美洲大蠊化學(xué)成分及其抗氧化活性

郭家丞，羅 禹，牛 紅，張 丹，雷 輝

(西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000)

美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.，俗稱蟑螂，作為傳統(tǒng)中藥,其在我國(guó)各地都有廣泛分布[1]。現(xiàn)代研究表明，美洲大蠊體內(nèi)含有油脂、多肽、氨基酸、蛋白質(zhì)等多種活性成分，能有效促進(jìn)組織修復(fù)、抗腫瘤、抗菌、增強(qiáng)免疫等作用[2-3]。雖然以美洲大蠊為原料開(kāi)發(fā)新藥已廣泛用于臨床[4]，但是其活性成分及其作用機(jī)制并不清楚。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用好美洲大蠊中藥資源，為其臨床應(yīng)用和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)，本研究前期對(duì)美洲大蠊的粗提物進(jìn)行抗氧化活性篩選，研究發(fā)現(xiàn)粗提物顯示較好抗氧化活性。為了明確抗氧化活性成分，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用現(xiàn)代色譜手段，對(duì)美洲大蠊95%乙醇提取物中進(jìn)行分離純化，共分離得到14個(gè)化合物，化合物1～6、10～14為首次從該屬植物中分離得到?；衔?、13～14具有抗氧化活性。

1 材料

AV 400 MHZ核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司)；BSZ-100收集儀(上海嘉鵬科技有限公司)；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)；ZF-20D暗箱式紫外分光儀(上海寶山顧村電光儀器廠)；LC51半制備高效液相色譜儀(賽普銳思北京科技有限公司)；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)儀器(鄭州科工貿(mào)有限公司)；Sephadex-LH-20(美國(guó)Phamacia 公司)；SW-CJ-2D雙人凈化工作臺(tái)(浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司)；硅膠(100～200、300～400目，安徽良臣硅源材料有限公司)；UV-1200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)。DPPH·(1,1-二苯基-2-苦基肼自由基，德國(guó)默克公司)；抗壞血酸(Vc，上海源葉生物科技有限公司)；槲皮素 (陜西森弗生物技術(shù)有限公司)；有機(jī)試劑均為分析純(成都科龍化工試劑廠)。

美洲大蠊于2017 年10月購(gòu)買于四川好醫(yī)生藥業(yè)有限公司，由西南醫(yī)科大學(xué)稅丕先教授鑒定為正品。該實(shí)驗(yàn)藥材(SWMU-5)保存于西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

美洲大蠊(15 kg)，粉碎，采用95% 乙醇冷浸提取，每次2 d，4次，合并提取液并減壓回收溶劑得浸膏960 g。浸膏用適量熱水混懸后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液減壓濃縮得到乙酸乙酯部位164 g。

取乙酸乙酯部位164 g進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(100∶0～0∶100)梯度洗脫，通過(guò)薄層色譜(TLC)檢測(cè)方法，合并得到9個(gè)流分(Fr.1～Fr.9)，F(xiàn)r.2經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯 (20∶1)洗脫得到4組分(Fr.2.1～Fr.2.4)，其中Fr.2.2經(jīng)Sephadex LH-20，用甲醇洗脫，得2個(gè)組分，F(xiàn)r.2.2.2再經(jīng)常壓ODS柱層析，以80%甲醇洗脫，得化合物1(3.0 mg)、5(8 mg)、6(3.0 mg)。Fr.3經(jīng)Sephadex LH-20，以甲醇洗脫，得到3個(gè)組分(Fr.3.1-Fr.3.3)，F(xiàn)r.3.2再經(jīng)二氯甲烷-丙酮(30∶1)柱層析，得化合物4(6.0 mg)。Fr.3.3經(jīng)ODS柱層析，以60%甲醇洗脫，得化合物3(5 mg)。Fr.3.4經(jīng)PTLC薄層層析二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脫，得化合物2(3.0 mg)。Fr.4經(jīng)硅膠柱，二氯甲烷-甲醇(30∶1～8∶1)洗脫得5組分(Fr.4.1～Fr.4.5)，F(xiàn)r.4.3經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇洗脫)，得到3個(gè)組分(Fr.4.3.1～Fr.4.3.3)，F(xiàn)r.4.3.2經(jīng)PTLC薄層層析二氯甲烷-丙酮(5∶1)洗脫，得化合物8(6.0 mg)、10(3.0 mg)。Fr.4.3.3經(jīng)ODS柱層析，以60%甲醇洗脫，得化合物7(3 mg)、9(5 mg)。Fr.5經(jīng)Sephadex LH-20，以甲醇洗脫，得2組分(Fr.5.1～Fr.5.2)，F(xiàn)r.5.2通過(guò)半制備HPLC (55%甲醇-水)純化，得化合物11(9.0 mg)、12(3.0 mg)。Fr.6經(jīng)PTLC薄層層析石油醚-丙酮(3∶1)洗脫，得化合物13(4.0 mg)、14(7.0 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色固體，ESI-MSm/z：203.1[M+Na]+。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.04 (2H,d,J=8.0 Hz,H-2,6),6.71 (2H,d,J=8.0 Hz,H-3,5),4.19 (2H,t,J=7.1 Hz,H-8),2.81 (2H,t,J=7.1 Hz,H-7),1.99 (3H,s,H-10);13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ：171.5 (C-1),129.5 (C-2),114.8 (C-3),155.8 (C-4),114.8 (C-5),129.5 (C-6),33.8 (C-7),65.2 (C-8),19.4 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致，故鑒定為4-羥基苯乙基乙酸酯。

化合物2:白色粉末，ESI-MSm/z：223.1[M+H]+。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：7.59 (1H,d,J=14.8 Hz,H-7),7.18 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2),7.07 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6)，6.80 (1H,d,J=6.0 Hz,H-5),6.35 (1H,d,J=14.8 Hz,H-8)，4.21 (2H,q,J=6.0 Hz,H-1′),3.88 (1H,s,3-OCH3),1.30 (3H,t,J=6.0 Hz,H-2′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ：169.3 (C-9),149.4 (C-4),146.7 (C-3),142.2 (C-7),127.7 (C-1),124.1 (C-6),116.5 (C-5),115.6 (C-2),111.6 (C-8),61.4 (C-1′),56.4 (3-OCH3),14.6 (C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致，故鑒定為阿魏酸乙酯。

化合物3:黃色晶體，ESI-MSm/z：203.1[M+Na]+。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：7.58 (1H,dd,J=8.3,2.0 Hz,H-6′),7.53 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.85 (1H,d,J=8.3 Hz,H-5′),3.95 (3H,s,3′-OCH3)，3.94 (3H,s,4′-OCH3)，2.57 (3H,s,H-2)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ：196.8 (C-1),153.3 (C-3′),149.0 (C-4′),130.5 (C-1′),123.3 (C-6′),110.1 (C-5′),109.9 (C-2′),56.1 (3′-OCH3),56.0 (4′-OCH3),26.2 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致，故鑒定為3,4-二甲氧基苯乙酮。

化合物4:無(wú)定型粉末，ESI-MSm/z：233.1[M+Na]+。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：7.08 (2H,d,J=8.0 Hz，H-3′,5′),6.75 (2H,d,J=8.0 Hz，H-2′,6′),4.39 (1H,dd,J=6.5,4.5 Hz，H-2),4.20 (2H,q,J=7.0 Hz，-OCH2CH3),3.05 (1H,dd,J=14.1,4.5 Hz，H-3a),2.89 (1H,dd,J=14.1,6.5 Hz，H-3b),2.07 (1H,d,J=6.5 Hz，-OH),1.29 (3H,t,J=7.0 Hz，-OCH2CH3);13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ：174.3 (C-1),154.6 (C-4′),130.7 (C-2′,6′),128.3 (C-1′),115.3 (C-3′,5′),71.3 (C-2),61.8(-OCH2CH3),39.6(C-3),14.2(-OCH2CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為ethylp-hydroxyphenyllactate。

化合物5:黃色粉末，ESI-MSm/z：251.1[M+Na]+。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：4.63 (2H,m,H-1),3.88 (1H,dq,J=6.6,2.7 Hz,H-3),2.61 (1H,d,J=6.9,2.7 Hz,H-4),2.09 (3H,s,H-14),2.08 (3H,s,H-13),1.21 (3H,J=6.9,H-11),1.20 (3H,J=6.6,H-12);13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ：59.3 (C-1),74.6 (C-3),34.9 (C-4),114.5 (C-5),151.9 (C-6),110.0 (C-7),148.1 (C-8),112.9 (C-9),133.4 (C-10),19.6 (C-11),16.8 (C-12),7.73 (C-13),9.7 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，故鑒定為 (3R,4S)-6,8-dihydroxy-3,4,5,7-tetramethylisochroman。

化合物6:無(wú)色針狀結(jié)晶，ESI-MSm/z：231.1[M+Na]+。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：6.07 (1H,s,H-6′),3.95 (1H,q,J=6.8 Hz,H-3),2.15 (3H,s,H-1),2.05 (3H,s,CH3-4′),1.97 (3H,s,CH3-2′),1.23 (3H,d,J=6.8 Hz,H-4);13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ：26.9 (C-1),210.8 (C-2),49.5 (C-3),15.5 (C-4),136.9 (C-1′),114.0 (C-2′),154.0 (C-3′),110.2 (C-4′),153.6 (C-5′),105.0 (C-6′),10.3 (CH3-2′),7.5 (CH3-4′)。上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為(S)-3-(3′,5′-dihydroxy-2′,4′-methylphenyl)butan-2-one.

化合物7：無(wú)色粉末，ESI-MSm/z：391.3[M+H]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ：7.62 (dd,J=5.7,3.3 Hz,H-3″,6″),7.44 (dd,J=5.7,3.3 Hz,H-4″,5″),4.14 (t,J=6.0 Hz,H-1,1′),1.66～1.57 (m,H-2,2′),1.36～1.29 (m,H-7,7′),0.85 (t,J=5.7 Hz,H-8,8),0.81 (t,J=5.7 Hz,H-6,6’);13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ：166.7 (C=O),131.4 (C-1″,2″),129.9 (C-4″,5″),127.8 (C-3″,6″),67.1 (C-1,1′),37.7 (C-2,2′),29.3(C-3,3′),27.8(C-4,4′),22.7 (C-7,7′),22.0 (C-5,5′),13.0 (C-8,8′),9.9 (C-6,6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故鑒定為bis (2-ethylhexyl)benzene-1,2-dicarboxylate。

化合物8：棕黃色膏狀物，ESI-MSm/z：127.0[M+H]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ：9.45 (1H,s),7.16 (1H,d,J=3.4 Hz,H-3),6.44 (1H,d,J=3.4 Hz,H-4),4.61 (2H,s);13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ：176.9 (C-1),151.1 (C-2),109.0 (C-3),122.7 (C-4),160.1 (C-5),56.3 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定為5-羥甲基糠醛。

化合物9：無(wú)色油狀物，ESI-MSm/z：239.2[M+H]-。1H-NMR (CD3OD,400 MHz)δ：3.47 (2H,m,H-1),2.81 (2H,m,H-2),2.09 (4H,m,H-3,5),2.27 (2H,m,H-4),1.61 (2H,m,H-6),5.34 (1H,m,H-7),5.36 (1H,m,H-8),2.26 (2H,m,H-9),5.37 (1H,m,H-10),5.35 (1H,m,H-11),1.38～1.45 (8H,m,H-12,13,14,15),0.88 (3H,t,7.0)；13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ：71.9 (C-1),29.5 (C-2),25.0 (C-3),29.2 (C-4),28.8 (C-5),28.8 (C-6),129.0 (C-7),127.5 (C-8),36.3 (C-9),127.8 (C-10),129.4 (C-11),28.7 (C-12),26.6 (C-13),24.7 (C-14),23.0 (C-15),8.8 (C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定為 (E,E)-hexadeca-7,10-dien-1-ol。

化合物10：無(wú)色油狀物，ESI-MSm/z：223.1[M-H]-。1H-NMR (CD3OD,400 MHz)δ：5.38 (4H,m,H-5,6,8,9),2.80 (2H,t,J=6.0 Hz,H-7),2.39 (2H,t,J=7.0 Hz,H-2),1.68 (2H,m,H-3),2.14 (2H,q,J=6.9 Hz,H-4),2.08 (2H,q,J=6.9 Hz,H-10),1.33 (6H,m,H-11,12,13),0.91,3H,t,J=6.9 Hz)；13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ：175.9 (C-1),31.2 (C-2),24.5 (C-3),26.1 (C-4),127.4 (C-5),128.7 (C-6),32.8 (C-7),129.6 (C-8),128.3 (C-9),26.7 (C-10),25.0 (C-11),29.0 (C-12),22.2 (C-13),12.9 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定為(Z,Z)-5,8-tetradecadienoic acid.

化合物11：無(wú)色油狀物，ESI-MSm/z：221.2[M-H]-。1H-NMR (CD3OD,400 MHz)δ：5.29～5.44 (6H,m,H-5,6,8,9,11,12),2.81 (2H,t,J=6.0 Hz,H-7),2.38 (2H,t,J=7.5 Hz,H-2),1.74 (2H,m,H-3),2.14 (2H,m,H-4),2.09 (2H,m,H-13),0.98 (3H,t,J=7.5 Hz)；13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δC179.8 (C-1),33.3 (C-2),20.4 (C-3),26.3 (C-4),131.9 (C-5),127.8 (C-6),25.5 (C-7),129.0 (C-8),128.6 (C-9),25.4 (C-10),126.9 (C-11),128.4 (C-12),24.4 (C-13),14.2 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定為(Z,Z,Z)-5,8,11-tetradecatrienoic acid。

化合物12：無(wú)色油狀物，ESI-MSm/z：179.1[M+H-H2O]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ：5.60 (2H,m,H-3,4),5.42 (1H,m,H-6),5.32 (1H,m,H-7),3.19 (2H,d,J=6.0 Hz,H-2),2.81 (2H,t,J=7.0 Hz,H-5),2.06 (2H,m,H-8),1.28～1.36 (6H,m,H-9,10,11),0.90 (3H,t,J=7.0 Hz,H-12)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ：177.1 (C-1),32.4 (C-2),120.2 (C-3),132.2 (C-4),31.4 (C-5),131.0 (C-6),126.5 (C-7),29.2 (C-8),25.7 (C-9),27.2 (C-10),22.5 (C-11),14.0 (C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定為(Z,Z)-3,6-dodecadienoic acid。

化合物13：無(wú)色粉末。ESI-MSm/z：357.3[M+H]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ：5.35 (2H,m),4.17 (2H,m),3.94 (1H,m),3.71 (2H,m),3.61 (1H,m),2.36 (2H,t,J=6.7 Hz),2.03 (2H,m),1.65 (4H,m),1.27 (20H,m),0.88 (3H,t,J=6.0 Hz)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ:14.2 (C-18),22.7 (C-17),31.9 (C-16),29.2 (C-15),29.8 (C-14),29.9 (C-13),27.2 (C-12),29.6 (C-11),129.7 (C-10),130.0 (C-9),34.2 (C-8),24.9 (C-7),29.6 (C-6),29.5 (C-5),29.3 (C-4),29.8 (C-3),31.9 (C-2),174.4 (C-1),65.2 (C-1′),70.3 (C-2′),63.3 (C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]基本一致，故鑒定為(E)-2′,3′-dihydroxypropyloctadec-9-enoate。

化合物14：無(wú)色油狀，ESI-MSm/z：353.3[M+H]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ：5.33～5.40 (6H,m,H-9,10,12,13,15,16),4.30 (1H,dd,J=12.3,4.6 Hz,H-1a′),4.17 (1H,dd,J=12.3,6.3 Hz,H-1b′),3.95 (1H,m,H-2′),3.70 (1H,dd,J=12.3,4.3 Hz,H-3a′),3.62 (1H,dd,J=12.3,6.3 Hz,H-3b′),2.77 (4H,m,H-11,14),2.35 (1H,m,H-2),2.06 (4H,m,H-8,17),1.63 (2H,m,H-3),1.25～1.31 (8H,brs,H-4,5,6,7),0.88 (3H,t,J=6.0 Hz,H-18);13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ：174.4 (C-1),34.2 (C-2),24.9 (C-3),29.2 (C-4),29.3 (C-5),31.9 (C-6),29.8 (C-7),27.2 (C-8),127.9 (C-9),130.0 (C-10),25.6 (C-11),130.0 (C-12),128.1 (C-13),27.2 (C-14),129.7 (C-15),130.2 (C-16),22.6 (C-17),14.1 (C-18),65.1 (C-1′),70.3 (C-2′),63.4 (C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]基本一致，故鑒定為1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoate)glycerol。

4 抗氧化活性篩選

參照文獻(xiàn)[5]的方法，在517 nm 處測(cè)定樣品及陽(yáng)性對(duì)照的吸光度。同樣采用2倍稀釋法配制溶液，重復(fù)操作3 次，取平均值。計(jì)算DPPH·自由基清除率，并進(jìn)一步計(jì)算其自由基清除率IC50值。以抗壞血酸和槲皮素作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH·自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0] ×100%，式中，A0為空白對(duì)照組的吸光度，A1為加入樣品液所測(cè)得的吸光度，A2為用同體積無(wú)水乙醇代替DPPH·乙醇溶液所測(cè)得的吸光度。

本實(shí)驗(yàn)從美洲大蠊提取物中分離得到14個(gè)單體化合物。其中單體化合物1～6,10～14為首次從該提取物中分離得到，化合物4、13～14具有抗氧化活性，其IC50分別為(9.6±0.24)、(23.2±0.36)、(20.4±1.47)μg /mL，其他化合物并沒(méi)有顯示抗氧化活性。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)美洲大蠊化學(xué)成分研究相對(duì)較少，以期本研究在豐富美洲大蠊化學(xué)成分多樣性同時(shí)，為今后美洲大蠊在臨床應(yīng)用及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。