乳腺癌驅(qū)動(dòng)基因及其精準(zhǔn)治療研究進(jìn)展

王 圓，徐方名，許俊德，孫 燁，陳文星，2，陸 茵，2，吳媛媛

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的2020年癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌226萬例，超過肺癌，成為全球第一大癌。雖然乳腺癌診治方面已經(jīng)不斷的改進(jìn)，但是對(duì)于晚期乳腺癌患者，目前治療方案并不理想。惡性腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特點(diǎn)就是在腫瘤組織中，由于基因組的不穩(wěn)定性，出現(xiàn)了具有不同生物特性的變異細(xì)胞群體，這些不同的細(xì)胞群體對(duì)治療的敏感程度不同。所以未來理想的治療方案，需要針對(duì)乳腺癌不同發(fā)展階段的基因組信息進(jìn)行個(gè)性化的靶向治療。

1 驅(qū)動(dòng)突變的定義與識(shí)別方法

1.1 驅(qū)動(dòng)突變的類型腫瘤是由基因突變驅(qū)動(dòng)的復(fù)雜疾病，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，揭示出數(shù)目龐大的體細(xì)胞突變[1]。當(dāng)突變以極小的概率發(fā)生在關(guān)鍵基因上時(shí)，將導(dǎo)致克隆擴(kuò)增，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這些主要負(fù)責(zé)形成克隆擴(kuò)增的基因突變被稱為“驅(qū)動(dòng)突變”，賦予了腫瘤細(xì)胞生長優(yōu)勢(shì)和生存能力。獲得優(yōu)勢(shì)等位基因突變的細(xì)胞能夠承載基因組中其他基因的突變，這些其他突變不影響腫瘤細(xì)胞的表型，且與腫瘤進(jìn)展無關(guān)，被稱為“乘客突變”[2]。

在腫瘤中檢測(cè)到的突變主要包括單核苷酸變異(single-nucleotide variants，SNVs)和拷貝數(shù)變異(copy number alterations，CNVs)，SNVs和CNVs是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要特征，會(huì)引起基因表達(dá)差異，并最終導(dǎo)致表型的改變[3]。較為有趣的現(xiàn)象是，這兩種變異在同一腫瘤樣本中的存在是相互排斥的[4]。

腎透明細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、急性髓系白血病和結(jié)腸癌多為單核苷酸變異[5]?？截悢?shù)變異在腫瘤驅(qū)動(dòng)基因上發(fā)生的頻率最高，是最有可能提供適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)的變異[1, 6]。卵巢漿液性癌和乳腺癌尤其是三陰性乳腺癌中發(fā)生的多為拷貝數(shù)變異[7]。對(duì)于拷貝數(shù)增加的致癌驅(qū)動(dòng)基因，已有相關(guān)潛在藥物靶點(diǎn)的研究[1]。此外，染色體結(jié)構(gòu)變異也是驅(qū)動(dòng)突變的一種，染色體易位和倒位由于染色體片段斷裂，導(dǎo)致片段所在位置發(fā)生改變，驅(qū)動(dòng)了20%左右的癌癥發(fā)展[5]。

1.2 驅(qū)動(dòng)基因的識(shí)別方法驅(qū)動(dòng)突變所在的基因?yàn)轵?qū)動(dòng)基因，每種癌癥類型平均只有2-6個(gè)基因被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)基因，這說明在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中驅(qū)動(dòng)突變的數(shù)量極少，乘客突變的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過驅(qū)動(dòng)突變[8]。Kandoth等[8]分析了包括乳腺癌在內(nèi)的12種癌癥突變信息，總共篩選出617 354個(gè)體細(xì)胞突變，其中有398 750個(gè)為錯(cuò)義突變，15 141個(gè)插入缺失，表明癌癥研究面臨的挑戰(zhàn)之一在于識(shí)別驅(qū)動(dòng)基因。

研究基因功能的實(shí)驗(yàn)方法，包括利用基因敲除或基因過表達(dá)等正反向遺傳學(xué)操作技術(shù)。這些方法對(duì)于闡明單個(gè)突變基因的功能極其有用，但是在分析來自大規(guī)模癌癥基因組的海量候選基因時(shí)，存在局限性。針對(duì)此問題，研究人員開發(fā)出了一套固定流程和算法工具，大大提高了篩選驅(qū)動(dòng)基因的效率與精確程度。

鑒別和發(fā)現(xiàn)癌癥驅(qū)動(dòng)基因主要包括6個(gè)流程：數(shù)據(jù)篩選,除去因測(cè)序和樣本導(dǎo)致的誤差；工具鑒別，使用多種工具區(qū)分乘客突變和驅(qū)動(dòng)突變；離群值調(diào)整，減少因突變異質(zhì)性導(dǎo)致的可信度低的結(jié)果；手動(dòng)篩選，去除假陽性結(jié)果；下游分析，對(duì)基因表達(dá)、蛋白結(jié)構(gòu)和臨床相關(guān)特征進(jìn)一步的挖掘與分析；功能驗(yàn)證，使用一些實(shí)驗(yàn)手段對(duì)篩選出來的基因進(jìn)行功能學(xué)驗(yàn)證[9]。其中，區(qū)分乘客突變與驅(qū)動(dòng)突變的工具可以分為基于突變頻率、功能影響、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)通路和數(shù)據(jù)整合這五大類，例如MutsigCV、OncodriveFM、MSEA、DriverNet 和DriverNet等計(jì)算工具[10-11]。

2 驅(qū)動(dòng)基因與腫瘤異質(zhì)性

腫瘤并非由單一細(xì)胞群組成，而是會(huì)隨著時(shí)間逐漸演化出不同的腫瘤亞群，表現(xiàn)出異質(zhì)性[12]，這種異質(zhì)性還可被分為瘤內(nèi)異質(zhì)和瘤間異質(zhì)。1976年，Nowell[13]開創(chuàng)性地提出了腫瘤細(xì)胞群進(jìn)化假說，認(rèn)為腫瘤基因組的不穩(wěn)定性會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生進(jìn)化。在各種內(nèi)源性和外源性因素的驅(qū)動(dòng)下，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生突變，在基因組水平、轉(zhuǎn)錄組水平、表觀遺傳或表型方面表現(xiàn)出差異[14]。

在腫瘤發(fā)展過程中，基因組的不穩(wěn)定性導(dǎo)致體細(xì)胞不斷產(chǎn)生突變，雖然大部分突變不參與腫瘤細(xì)胞的選擇過程，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展影響較小，但是會(huì)存在小部分驅(qū)動(dòng)型突變，促使腫瘤細(xì)胞群發(fā)生進(jìn)化。由于異質(zhì)性的存在，同一腫瘤在不同的患者身上發(fā)生的驅(qū)動(dòng)突變不盡相同，甚至同一腫瘤內(nèi)并非每個(gè)癌細(xì)胞都存在相同的驅(qū)動(dòng)突變[15]，導(dǎo)致患者對(duì)治療的敏感性不同，大大增加了治療的難度[16]。所以找到能夠驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)化的突變，對(duì)于理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展和促進(jìn)更有效的個(gè)性化醫(yī)療有著重要意義。

3 乳腺癌驅(qū)動(dòng)基因

Stephens等[17]對(duì)100例原發(fā)性乳腺癌患者進(jìn)行外顯子測(cè)序，使用CaVEMan和Pindel算法根據(jù)單核苷酸突變和拷貝數(shù)變異水平，鑒定出了包括AKT1，BRCA1，CDH1，PTEN和TP53等常見驅(qū)動(dòng)基因，此外還發(fā)現(xiàn)了MAP3K1，MAP3K13，AKT2和NCOR1等新的乳腺癌驅(qū)動(dòng)基因。研究人員從The cancer genome atlas(TCGA)和Metabric數(shù)據(jù)庫中的222個(gè)三陰性乳腺癌樣本中，收集了拷貝數(shù)和mRNA相關(guān)信息，使用ADMIRE算法篩選出138個(gè)候選驅(qū)動(dòng)基因，包括已知的MYC、EGFR基因以及新鑒定出的ASAP1、IRF2BP2和CCT5基因，其中CCT5是三陰性乳腺癌細(xì)胞中促進(jìn)增殖的驅(qū)動(dòng)基因[18]。

轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是乳腺癌患者死亡的主要原因。Bertucci等[19]對(duì)超過600個(gè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌樣本測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出TP53、ESR1、GATA3、KMT2C、NCOR1、AKT1、NF1、RIC8A和RB1共9個(gè)驅(qū)動(dòng)基因。與三陰性乳腺癌早期階段相比，三陰性乳腺癌在轉(zhuǎn)移后表現(xiàn)出更高頻率的體細(xì)胞等位基因功能缺失突變，也就是說乳腺癌轉(zhuǎn)移后具有更高的突變負(fù)荷和克隆多樣性，這表明患者越早接受治療才越有可能獲得較好的預(yù)后，并且不同時(shí)期的乳腺癌患者需要有更個(gè)性化的靶向治療手段，不能一概而論。Yates等[20]收集了包括原發(fā)灶，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和治療后局部復(fù)發(fā)在內(nèi)的3種時(shí)期的樣本，對(duì)此進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，繪制出了乳腺癌從原發(fā)部位到遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移這一過程中的驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)化樹，結(jié)果表明原發(fā)部位的驅(qū)動(dòng)突變與復(fù)發(fā)部位具有一致性，也能夠很好的代表轉(zhuǎn)移初期的基因組特征。但是在對(duì)163位患者轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行外顯子測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，基因組的轉(zhuǎn)移克隆初期可能類似于原發(fā)腫瘤，一旦進(jìn)入轉(zhuǎn)移晚期，將會(huì)發(fā)生復(fù)雜的基因組突變，轉(zhuǎn)移灶部位的基因圖譜與原發(fā)腫瘤差異顯著。

此外，研究人員發(fā)現(xiàn)在乳腺癌的不同發(fā)展階段，驅(qū)動(dòng)突變的類型并不是一成不變的。乳腺癌進(jìn)化早期，CpG二核苷酸上的胞嘧啶向胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)換具有較高的突變頻率，是主要驅(qū)動(dòng)突變，可能是因?yàn)檫@一特征在整個(gè)生命周期相對(duì)穩(wěn)定，并在在乳腺癌發(fā)展后期被其他突變信號(hào)所覆蓋。APOBEC是人體內(nèi)具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質(zhì)，由于APOBEC酶活性的突變，導(dǎo)致TpC區(qū)域下胞嘧啶向胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)換或鳥嘌呤的顛換發(fā)生時(shí)間極其不穩(wěn)定，不僅會(huì)在早期發(fā)生或者晚期發(fā)生，甚至不發(fā)生突變。

4 乳腺癌靶向治療的發(fā)展及其面臨的挑戰(zhàn)

精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的概念是指在了解患者腫瘤基因組信息后，以此為依據(jù)來指導(dǎo)臨床靶向治療，目前市面上已經(jīng)有了針對(duì)乳腺癌驅(qū)動(dòng)基因的靶向藥物，其中包括靶向HER2陽性的曲妥珠單抗，通過靶向抑制PARP途徑來阻斷BRCA突變的奧拉帕尼，靶向CDK4/6的帕博西林，靶向Her1/2的拉帕替尼和尚處于臨床Ⅱ期的PIK3CA靶向抑制劑Alpelisib等眾多靶向藥物。此外，還有很多潛在的乳腺癌治療靶點(diǎn)，例如SIRT5、P2X7和TENM4等，為乳腺癌治療提供了新的策略[21-23]。

原發(fā)性乳腺癌患者中，全身治療旨在殺死從胸部擴(kuò)散的微小腫瘤病灶，因?yàn)槭中g(shù)和放療一般都會(huì)治愈原發(fā)病灶。盡管轉(zhuǎn)移克隆的基因組在最開始時(shí)可能與原發(fā)性腫瘤相似，但是當(dāng)其轉(zhuǎn)移到臨床可檢測(cè)時(shí)，已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)生了大量的基因組變化。所以目前關(guān)于腫瘤的精準(zhǔn)治療還存在許多問題：

首先，是否應(yīng)該對(duì)存在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行活檢來決定干預(yù)措施尚且存在爭議。因?yàn)樵S多轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的取樣具有一定的挑戰(zhàn)，甚至有促進(jìn)侵襲的可能性，轉(zhuǎn)移灶在定殖后進(jìn)一步發(fā)生進(jìn)化，從而獲得許多新的體細(xì)胞突變和關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因突變。這表明腫瘤驅(qū)動(dòng)因素可以在腫瘤進(jìn)化過程中的任何時(shí)期發(fā)生突變，包括起始、惡化、轉(zhuǎn)移和對(duì)治療產(chǎn)生耐藥期間，通過這些突變來實(shí)現(xiàn)增殖、侵襲或者產(chǎn)生免疫逃逸等功能，所以腫瘤驅(qū)動(dòng)者的角色是會(huì)隨著時(shí)間和部位的變化而改變。在腫瘤發(fā)生過程的一個(gè)階段是驅(qū)動(dòng)基因，在另一個(gè)階段則可能不發(fā)揮作用[24]。所以理想情況下的臨床試驗(yàn)中，應(yīng)該能夠?qū)崟r(shí)頻繁的監(jiān)測(cè)響應(yīng)治療過程中腫瘤進(jìn)化所產(chǎn)生的分子變化，這將需要收集原發(fā)部位、轉(zhuǎn)移部位的樣本或者血液樣本中的核酸或者細(xì)胞。已有研究表明，大部分轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者愿意對(duì)復(fù)發(fā)性病變進(jìn)行活檢以進(jìn)行分子譜圖分析[25]，這也就為未來的精準(zhǔn)靶向治療提供了可能性。

其次，目前的藥物往往缺乏高活性和特異性。例如，大約25%的乳腺癌患者發(fā)生PIK3CA突變，該突變被認(rèn)為是乳腺癌的驅(qū)動(dòng)因素[26]。但是在早期臨床試驗(yàn)中，使用非選擇性PI3K抑制劑只有4%的應(yīng)答率[24]。第二代α-選擇性PI3K抑制劑在動(dòng)物模型中更具特異性，并且能產(chǎn)生更好的體內(nèi)抑制作用，然而事實(shí)表明，PIK3CA突變型乳腺癌患者對(duì)新型抑制劑對(duì)應(yīng)答率只有6%，并且在PIK3CA野生型腫瘤患者中尚未觀察到任何反應(yīng)。因此，開發(fā)出更高效并且具有更高生物活性的靶向藥物是至關(guān)重要的。

5 總結(jié)與展望

對(duì)于乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，當(dāng)前的全身治療主要包括激素療法、細(xì)胞毒化療和數(shù)量有限的靶向制劑，例如HER2抑制劑、激素受體陽性腫瘤使用的mTOR抑制劑[27]。目前，除了HER2靶向制劑外，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中尚未證明基于分子圖譜檢測(cè)的靶向治療優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)算法，尚無證據(jù)表明它可以改善患者的預(yù)后。因此，與傳統(tǒng)方法相比，設(shè)計(jì)治療性臨床試驗(yàn)來評(píng)估靶標(biāo)-藥物匹配程度被認(rèn)為是具有研究意義的。

此外，由于腫瘤的異質(zhì)性，如果瘤內(nèi)存在兩個(gè)關(guān)鍵的克隆，其中一個(gè)由PIK3CA突變所驅(qū)動(dòng)，另一個(gè)則是FGFR1擴(kuò)增驅(qū)動(dòng)，那么最適的治療方案可能就是同時(shí)使用PI3K和FGFR1抑制劑的聯(lián)合治療。在這種情況下，獲得臨床實(shí)驗(yàn)批準(zhǔn)將會(huì)受到限制。通常情況下，結(jié)合兩種或多種藥物以產(chǎn)生足夠的靶點(diǎn)調(diào)節(jié)作用，同時(shí)毒性可耐受的最佳方法是無法確定的，并且需要進(jìn)行劑量研究。即使最后確定了適當(dāng)?shù)乃幬锫?lián)合方案并可以有效抑制克隆進(jìn)化，改善或延遲了耐藥性的發(fā)作，最終仍可能會(huì)出現(xiàn)新的驅(qū)動(dòng)克隆。除了ER、ERBB2、PIK3CA和AKT1外，乳腺癌領(lǐng)域最大的問題是缺乏特征明確的驅(qū)動(dòng)因素。所以重要的是要更深入地研究不穩(wěn)定性發(fā)生率與亞克隆結(jié)構(gòu)復(fù)雜性之間的關(guān)系，以及某些形式的基因組不穩(wěn)定性是否與更大程度的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性有關(guān)。迫切需要了解驅(qū)動(dòng)基因組不穩(wěn)定的機(jī)制，以便可以開發(fā)出抑制腫瘤多樣性、適應(yīng)性和耐藥性的治療方法。

乳腺癌在轉(zhuǎn)移過程中伴隨著大量突變從而導(dǎo)致患者之間的基因組圖譜差異很大，甚至比原發(fā)性乳腺癌中復(fù)雜的突變水平還要明顯。繪制這種復(fù)雜性進(jìn)化圖譜需要招募大量乳腺癌轉(zhuǎn)移的患者，并整合轉(zhuǎn)錄組，表觀基因組學(xué)和臨床研究數(shù)據(jù)，這是未來精準(zhǔn)治療需要面臨的問題。一旦問題被解決，將會(huì)極大的推動(dòng)臨床治療，從而提供有關(guān)克隆進(jìn)化模式，治療失敗機(jī)制以及代表新治療靶點(diǎn)途徑的見解。