1～10。Fr.3(11.7 g)經硅膠柱二氯甲烷-乙酸乙酯(30∶1～0∶1)洗脫，得11個組分Fr.3.1～Fr.3.11。Fr.3.4(1.2 g)經ODS柱(甲醇-水)分離，得Fr.3.4.1～ Fr.3.4.6。Fr.3.4.1經半制備HPLC分離(25%甲醇-水)，再經Sephadex LH-20柱，得化合物1(16 mg)。Fr.3.5(2.5 g)經ODS柱(甲醇-水)，得Fr.3.5.1～Fr.3.5.11，Fr.3.5.2經半制備HPLC(25%甲醇-水)分離，得化合物3(4 mg)，Fr.3.5.3和Fr.3.5.4經重結晶，分別得化合物2(10 mg)、7(10 mg)。Fr.3.8(0.25 g)經硅膠柱二氯甲烷-乙酸乙酯(50∶1 ～0∶1)和制備薄層色譜二氯甲烷-甲醇(40∶1)分離，得化合物6(3 mg)。Fr.5(26.6 g)經硅膠柱二氯甲烷-甲醇(100∶1～0∶1)分離，得Fr.5.1～Fr.5.9，Fr.5.4(2.3 g)經ODS柱(甲醇-水)分離，得Fr.5.4.1～Fr.5.4.9，Fr.5.4.2經重結晶，得化合物4(10 mg)。取二氯甲烷部位浸膏(140 g)，經AB-8大孔吸附樹脂，采用30%、50%、70%、95%、100%乙醇-水依次進行洗脫，得到5個流分Fr.1～5。Fr.2(15.0 g)經硅膠柱石油醚-乙酸乙酯(15∶1～0∶1)分離，得Fr.2.1 ～Fr.2.8，Fr.2.2(70 mg)經ODS柱(甲醇-水)，得化合物5(2 mg)。Fr.3(7.0 g)經硅膠柱石油醚-乙酸乙酯(25∶1～0∶1)分離，得到11個組分Fr.3.1～Fr.3.11。Fr.3.5(0.83 g)經ODS柱(甲醇-水)和半制備HPLC(55%甲醇-水)，得化合物8(5 mg)、9(2 mg)。Fr.3.9(1.3 g)經ODS柱(甲醇-水)和Sephadex LH-20，得Fr.3.9.1～Fr.3.9.15，Fr.3.9.3經半制備HPLC(45%甲醇-水)，得化合物10(2 mg)、12(4 mg)。Fr.3.9.4經半制備HPLC(45%甲醇-水)，得化合物11(2 mg)。Fr.4(38.0 g)經AB-8大孔吸附樹脂分離，以0%、30%、50%、75%、95%、100%乙醇-水依次洗脫，得Fr.4.1～ Fr.4.5。Fr.4.2(0.6 g)經硅膠柱石油醚-二氯甲烷(10∶1～0∶1，二氯甲烷-甲醇(30∶1～0∶1)，Fr.4.2.3再重結晶，得化合物13(3 mg)。

3 結構鑒定

化合物1：無色晶體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z：167.036 9[M-H]-，分子式C8H8O4。1H-NMR (600 MHz，CH3OD)δ：7.38 (2H，dd，J=8.2，1.3 Hz，H-2，6)，6.77 (1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，3.79 (3H，s，-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，CH3OD)δ：123.6 (C-1)，117.4 (C-2)，146.2 (C-3)，151.7 (C-4)，115.8 (C-5)，122.5 (C-6)，168.8 (C-7)，52.2 (C-8)。以上數據與文獻[10]基本一致，故鑒定為3,4-二羥基苯甲酸甲酯。

化合物2：無色針狀晶體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z：153.053 2[M+H]+，分子式C8H8O3。1H-NMR (600 MHz，CH3OD)δ：7.85(2H，m，H-2，6)，6.81 (2H，m，H-3，5)，3.82 (3H，s，-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，CH3OD)δ：122.1 (C-1)，132.7 (C-2，6)，116.1 (C-3，5)，163.4 (C-4)，168.7 (C-1)，52.2 (-OCH3)。以上數據與文獻[11]基本一致，故鑒定為對羥基苯甲酸甲酯。

化合物3：無色晶體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z：371.138 8[2M+K]+，分子式C9H10O3。1H-NMR (600 MHz，CH3OD)δ：7.07 (2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6)，6.72 (2H，d，J=8.5 Hz，H-3，5)，3.66 (2H，s，H-7)，3.52 (3H，s，-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，CH3OD)δ：126.2 (C-1)，131.3 (C-2，6)，116.3 (C-3，5)，157.7 (C-4)，40.9 (C-7)，174.6 (C-8)，52.4 (-OCH3)。以上數據與文獻[12]基本一致，故鑒定為對羥基苯乙酸甲酯。

化合物4：無色針狀晶體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z：149.023 2[M+K]+，分子式C6H6O2。1H-NMR (600 MHz，CH3OD)δ：6.60 (4H，s，H-2，3，5，6)；13C-NMR (150 MHz，CH3OD)δ：151.2 (C-1，4)，116.8 (C-2，3，5，6)。以上數據與文獻[13]基本一致，故鑒定為對苯二酚。

化合物5：無色針狀晶體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z：165.057 1[M-H]-，分子式C9H10O3。1H-NMR (600 MHz，CDCl3)δ：7.99 (2H，d，J=8.1 Hz，H-2，6)，6.88 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3，5)，4.37 (2H，q，J=7.1 Hz，H-2′)，1.40 (3H，t，J=7.1 Hz，H-3′)；13C-NMR (150 MHz，CDCl3)δ：14.5 (C-3′)，60.9 (C-2′)，166.5 (C-1′)，123.3 (C-1)，132.0 (C-2，6)，115.2 (C-3，5)，159.7 (C-4)。以上數據與文獻[14]基本一致，故鑒定為對羥基苯甲酸乙酯。

化合物6：無色油狀液體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z：249.072 2[M+Na]+，分子式C11H14O5。1H-NMR (600 MHz，CH3OD)δ：6.86 (1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.74 (1H，d，J=8.1 Hz,H-5′)6.71(1H，dd，J=8.2，1.9 Hz，H-6′)，4.05 (1H，dd，J=10.0，8.8 Hz，H-3a)，3.83 (3H，s，3′-OCH3)，3.70 (1H，m，H-3b)，3.66 (1H，m，H-2)，3.69 (3H，s，1-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，CH3OD)δ：52.4 (1-OCH3)，55.3 (C-2)，56.4 (3′-OCH3)，65.3 (C-3)，112.6 (C-2′)，116.4 (C-5′)，121.8 (C-6′)，128.5 (C-1′)，147.4 (C-4′)，149.1 (C-3′)，175.2 (C-1)。以上數據與文獻[15]基本一致，故鑒定為ficusol。

化合物7：無色針狀晶體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z：179.067 8[M+H]+，分子式C10H10O3。1H-NMR (600 MHz，CH3OD)δ：7.57 (1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.39 (2H，d，J=8.2 Hz，H-2，6)，6.79 (2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，6.26 (1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，3.72 (3H，s，-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，CH3OD)δ：127.0 (C-1)，131.1 (C-2，6)，116.7 (C-3，5)，161.1 (C-4)，146.4 (C-7)，114.8 (C-8)，169.7 (C-9)，52.0 (-OCH3)。以上數據與文獻[16]基本一致，故鑒定為methylp-hydroxy-trans-cinnamate。

化合物8：淡黃色粉末形晶體(二氯甲烷-甲醇)。HR-ESI-MSm/z：319.151 0[2M+Na]+，分子式C9H8O2。1H-NMR (600 MHz，CDCl3)δ：7.79 (1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，7.56 (2H，dd，J=6.8，2.9 Hz，H-2，6)，7.41 (3H，m，H-3，4，5)，6.46 (1H，d，J=16.0 Hz，H-8)；13C-NMR (150 MHz，CDCl3)δ：134.2 (C-1)，128.5 (C-2，6)，129.1 (C-3，5)，130.9 (C-4)，147.2 (C-7)，117.1 (C-8)，170.9 (C-9)。以上數據與文獻[17]基本一致，故鑒定為trans-cinnamic acid。

化合物9：淡黃色油狀液體(二氯甲烷-甲醇)。HR-ESI-MSm/z：191.072 4[M-H]-，分子式C11H12O3。1H-NMR (600 MHz，CH3OD)δ：7.59 (1H，d，J=15.8 Hz，H-7)，7.44 (2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6)，6.79 (2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，6.30 (1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，4.20 (2H，q，J=7.1 Hz，H-11)，1.30 (3H，t，J=7.1 Hz，H-12)；13C-NMR (150 MHz，CH3OD)δ：127.1 (C-1)，131.1 (C-2，6)，116.9 (C-3，5)，161.4 (C-4)，146.4 (C-7)，115.3 (C-8)，169.3 (C-9)，61.4 (C-10)，14.6 (C-11)。以上數據與文獻[18]基本一致，故鑒定為trans-p-hydroxyl ethyl cinnamate。

化合物10：淡黃色油狀液體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z：205.061 4[M+H]+，分子式C12H12O3。1H-NMR (600 MHz，CH3OD)δ：7.65 (1H，d，J=8.6 Hz，H-4)，7.63 (1H，d，J=15.8 Hz，H-3)，7.47 (2H，d，J=8.6 Hz，H-2′)，6.82 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3′)，6.77 (1H，d，J=8.8 Hz，H-5)，6.34 (1H，d，J=15.9 Hz，H-2)，3.78 (3H，s，-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，CH3OD)δ：169.8 (C-1)，161.6 (C-4)，146.6 (C-3)，133.6 (C-4)，131.1 (C-2′，6′)，126.9 (C-1′)，116.9 (C-3′，5′)，115.9 (C-5)，114.7 (C-2)，52.0 (-OCH3)。以上數據與文獻[19]基本一致，故鑒定為avenalumic acid methyl ester。

化合物11：無色塊狀晶體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z：417.153 8[M-H]-，分子式C22H26O8。1H-NMR (600 MHz，CDCl3)δ：3.08 (2H，m，H-1，5)，3.89 (2H，dd，J=9.2，3.3 Hz，H-4b，8b)，4.26 (2H，m，H-4a，8a)，4.71 (2H，d，J=4.0 Hz，H-2，6)，5.67 (2H，s，-OH)，3.86 (12H，s，4 × OCH3)，6.56 (4H，s，H-1′，6′，1″，6″)；13C-NMR (150 MHz，CDCl3)δ：54.3 (C-1，5)，86.1 (C-2，6)，71.8 (C-4，8)，132.0 (C-1′，1″)，102.7 (C-2′，6′，2″，6″)，134.3 (C-4′，4″)，147.2 (C-3′，5′，3″，5″)，56.4 (4×OCH3)。以上數據與文獻[20]基本一致，故鑒定為丁香酯素。

化合物12：淡黃色油狀液體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z:389.398 2[M+Na]+；分子式C22H22O5。1H-NMR (600 MHz，CH3OD)δ：6.80 (2H，d，J=8.7 Hz，H-2，6)，7.45 (2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，7.59 (1H，overlapped，H-7)，6.31 (1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，6.74 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，7.61 (2H，overlapped，H-3′，5′)，6.85 (1H，d，J=12.8 Hz，H-7′)，5.75 (1H，d，J=12.7 Hz，H-8′)，4.22 (2H，q，J=7.0 Hz，H-1″)，4.16 (2H，q，J=7.1 Hz，H-1?)，1.31 (3H，t，J=7.2 Hz，H-2″)，1.26 (3H，t，J=7.1 Hz，H-2″)；13C-NMR (150 MHz，CH3OD)δ：161.5 (C-1)，116.9 (C-2，6)，131.1 (C-3，5)，127.0 (C-4)，146.4 (C-7)，115.2 (C-8)，169.3 (C-9)，160.1 (C-1′)，115.8 (C-2′，6′)，133.6 (C-3′，5′)，127.6 (C-4′)，144.7 (C-7′)，116.8 (C-8′)，168.4 (C-9′)，61.4 (C-1″)，14.6 (C-2″)，61.2 (C-1?)，14.5(C-2?)。以上數據與文獻[21]基本一致，故鑒定為決明順反二聚苯丙素。

化合物13：無色針狀晶體(甲醇)。HR-ESI-MSm/z：193.049 1[M+H]+，分子式C10H8O4。1H-NMR (600 MHz，CDCl3)δ：6.27 (1H，d，J=9.4 Hz，H-3)，7.60 (1H，d，J=9.4 Hz，H-4)，6.92 (1H，s，H-5)，6.85 (1H，s，H-8)，6.14 (1H，s，7-OH)，3.96 (3H，s，H-11)；13C-NMR (150 MHz，CDCl3)δ：161.6 (C-2)，113.6 (C-3)，143.4 (C-4)，149.8 (C-6)，103.3 (C-5)，150.4 (C-7)，107.6 (C-8)，144.1 (C-9)，111.6 (C-10)，56.6 (C-11)。以上數據與文獻[22]基本一致，故鑒定為東莨菪素。

4 討論

目前，對山蠟梅化學成分的研究，主要集中在揮發(fā)油、黃酮、生物堿、倍半萜類等，而對簡單的酚性成分研究報道較少，有研究表明，酚類化合物具有抗菌、抗癌及抗病毒等多種特性[23]。本研究從山蠟葉中分離得到了13個酚性化合物，以期豐富山蠟梅的物質基礎,為其進一步藥理活性研究提供參考，并為山蠟梅植物資源的深入開發(fā)利用奠定基礎。