基于KDSR基因探究花旗澤仁改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗機(jī)制研究

陳思琦，李佳欣，葛鵬玲

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種多病因的代謝性疾病，其特征是由于胰島素釋放紊亂、胰島素作用失調(diào)或兩者兼而有之造成的慢性高血糖[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)占糖尿病的90%以上，目前認(rèn)為T2DM的主要發(fā)病機(jī)制為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，IR貫穿了2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的全過程[2-3]，同時(shí)也是高血壓、冠心病、動(dòng)脈硬化、肥胖等多種疾病共同聯(lián)系的病理基礎(chǔ)。神經(jīng)酰胺(ceramides，Cer)是鞘脂(sphingolipid，SPL)的重要中間代謝產(chǎn)物，對(duì)鞘脂類的生物合成具有重要意義[4]。近年來研究表明[5]，神經(jīng)酰胺代謝異常參與胰島素抵抗等疾病的病理生理過程，神經(jīng)酰胺可通過抑制Akt 磷酸化從而影響胰島素信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)IR細(xì)胞中KDSR(3-ketodihy-drosphingosine reductase，3-酮二氫鞘氨醇還原酶)基因表達(dá)上調(diào)，且通過調(diào)控神經(jīng)酰胺/PKCζ/Akt/Foxo1信號(hào)通路而引發(fā)IR?；ㄆ鞚扇适侵委?型糖尿病胰島素抵抗療效確切的臨床經(jīng)驗(yàn)方，包括西洋參、澤瀉、薏苡仁三味中藥，本課題組前期已證實(shí)花旗澤仁具有明顯的改善胰島素抵抗的作用，本文以前期研究為基礎(chǔ)，從KDSR基因角度探討花旗澤仁改善IR的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 HepG2細(xì)胞系HepG2人肝癌細(xì)胞株(FH0067)，購(gòu)于上海中醫(yī)藥大學(xué)，保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑西洋參(批號(hào)：120997)、澤瀉(批號(hào)：020001421)和薏苡仁(批號(hào)：17052009)購(gòu)于河北潤(rùn)和醫(yī)藥有限公司，羅格列酮(批號(hào)：122320-73-4)購(gòu)于阿拉丁試劑(上海)有限公司；KDSR過表達(dá)質(zhì)粒由通用生物系統(tǒng)有限公司提供；β-actin由英國(guó)Abcam公司提供；KDSR抗體、PKCζ抗體、p-PKCζ抗體、Akt2抗體、p-Akt2抗體、Foxo1抗體、p-Foxo1抗體由美國(guó)CST公司提供；神經(jīng)酰胺C14(d18 ∶1/14 ∶0)標(biāo)準(zhǔn)品、神經(jīng)酰胺C16(d18 ∶1/16 ∶0)標(biāo)準(zhǔn)品、神經(jīng)酰胺C17標(biāo)準(zhǔn)品、神經(jīng)酰胺C18 ∶1(d18 ∶1/18 ∶1(9Z))標(biāo)準(zhǔn)品、神經(jīng)酰胺C18(d18 ∶1/18 ∶0)標(biāo)準(zhǔn)品、神經(jīng)酰胺C20(d18 ∶1/20 ∶0)標(biāo)準(zhǔn)品、神經(jīng)酰胺C24 ∶1(d18 ∶1/24 ∶1(15Z))標(biāo)準(zhǔn)品、神經(jīng)酰胺C24(d18 ∶1/24 ∶0)標(biāo)準(zhǔn)品由美國(guó)Avanti Polar Lipids公司提供；GOD-POD檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京雷根生物有限公司。

1.3 儀器超凈工作臺(tái)(北京瀘凈凈化設(shè)備廠)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；生物安全柜SCB-1360(北京東聯(lián)儀器制造公司)；電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；紫外分光光度計(jì)(島津有限公司)；半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；酶標(biāo)儀(日本Olympus公司)；IX70倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ISO134083凍干機(jī)(美國(guó)Agilent公司)；安捷倫1290超高效液相色譜(美國(guó)Agilent公司)；安捷倫6460三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(美國(guó)Agilent公司)；正壓裝置(美國(guó)Waters公司)；渦旋儀器(德國(guó)Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)500 mL高糖培養(yǎng)基(DEME)中加入10%胎牛血清(FBS)，以及1%青霉素-鏈霉素混合液，搖勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?192 ℃的液氮罐中取出細(xì)胞，迅速放入37 ℃水浴鍋中快速搖晃復(fù)蘇。加入2 mL混合好的DMEM培養(yǎng)基，以37 ℃，5% CO2的條件培養(yǎng)備用。

2.2 胰島素抵抗模型的建立根據(jù)本課題組前期對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗(IR)模型建立條件的模索，利用高糖高胰島素處理HepG2細(xì)胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生胰島素抵抗。向配制好的高糖培養(yǎng)基中加入10-10mol·L-1胰島素，混勻，培養(yǎng)HepG2細(xì)胞48 h，使其發(fā)展成IR模型，胰島素作用時(shí)間、濃度及模型的穩(wěn)定性在本課題組前期工作中已驗(yàn)證。

2.3 花旗澤仁凍干粉的制備取花旗澤仁各中藥西洋參15 g、澤瀉15 g、薏苡仁30 g，浸泡12 h，第一次加12倍水煎煮，水沸后文火煎煮60 min；第二次加8倍水煎煮，水沸后繼續(xù)用文火煎煮45 min，第三次加6倍水，水沸后文火煎煮30 min，合并三次水煎液，過濾后水浴濃縮至每毫升含生藥量1 g，采用冷凍干燥機(jī)真空冷凍干燥而成。4 ℃保存，使用前水浴加溫至37 ℃。

2.4 花旗澤仁的給藥劑量本課題組前期對(duì)花旗澤仁在HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型上的給藥劑量及作用時(shí)間進(jìn)行摸索，得出花旗澤仁最佳給藥濃度為1/9 g·L-1，作用時(shí)間為24 h。

2.5 陽性對(duì)照藥羅格列酮的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前稱取羅格列酮粉末，加蒸餾水配制成所需濃度0.04 g·L-1的溶液。4 ℃保存，使用前取出，達(dá)到常溫后使用。

2.6 KDSR過表達(dá)質(zhì)粒的合成與轉(zhuǎn)染由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司針對(duì)人KDSR基因，根據(jù)人工構(gòu)建的方式在目的基因上游加入調(diào)控元件，合成特異性KDSR基因過表達(dá)質(zhì)粒(KDSR-OE)，以腺病毒包裹，冷凍保存，同時(shí)制備未包裹過表達(dá)質(zhì)粒的腺病毒(NC)。

2.7 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

2.7.1母液的配置 分別精密稱取神經(jīng)酰胺C14、C16、C17、C18 ∶1、C18、C20、C24 ∶1、C24標(biāo)準(zhǔn)品適量，并用異丙醇定容至1 g·L-1，所有母液均貯存在-20 ℃條件下備用。

2.7.2工作溶液的配制 將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用10%甲醇稀釋得到上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度：C14、C24 ∶1和C24為6.25 mg·L-1；C16和C18 ∶1為 3.125 mg·L-1；C18和C20為12.5 mg·L-1。內(nèi)標(biāo)(C17)由蛋白沉淀劑配置而成，濃度為 100 μg·L-1。

2.7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣本溶液的配制 利用上述工作溶液與0.5×PBS 溶液(模擬基質(zhì))配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液為七個(gè)等級(jí)，各個(gè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍在本課題組前期實(shí)驗(yàn)中已完成測(cè)定。質(zhì)控樣本在分析前新鮮配制，分為低、中、高三個(gè)等級(jí)，每個(gè)等級(jí)分別對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的第2、4、6濃度點(diǎn)。

2.7.4色譜與質(zhì)譜條件 有機(jī)相和水相中同時(shí)加入0.2%的甲酸以保證洗脫系統(tǒng)中pH值恒定。神經(jīng)酰胺C17作為內(nèi)標(biāo)：流動(dòng)相為含有0.2%甲酸的甲醇和0.2%甲酸的水相，流速為0.3 mL·min-1，柱溫設(shè)置在30 ℃。所選質(zhì)譜柱為 waters Xbrige BEH C18(2.1×50 mm,2.5 μm)。分別精密稱取神經(jīng)酰胺C14，C16，C17，C18 ∶1，C18，C20，C24 ∶1，C24標(biāo)準(zhǔn)品適量，并用異丙醇定容至 1 g·L-1，所有母液均貯存在-20 ℃條件下備用。

液相洗脫梯度如Tab 1所示。

Tab 1 Liquid phase conditions of HPLC-MS/MS

采用電噴霧離子化源，干燥氣溫度為350 ℃，鞘流氣溫度為325 ℃，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)待分析化合物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。具體MS參數(shù)如Tab 2所示。

Tab 2 Mass spectrum conditions

2.7.5樣品處理 將研究樣品(100 μL)轉(zhuǎn)移到EP管中。向每個(gè)管中添加蛋白質(zhì)沉淀溶液(400 μL)，蛋白沉淀劑為異丙醇-氯仿(9 ∶1)，渦旋振蕩3 min，以3 000×g離心10 min，然后將250 μL上清液轉(zhuǎn)移到干凈的進(jìn)樣小瓶中，并進(jìn)行LC-MS/MS分析。本研究采用0.5×PBS的作為空白樣品作為對(duì)照，排除基質(zhì)的干擾。

2.7.6方法專屬性 分別配制空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、待測(cè)樣品，同“樣品處理”方法操作后，進(jìn)樣分析，對(duì)比空白溶液、含有混合對(duì)照品的腸菌液和待測(cè)樣品色譜圖。觀察待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的出峰位置。

2.7.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 在本研究中，標(biāo)準(zhǔn)曲線包括7個(gè)水平，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本經(jīng)過樣本前處理方法處理分析后，以待分析化合物的質(zhì)譜相應(yīng)值與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜響應(yīng)值的比值為因變量，以待測(cè)化合物的濃度為自變量進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線在本課題組前期工作中已完成測(cè)定。

2.7.8精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定 取3個(gè)濃度的QC樣本，經(jīng)過樣本前處理后進(jìn)樣分析，并連續(xù)3 d平行配制，進(jìn)樣后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。計(jì)算每日(日內(nèi))和3 d(日間)樣本的測(cè)定結(jié)果精密度，以變異系數(shù)(CV)表示，應(yīng)小于15%；準(zhǔn)確度通過真實(shí)值和標(biāo)示量的差異進(jìn)行計(jì)算，以相對(duì)誤差表示(RE)，應(yīng)小于±15%。

2.7.9提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 配制低、中、高濃度的質(zhì)控樣本，經(jīng)過既定的前處理方法進(jìn)行處理，經(jīng)過進(jìn)樣分析得到待測(cè)化合物的響應(yīng)值為A；取空白0.5×PBS樣本進(jìn)行前處理，加入標(biāo)準(zhǔn)品水溶液制備和QC樣本濃度一致的溶液，進(jìn)樣分析，得到待測(cè)化合物的響應(yīng)值B；取標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，制備和QC樣本濃度相同的溶液，進(jìn)樣分析，得到待測(cè)化合物的響應(yīng)值C，A與B的比值即為提取回收率，B與C的比值為基質(zhì)效應(yīng)。

2.7.10樣品檢測(cè) 分別取各組樣品，按“2.7.5樣品處理”方法制備供試品溶液，依照上述方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄各色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品各成分的含量。

2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR傾倒培養(yǎng)液，加入PBS溶液洗滌細(xì)胞，滴加Trizol溶液反復(fù)吹打，室溫放置5 min；離心取上層清液并轉(zhuǎn)移至離心管，加入氯仿溶液，渦旋振蕩，常溫放置5 min；12 000×g離心15 min。將上層透明水相取出滴加異丙醇混勻，室溫靜置；離心去上清液，加入70%乙醇渦旋混勻，離心棄上清，室溫下干燥10 min；滴入失活水溶解，-80 ℃低溫存放。根據(jù)試劑盒說明書所述步驟進(jìn)行試驗(yàn)。

2.9 蛋白印跡法洗滌細(xì)胞后加入細(xì)胞裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF+10 μL蛋白酶抑制劑+10 μL磷酸酶抑制劑)使細(xì)胞充分裂解；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min；配制分離膠及濃縮膠，用微量進(jìn)樣器加待測(cè)樣品及Maker；以電壓80 V開始電泳；電泳結(jié)束后，取出凝膠放入轉(zhuǎn)膜液中，將準(zhǔn)備好的PVDF膜先放入甲醇中30 s，后轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)膜液中，恒流轉(zhuǎn)膜45-50 min；放入裝有適量的5%牛奶封閉液的平皿中封閉1 h；洗膜3次；分別將一抗，即KDSR抗體、PKCζ抗體、p-PKCζ抗體、Akt2抗體、p-Akt2抗體、Foxo1抗體以及p-Foxo1抗體用TBST稀釋比例為1 ∶1 000，將PVDF膜放入一抗中4 ℃過夜；洗膜3次；將二抗用TBST稀釋比例為1 ∶5 000，將PVDF膜放入二抗中37 ℃，孵育1 h；洗膜3次；顯影拍照。

2.10 葡萄糖檢測(cè)試劑盒配置好GOD-POD工作液，將標(biāo)準(zhǔn)品按梯度依次稀釋到2.5，1.25，0.625，0.3 125，0.15 625 mmol/L。取上述各組處理后的細(xì)胞適量(>106)，離心保留細(xì)胞沉淀，加入200 μL 1% Triton X-100冰上裂解30 min。設(shè)立空白組，標(biāo)準(zhǔn)組和樣品組，統(tǒng)一加入300 μL GOD-POD工作液，空白孔加入dd H2O，標(biāo)準(zhǔn)組分別加入上一步配置好的標(biāo)準(zhǔn)品，樣品組加入需測(cè)定的樣品，充分混勻，37 ℃孵育15 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定505 nm處的吸光度(OD值)，以空白孔調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)組，樣品組的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品組的樣品濃度，再根據(jù)葡萄糖含量換算公式計(jì)算葡萄糖含量。

3 結(jié)果

3.1 花旗澤仁對(duì)KDSR基因及蛋白表達(dá)的影響

3.1.1花旗澤仁可降低KDSR mRNA的高表達(dá) qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 1所示，與對(duì)照組相比，IR細(xì)胞中KDSR mRNA表達(dá)較高，與IR組相比，給予花旗澤仁后IR細(xì)胞中KDSR表達(dá)明顯下降，差異具有顯著性(P<0.01)；于正常HepG2細(xì)胞中過表達(dá)KDSR(KDSR-OE)后給予花旗澤仁，與KDSR-OE組相比，KDSR表達(dá)也存在一定程度的下降，差異具有顯著性(P<0.01)。綜上，花旗澤仁可降低KDSR基因的高表達(dá)。

Fig 1 Effect of Huaqizeren on KDSR mRNA expression

3.1.2花旗澤仁可降低KDSR 蛋白的高表達(dá) 結(jié)果如Fig 2(A、B)所示，與對(duì)照組相比，IR細(xì)胞中KDSR蛋白表達(dá)上調(diào)，與IR組相比，給予花旗澤仁后IR細(xì)胞中KDSR蛋白表達(dá)有所下降，差異具有顯著性(P<0.01)；轉(zhuǎn)染KDSR-OE的正常HepG2細(xì)胞中KDSR蛋白上調(diào)，給予花旗澤仁后KDSR蛋白表達(dá)量有所下降，差異具有顯著性(P<0.01)，故花旗澤仁可降低KDSR蛋白的高表達(dá)。

Fig 2 Effect of Huaqizeren on KDSR protein expression

3.2 花旗澤仁對(duì)細(xì)胞神經(jīng)酰胺含量的影響利用HPLC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)各組神經(jīng)酰胺各單體及總神經(jīng)酰胺含量，結(jié)果如Tab 3、Fig 3所示，與IR組相比，給藥花旗澤仁后細(xì)胞總神經(jīng)酰胺含量明顯下降，且與空白組接近，差異具有顯著性(P<0.01)；而當(dāng)KDSR-OE組給予花旗澤仁后，細(xì)胞神經(jīng)酰胺含量也有一定程度下降，且差異具有顯著性(P<0.01)。故花旗澤仁可降低IR細(xì)胞中神經(jīng)酰胺含量。

Tab 3 Contents of ceramide in different samples(μg·L-1)

Fig 3 Total ceramide content in cells of each group

3.3 花旗澤仁對(duì)神經(jīng)酰胺通路PKCζ/Akt/Foxo1的影響Western blot結(jié)果顯示，如Fig 4、5、6(A、B)所示，與對(duì)照組相比，IR細(xì)胞中PKCζ磷酸化水平上調(diào)、Akt2磷酸化水平下降、Foxo1磷酸化水平上升，差異具有顯著性(P<0.01)；與IR組相比，給藥花旗澤仁后PKCζ磷酸化水平下降、Akt2磷酸化水平上升、Foxo1磷酸化水平下降，差異具有顯著性(P<0.01)；與對(duì)照組相比，正常HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染KDSR-OE后PKCζ磷酸化水平上調(diào)、Akt2磷酸化水平下降、Foxo1磷酸化水平上升，差異具有顯著性(P<0.01)；轉(zhuǎn)染KDSR-OE后給予花旗澤仁，PKCζ磷酸化水平下降、Akt2磷酸化水平上升、Foxo1磷酸化水平下降，差異具有顯著性(P<0.01)。故花旗澤仁可改善IR細(xì)胞中神經(jīng)酰胺通路PKCζ/Akt/Foxo1過度激活的狀態(tài)。

Fig 4 Effect of Huaqizeren on PKC zeta phosphorylation level

Fig 5 Effect of Huaqizeren on AKT2 phosphorylation level

Fig 6 Effect of Huaqizeren on FoxO1 phosphorylation

3.4 花旗澤仁對(duì)細(xì)胞葡萄糖消耗的影響我們采用花旗澤仁濃度為1/9 g·L-1進(jìn)行給藥，并以0.04 g·L-1羅格列酮作為陽性對(duì)照藥，檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖含量。結(jié)果如Fig 7所示，與對(duì)照組相比，IR細(xì)胞中葡萄糖含量明顯升高，差異具有顯著性意義(P<0.01)；與IR組相比，給藥花旗澤仁后IR細(xì)胞葡萄糖含量明顯下降，且與空白組接近，差異具有顯著性意義(P<0.01)；根據(jù)本課題組前期研究所得結(jié)果可知，KDSR-OE可提高細(xì)胞葡萄糖含量至IR程度，而當(dāng)KDSR-OE組給予花旗澤仁后，細(xì)胞葡萄糖含量也有一定程度下降，且差異具有顯著性意義(P<0.01)。故花旗澤仁可在一定程度上降低IR細(xì)胞中葡萄糖含量，改善細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

Fig 7 Effect of Huaqizeren on cell glucose content

4 討論

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病的病理基礎(chǔ)和主要特征，也是高血壓、高脂血癥、冠心病等疾病的主要病因[7]。研究表明[8]，多種中藥及其有效成分通過減弱IR在治療2型糖尿病中發(fā)揮重要作用，已成為近年來防治IR的研究熱點(diǎn)。中藥復(fù)方花旗澤仁為臨床治療2型糖尿病IR的有效經(jīng)驗(yàn)方，其治療病癥明確，藥物療效確切，主要活性成分相對(duì)清楚。本方基于中醫(yī)藥整體觀念和辨證論治的理論，從2型糖尿病IR脾虛濕盛，濕熱內(nèi)蘊(yùn)的病理特點(diǎn)出發(fā)，以補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清火生津之功的西洋參為君藥，滲濕健脾的薏苡仁為臣藥，利水滲濕、泄熱之澤瀉為佐藥，配伍組成花旗澤仁中藥復(fù)方，共奏補(bǔ)氣、健脾、生津、清熱、利濕之功。本課題基于中醫(yī)藥對(duì)IR的防治作用，探討花旗澤仁改善IR的作用機(jī)制。

本課題組前期已進(jìn)行了花旗澤仁的成藥性研究，其中包括確定花旗澤仁(西洋參、澤瀉、薏苡仁)的最佳藥量配比；完成體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的相關(guān)藥效學(xué)指標(biāo)和體外實(shí)驗(yàn)的相關(guān)藥效學(xué)指標(biāo)[9]；確定花旗澤仁藥代動(dòng)力學(xué)特征；明確腸道菌群對(duì)花旗澤仁的影響[10-11]；完成安全性早期評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)；在體內(nèi)研究中我們發(fā)現(xiàn)，花旗澤仁可明顯降低胰島素抵抗大鼠的空腹血糖，使其胰島素敏感性升高；在體外研究中，我們也證實(shí)了花旗澤仁具有改善肝臟、脂肪、骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗的作用[12-14]，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)，花旗澤仁對(duì)IR關(guān)鍵信號(hào)分子Akt的活性具有一定影響，而我們前期篩選的KDSR基因?qū)kt上游信號(hào)分子神經(jīng)酰胺具有一定的調(diào)控作用，并通過神經(jīng)酰胺下游PKCζ/Akt/Foxo1信號(hào)通路參與IR的發(fā)生。本課題組前期研究已證實(shí)，IR細(xì)胞中KDSR基因的表達(dá)水平升高、神經(jīng)酰胺含量明顯提高、神經(jīng)酰胺下游PKCζ/Akt/Foxo1信號(hào)通路活化程度異常，且細(xì)胞中葡萄糖含量較高，而抑制IR細(xì)胞中KDSR基因的表達(dá)可降低神經(jīng)酰胺含量、減少PKCζ/Akt/Foxo1信號(hào)通路表達(dá)異常的狀態(tài)，同時(shí)細(xì)胞的葡萄糖含量有所下降；當(dāng)正常HepG2細(xì)胞中KDSR基因過表達(dá)時(shí)，可使正常HepG2細(xì)胞中神經(jīng)酰胺含量升高、PKCζ/Akt/Foxo1信號(hào)通路活化程度異常，同時(shí)也使正常HepG2細(xì)胞產(chǎn)生與IR細(xì)胞類似的葡萄糖含量升高的情況。這表明，KDSR基因的高表達(dá)通過提高神經(jīng)酰胺含量并調(diào)節(jié)其下游PKCζ/Akt/Foxo1信號(hào)通路參與IR的發(fā)生，這可能是IR發(fā)生的機(jī)制之一?；诖私Y(jié)論，我們探究花旗澤仁是否通過調(diào)節(jié)KDSR基因的表達(dá)改善IR。

本部分實(shí)驗(yàn)對(duì)IR細(xì)胞給藥花旗澤仁，同時(shí)對(duì)正常HepG2細(xì)胞進(jìn)行KDSR基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染KDSR過表達(dá)質(zhì)粒(KDSR-OE)，并給予花旗澤仁處理，觀察這兩種細(xì)胞KDSR基因表達(dá)情況、神經(jīng)酰胺含量、PKCζ/Akt/Foxo1信號(hào)通路活性及葡萄糖含量，深入探討花旗澤仁改善IR的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，給藥花旗澤仁后，IR細(xì)胞及KDSR過表達(dá)細(xì)胞中KDSR的表達(dá)水平明顯下降，神經(jīng)酰胺含量降低，且PKCζ/Akt/Foxo1信號(hào)通路表達(dá)異常的狀態(tài)有所改善，同時(shí)，給藥后兩種細(xì)胞中葡萄糖含量明顯下降。

綜上所述，花旗澤仁改善IR的作用機(jī)制之一可能是通過下調(diào)IR細(xì)胞中KDSR基因的表達(dá)，降低IR細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的含量，調(diào)節(jié)PKCζ/Akt/Foxo1信號(hào)通路的活化狀態(tài)，進(jìn)而改善IR。