雷公藤甲素聯(lián)合硫酸軟骨素脂質(zhì)體對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用

郭睿博，孔 亮，張 璐，蔡馥伊，李學(xué)濤

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種與關(guān)節(jié)相關(guān)的自身免疫性疾病，在中醫(yī)上屬于“弊證”，它以關(guān)節(jié)軟骨糜爛和損傷、滑膜細(xì)胞增生和骨破壞為特征，該病的主要臨床特征為侵蝕性、對(duì)稱(chēng)性的關(guān)節(jié)炎，其中雙手、腕、膝、踝和足關(guān)節(jié)的受累最為常見(jiàn)[1]。RA的病因十分復(fù)雜，主要包括遺傳、吸煙、微生物感染、激素刺激、寒冷刺激及飲食等[2]。RA發(fā)展的確切病理機(jī)制仍不清楚，炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在RA的免疫發(fā)病機(jī)制中起著核心作用，炎癥因子的增加可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜細(xì)胞增殖，導(dǎo)致發(fā)炎的滑膜浸潤(rùn)到鄰近關(guān)節(jié)軟骨和骨，從而引起軟骨和骨骼的破壞[3]。目前廣泛用于RA的藥物有非甾體類(lèi)抗炎藥(NSAIDs)、減病抗風(fēng)濕藥(DMARDs)及糖皮質(zhì)激素(GCs)等，但是這些藥物生物利用度較差，需要高劑量和頻繁的使用，因此產(chǎn)生了一些嚴(yán)重的副作用，如免疫缺陷、胃腸紊亂和體液紊亂等[4]。隨著中藥治療RA的研究不斷取得突破，中醫(yī)藥治療RA的療效顯著，副作用少，受到越來(lái)越多的關(guān)注。

雷公藤甲素(triptolide, TP)又稱(chēng)雷公藤內(nèi)酯醇，是一種從雷公藤中分離出來(lái)的有效的免疫抑制化合物，雷公藤甲素具有多種生物活性，如抗炎、抗增殖、免疫抑制和抗腫瘤等，被用于治療RA、免疫復(fù)合物腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和器官組織移植等炎癥性和自身免疫性疾病[5-6]。然而，TP的溶解度較差，全身性毒副作用嚴(yán)重，藥代動(dòng)力學(xué)半衰期短，導(dǎo)致其抗RA作用尚未在臨床上得到充分發(fā)揮[7-8]。

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)是葡糖胺聚糖一個(gè)亞族，是一種不分枝的、多分散的、復(fù)雜的大分子化合物。CS能顯著抑制水腫、滑膜炎和關(guān)節(jié)軟骨破壞，有利于修復(fù)關(guān)節(jié)損傷，再生軟骨細(xì)胞，增加關(guān)節(jié)滑液量, 具有減輕關(guān)節(jié)炎患者疼痛和增加活動(dòng)能力的作用。它能抑制軟骨基質(zhì)降解，對(duì)受損的軟骨有保護(hù)作用[9-10]。因此，為了降低TP毒性、更好發(fā)揮其療效及增加其骨保護(hù)的作用，本研究將TP與CS共同包封于脂質(zhì)體中，探究其對(duì)CIA的治療作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量(140-180)g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001。大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫(22-24)℃，濕度55%-60%。本研究中所有實(shí)驗(yàn)方案均得到動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行動(dòng)物研究。

1.2 藥材、藥品與試劑TP(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20051508，純度98.94%)；CS(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)D1128A，純度95.4%)；卵磷脂、膽固醇(美國(guó)Avanti Polar Lipids公司)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)(日本NOF公司)；雞Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBT1422、SLBT1714、SLBV4134)；IL-1β、TNF-α及IL-6 ELISA試劑盒(北京索萊寶生物有限公司，批號(hào)：20200817、20200901、20200704)；其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 主要儀器JY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；XS105型十萬(wàn)分之一天平(Mettler Toledo)；Ti-S型熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；RM2235型石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；HBS-1096A型酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 脂質(zhì)體的制備采用薄膜分散-硫酸銨梯度法，用甲醇將TP、卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000振搖并超聲溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，形成薄膜后用硫酸銨溶液進(jìn)行水化，用探頭超聲儀間歇超聲后，0.22 μm的微孔濾膜3次，制得雷公藤甲素脂質(zhì)體(TP-Lips)。將該脂質(zhì)體密封于透析膜袋中，使用PBS作為透析介質(zhì)，之后與CS混合，水浴振搖24 h，制得雷公藤甲素聯(lián)合硫酸軟骨素脂質(zhì)體(TP-CS-Lips)。制得的脂質(zhì)體性質(zhì)穩(wěn)定，可用于后續(xù)的研究。

2.2 動(dòng)物分組與造模將雞Ⅱ型膠原溶于新鮮配置的的乙酸溶液中，在4 ℃攪拌過(guò)夜。次日于冰上將膠原溶液加入到弗氏完全佐劑中，要逐滴加入、攪拌約2 h，將其乳化完全，用作初次免疫；繼發(fā)免疫劑的制備方法同上，只需將膠原溶液加入弗氏不完全佐劑即可。隨機(jī)挑選8只大鼠作為對(duì)照組(Control)，其余40只大鼠，在每只大鼠尾根部皮下注射100 μL初次免疫劑，7 d后，繼續(xù)注射繼發(fā)免疫劑加強(qiáng)免疫[11]。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型組(Model)、TP組、TP-CS組、TP-Lips組及TP-CS-Lips組。

2.3 給藥方法TP組、TP-CS組、TP-Lips組及TP-CS-Lips組分別腹腔注射之前制備的TP、TP-CS、TP-Lips及TP-CS-Lips(TP：30 μg·kg-1,CS：100 mg·kg-1)，Control組和Model組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，治療周期為28 d。

2.4 體質(zhì)量稱(chēng)定分別于0 d(給藥前)和7、14、21及28 d相同時(shí)間段對(duì)各組大鼠進(jìn)行體質(zhì)量的稱(chēng)定。

2.5 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)價(jià)分別于0(給藥前)和7、14、21及28 d相同時(shí)間段對(duì)各組大鼠關(guān)節(jié)進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。評(píng)分依據(jù)為：關(guān)節(jié)無(wú)腫脹計(jì)0 分；關(guān)節(jié)輕微腫脹計(jì)1分；關(guān)節(jié)中度紅腫計(jì)2分；關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹計(jì)3分；關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹并出現(xiàn)功能障礙計(jì)4分。

2.6 胸腺指數(shù)與脾指數(shù)的測(cè)定將大鼠處死后，完整剝離胸腺與脾臟，用電子天平稱(chēng)重，計(jì)算胸腺指數(shù)與脾指數(shù)。

2.7 HE染色將大鼠處死后，完整分離大鼠關(guān)節(jié)膝關(guān)節(jié)軟骨組織，將其放置脫鈣液中脫鈣，用4 %多聚甲醛進(jìn)行固定、乙醇脫水、二甲苯透明、放入石蠟中進(jìn)行包埋，然后切片、脫蠟，進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察。

2.8 炎癥因子的測(cè)定大鼠連續(xù)治療28 d后，摘取眼球取血，3 000 r·min-1離心5 min后取上清，于-20 ℃條件保存。用ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6的表達(dá)水平，樣品處理和實(shí)驗(yàn)操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 各組藥物對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響如Tab 1所示，0-28 d，Control組大鼠的體質(zhì)量顯著上升；Model組大鼠的體質(zhì)量雖也呈上升趨勢(shì)，但是上升緩慢，與Control相比體質(zhì)量降低，體質(zhì)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在治療28 d后，TP-Lips組大鼠相比Model組體質(zhì)量明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在治療21 d后，TP-CS-Lips組相比Model組體重顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而TP組、TP-CS組與Model組相比體質(zhì)量沒(méi)有上升，反而有些許下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 各組藥物對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分的影響如Tab 2所示，與Control組相比，Model組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)上升明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療14 d后，TP-Lips組、TP-CS-Lips組與Model組相比，關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在治療28 d后，TP-CS組大鼠與Model組相比，其關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TP組與Model組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 1 The body weight of rats in groups with different treatment

Tab 2 The arthritis score of rats in groups with different treatment

Tab 3 The thymus and spleen index of rats in groups with different treatment n=8)

3.3 各組藥物對(duì)大鼠胸腺與脾指數(shù)的影響與Control組相比，Model組胸腺指數(shù)、脾指數(shù)上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Model組相比TP-Lips組、TP-CS-Lips組胸腺指數(shù)、脾指數(shù)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而TP組、TP-CS組與Model組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 各組藥物對(duì)大鼠軟骨病理?yè)p傷的影響大鼠關(guān)節(jié)軟骨HE染色如Fig 1所示，Control組軟骨表面平整光滑，細(xì)胞排列均勻整齊、軟骨陷窩清晰可見(jiàn)，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，軟骨基質(zhì)深染、著色均勻，潮線清晰完整；而Model組軟骨表面不光整且出現(xiàn)了增生，部分軟骨陷窩消失，部分細(xì)胞核壞死，軟骨基質(zhì)淺染且著色不均，潮線模糊；各治療組相比于Model組，癥狀有所改善，其中TP-CS-Lips組對(duì)大鼠滑膜改善作用最顯著。

Fig 1 Effects of various formulations on pathological injury of rat cartilage

3.5 各組藥物對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響如Tab 4所示，相比于Control組，Model組大鼠血清中的IL-1β、TNF-α及IL-6的水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各治療組大鼠血清中的IL-1β、TNF-α及IL-6的水平相比于Model組均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且TP-CS-Lips組IL-1β、TNF-α及IL-6的水平降低最為明顯。

Tab 4 The inflammatory cytokines in rat serum in groups with different treatment

4 討論

RA是一種自身免疫性疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨糜爛損傷、血管翳、滑膜炎癥和骨破壞。Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型(CIA)在病理學(xué)上的表現(xiàn)與人類(lèi)RA很類(lèi)似，是目前公認(rèn)的RA最佳模型[12]。本研究通過(guò)尾部注射雞Ⅱ型膠原弗氏佐劑以建立CIA大鼠模型。通過(guò)造模的大鼠與Control組相比食量減少，體重下降，精神萎靡，關(guān)節(jié)出現(xiàn)了嚴(yán)重的腫脹，嚴(yán)重影響了其活動(dòng)能力。且Model組的大鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)明顯增加；滑膜組織損傷嚴(yán)重；血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6的水平提高，顯示CIA模型制備成功。

脂質(zhì)體是一種將藥物包封于類(lèi)生物膜的微小囊泡中，脂質(zhì)體的制備簡(jiǎn)便、生物利用度高，能夠顯著增加藥物的溶解度，并能降低藥物的毒性，具有靶向性、緩釋性特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于RA的治療。Ren等[13]通過(guò)將地塞米松包載于脂質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)地塞米松脂質(zhì)體相比于游離地塞米松對(duì)CIA的治療作用大大增強(qiáng)。Gawne等[14]將糖皮質(zhì)激素包封于脂質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)給藥糖皮質(zhì)激素脂質(zhì)體比游離組在發(fā)炎的關(guān)節(jié)處的藥物攝取量高，治療效果優(yōu)于游離組。TP可以抗炎、抗增殖、免疫抑制和抗腫瘤，但由于其溶解性差、毒副作用強(qiáng)，限制了它的臨床應(yīng)用。Lu等通過(guò)大鼠給藥不同濃度TP，發(fā)現(xiàn)給藥后大鼠肝臟出現(xiàn)了嚴(yán)重的毒性，體重也下降[15]。為了降低TP的毒性，本研究中將TP包載于脂質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)治療21 d后，TP-Lips組和TP-CS-Lips組大鼠相比于Model組，體重明顯上升。而TP組、TP-CS組大鼠體重相比于Model組雖然對(duì)關(guān)節(jié)炎有治療作用，但是體重卻下降，應(yīng)是其毒性導(dǎo)致。

炎性細(xì)胞因子在RA的免疫發(fā)病機(jī)制中起著核心作用，它可以增加并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜細(xì)胞增殖，導(dǎo)致發(fā)炎的滑膜浸潤(rùn)到鄰近關(guān)節(jié)軟骨和骨，從而導(dǎo)致軟骨和骨骼的破壞。在RA患者體內(nèi)TNF-α、IL-1β及IL-6大量存在[16]。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是導(dǎo)致炎癥發(fā)生的關(guān)鍵炎癥因子之一，在RA患者血清中TNF-α水平顯著提高，它是導(dǎo)致滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞的重要因素；IL-1β主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)、炎癥發(fā)生、軟骨細(xì)胞凋亡等。在許多病例中發(fā)現(xiàn)，血漿和滑膜液中IL-1β濃度增高；IL-6由多種細(xì)胞產(chǎn)生，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，IL-6通過(guò)作用于中性粒細(xì)胞，分泌活性氧中間體和蛋白水解酶，引起炎癥和關(guān)節(jié)破壞[17]。本研究中，TP-CS-Lips組的大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6的水平相比于Model組顯著降低。Ni R等通過(guò)熒光成像的方法，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體在CIA大鼠關(guān)節(jié)部位集聚，發(fā)揮了更好的療效[18]。本研究中，TP-Lips組和TP-CS-Lips組比TP組、TP-CS組治療效果更好，也說(shuō)明TP包封在脂質(zhì)體后更好的發(fā)揮了抗炎的作用。同時(shí)TP-CS-Lips組也降低了大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)、改善了軟骨組織損傷。

綜上所述，TP-CS-Lips對(duì)CIA的治療作用明顯，且TP毒副作用被改善，使其充分發(fā)揮抗炎作用，同時(shí)又增加了CS的骨保護(hù)作用。TP-CS-Lips從抗炎和骨破壞兩方面同時(shí)入手，在臨床應(yīng)用具有很大潛力。本研究為其進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)提供了參考。