DNA加雙氧酶TET1在高壓誘導(dǎo)心肌纖維化中的作用研究

李路安，吳清蕊，李 倩，饒 芳，鄺素娟，楊 慧，張黔桓，張 斌

[1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省心血管病研究所心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510080；3.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)醫(yī)學(xué)研究部臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080]

心臟壓力負(fù)荷增高是多種心臟疾病共同存在的現(xiàn)象，這類心臟疾病常見包括原發(fā)/繼發(fā)性高血壓、心臟瓣膜疾病、原發(fā)/繼發(fā)性心肌病以及肺動(dòng)脈高壓等，長(zhǎng)時(shí)間的心臟壓力負(fù)荷增高會(huì)引發(fā)心肌纖維化，造成心臟不可逆的損害，最終危害生命健康[1]。心肌纖維化是一種心臟受到異常刺激后不斷發(fā)生損傷與修復(fù)的病理改變，主要是由于心肌成纖維細(xì)胞(CFs)增殖轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞并大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，最終ECM過度沉積所導(dǎo)致的[2]。ECM的主要成分為膠原蛋白，其中I型與Ⅲ型膠原蛋白(COL-1、COL-3)在心肌組織中占總膠原蛋白含量的90%以上，COL-1和COL-3比例異常升高會(huì)使得心肌變硬，最終出現(xiàn)收縮與舒張功能障礙[3]。

目前研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)參與纖維化的發(fā)生發(fā)展，是治療纖維化的重要靶點(diǎn)。此外，TGF-β可以促進(jìn)CFs分泌膠原蛋白，引起心肌纖維化[4]，且在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化中也發(fā)揮著重要的作用[5]。

DNA加雙氧酶TET(Ten-eleven translocation)家族是一種去甲基化相關(guān)的DNA加雙氧酶，它可以通過將5-甲基胞嘧啶(5-mC)氧化成5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-胞嘧啶甲酰(5-fc)和5-胞嘧啶羧基(5-cac)，5-fc與5-cac最終被胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)識(shí)別并消化，實(shí)現(xiàn)DNA去甲基化[6]。目前認(rèn)為，DNA去甲基化與基因激活有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)TET2可以通過調(diào)控TGF-β調(diào)節(jié)區(qū)域的去甲基化實(shí)現(xiàn)TGF-β的激活，進(jìn)而影響糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[7]。另外也有研究報(bào)道DNA去甲基化參與主動(dòng)脈縮窄小鼠心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[8]；但在高壓負(fù)荷下TET家族參與心肌纖維化的病理機(jī)制尚未明確。因此，本研究將Wistar及自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)作為動(dòng)物模型、以高壓誘導(dǎo)的原代SD乳大鼠心肌成纖維細(xì)胞(NRCFs)作為細(xì)胞模型，探討高壓負(fù)荷下心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制是否與TET家族對(duì)TGF-β的甲基化修飾相關(guān)，旨在為高壓負(fù)荷下防控心肌纖維化的發(fā)生提供新的治療靶點(diǎn)，并為改善心肌纖維化患者的心功能提供新的治療方案。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出生7周的♂ SHR和Wistar大鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證為SCXK(京)2016-0006。出生0-3 d的SD乳大鼠，不限雌雄，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2016-0041。動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)單位為廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)所。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)No.GDREC2014095A。

1.2 主要試劑TET1(ab191698)、TET2(ab94580)、TET3(ab139311)，COL-1(ab34710)、COL-3(ab7778)和5-hmC(ab214728)抗體，均購自Abcam公司；TGF-β(3711)抗體購自CST公司；GAPDH(60004-1)抗體購自Proteintech公司；Loding Buffer(9173)和TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(RR820A)購自TaKaRa公司；蛋白酶抑制劑(539131)和RIPA裂解液(20-188)購自Millipore公司；Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑盒(L3000-015)購自Thermo公司；DMEM/F12培養(yǎng)基(C11330500BT)購自Gibco公司；BCA試劑盒(P0009)和DNA提取試劑盒(D0063)購自碧云天公司；TBS(AR0031)和PBS(AR0030)購自BOSTER公司；EpiMark?5-hmC 和5-mC分析試劑盒(E3317)購自NEB公司；Triton X-100(X100-100ML)購自Sigma公司；sh-RNA-TET1購自吉?jiǎng)P基因。

2 方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1動(dòng)物造模及心臟標(biāo)本采集 SHR是自發(fā)性高血壓大鼠，其血壓隨鼠齡增高而不斷增高，并在12周左右確立高血壓，本研究將出生7周的雄性Wistar大鼠(n=6)作為正常血壓對(duì)照組，性別周齡匹配的SHR(n=6)作為高血壓組，飼養(yǎng)于恒定的標(biāo)準(zhǔn)室溫、濕度和光照周期下，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)鼠食及自來水，飼養(yǎng)8周后，根據(jù)SHR與Wistar大鼠的血壓明確SHR造模是否成功。血壓的測(cè)量采用無創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)定大鼠尾部動(dòng)脈血壓，測(cè)量3次并取其均值為1次血壓。

將造模成功的SHR與Wistar大鼠稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)麻醉，待麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠，快速取出整顆心臟標(biāo)本，冰上快速分離出大鼠左心室組織，并剪取綠豆大小的左心室組織置入預(yù)冷的多聚甲醛(40 g·L-1)中4 ℃保存，用于后續(xù)的HE及Masson染色，剩余一部分心肌組織置于-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2Western blot 心臟組織總蛋白提?。杭羧∵m量組織塊，PBS清洗后加入RIPA裂解液(含10 g·L-1的蛋白酶抑制劑)，冰上破碎裂解20-30 min，12 000 r·min-14 ℃ 離心15 min，取上清為組織總蛋白。采用BCA法測(cè)蛋白濃度，按照20 μg蛋白上樣量配置上樣緩沖液，經(jīng)變性、電泳、電轉(zhuǎn)，封閉后用相應(yīng)的一抗(1 ∶1 000稀釋)4 ℃ 孵育過夜，用與一抗相同來源的二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，最后使用ECL法顯影目的條帶，Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，并計(jì)算目的條帶與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值。

2.1.3HE和Masson染色 將Wistar大鼠和SHR的左心室心肌組織在多聚甲醛(40 g·L-1)中固定48 h后，進(jìn)行石蠟包埋，切片，HE和Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌形態(tài)及心肌纖維膠原的改變。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1原代NRCFs分離及造模 快速取出0-3 d的SD乳大鼠心臟，用酶解法將心肌組織消化成單個(gè)細(xì)胞，再利用心肌細(xì)胞與NRCFs貼壁時(shí)間的差異分離出NRCFs，使用的酶液為含有胰酶(0.8 g·L-1,溶劑為PBS溶液)和膠原酶(0.8 g·L-1,溶劑為PBS溶液)的混合酶。用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)NRCFs，并將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%-90% 時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。選取P2-P5代NRCFs進(jìn)行干預(yù)。使用我們自行研制的高壓裝置，可提供并維持一定的壓力(專利號(hào)201420109263.1，中國)，根據(jù)大鼠正常左心室的壓力負(fù)荷為90 mmHg-120 mmHg，設(shè)置0 mmHg為對(duì)照組、120 mmHg為正常壓力組、180 mmHg為高壓力組，處理24 h，并以NRCFs的纖維化相關(guān)蛋白(COL-1和COL-3)表達(dá)的增加來判斷心肌纖維化模型是否建立成功。

2.2.2原代NRCFs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 采用Lipofectamine 3000試劑對(duì)NRCFs進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，分別設(shè)置Control+Neg組、180 mmHg+Neg組和180 mmHg+sh-TET1組。在細(xì)胞成長(zhǎng)至80%-90% 的密度時(shí)，按125 μL ∶7.5 μL比例加入Opti-MEMTM培養(yǎng)基與 Lipofectamine 3000試劑，混勻；按125 μL ∶2.5 μg比例加入Opti-MEMTM培養(yǎng)基稀釋DNA，然后添加5 μL的P3000 試劑；按1 ∶1的比例在每管已稀釋的LipofectamineTM3000 試劑中加入稀釋的DNA，室溫孵育15 min，將DNA-脂質(zhì)復(fù)合物加入到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h換液，繼續(xù)轉(zhuǎn)染24 h，顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

2.2.3Western blot 細(xì)胞總蛋白提?。簩⑻幚砗玫募?xì)胞用PBS清洗殘留培養(yǎng)液，加入RIPA裂解液(含10 g·L-1的蛋白酶抑制劑)，冰上靜置裂解20-30 min，收集裂解液，12 000 r·min-14 ℃離心15 min，取上清為細(xì)胞總蛋白。其余步驟同“2.1.2”。

2.2.4細(xì)胞免疫熒光 在貼壁的NRCFs中加入多聚甲醛(40 g·L-1)固定細(xì)胞15 min，PBS洗凈；加入 Triton X-100(2 g·L-1)通透細(xì)胞20 min，PBS洗凈；加入HCl(2 mol·L-1)變性細(xì)胞30 min，PBS洗凈；加入BSA(50 g·L-1)封閉細(xì)胞30 min，去除BSA，加入一抗(5-hmC,1 ∶500)，置于避光濕盒中4 ℃ 孵育過夜，加入適量的熒光二抗(1:200)室溫孵育1 h；最后加入DAPI染細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察染色結(jié)果，Image J軟件測(cè)定目的細(xì)胞5-hmC的平均熒光強(qiáng)度。

2.2.55-mC與5-hmC的水平檢測(cè) 使用碧云天公司的DNA提取試劑盒提取NRCFs的DNA，將提取好的DNA使用NEB公司的EpiMark 試劑盒來分析5-mC與5-hmC的水平。這種方法是利用了同分異構(gòu)體Mspl和Hpall對(duì)不同修飾的DNA甲基化敏感性來區(qū)分5-mC和5-hmC。將目的基因組DNA用T4-BGT處理，將所有的5-hmC葡萄糖化(5-ghmC)，但是未修飾或含有5-mC的DNA不受影響。糖基化后使用Mspl和Hpall限制性內(nèi)切酶消化相同的目的序列(CCGG)，Hpall只裂解一個(gè)完全未修飾的位點(diǎn)，任何修飾(5-mC、5-hmC或5-ghmC)在任何一個(gè)胞嘧啶都將阻斷裂解；而Mspl識(shí)別和切割5-mC和5-hmC，但不識(shí)別和切割5-ghmC。

將不同限制性內(nèi)切酶裂解的DNA樣品用熒光定量PCR來分析DNA片段的5-mC與5-hmC的變化。將目的DNA配置成10 μL的PCR反應(yīng)體系，內(nèi)含：5 μL TB Green?Premix Ex Taq，3.2 μL超純水，0.4 μL PCR正義引物，0.4 μL PCR反義引物，1 μL DNA模板。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 2 min，PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 25 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s)，72 ℃ 5 min，60 ℃ 25 s，95 ℃ 15 s。通過2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。TGF-β引物序列：Forward 5′-GCCGCGGATCCTCCAGAC A-3′, Reverse 5′-CAGACTCTGGGGCCTCGGA-3′，β-actin引物序列：Forward 5′-TGTCCCTGTATGCCTC TGGT-3′, Reverse 5′-GATGTCACGCACGATTTCC-3′。

3 結(jié)果

3.1 SHR心肌纖維化改變及TET1和TGF-β蛋白表達(dá)水平變化為了探索在體TET與TGF-β以及心肌纖維化的關(guān)系，選取Wistar與SHR大鼠心室肌組織來檢測(cè)心肌纖維化以及TET、TGF-β蛋白表達(dá)水平的改變。結(jié)果顯示：與Wistar大鼠相比，SHR大鼠血壓明顯升高(P<0.01，Tab 1)，心室組織中的TET1、TGF-β、COL-1和COL-3的蛋白表達(dá)均增加(P<0.05,Fig 1A)。HE染色顯示心肌細(xì)胞間質(zhì)增加、排列紊亂，心肌細(xì)胞呈現(xiàn)肥大狀態(tài)。Masson染色可見心肌組織間膠原纖維增多(Fig 1C)。

Tab 1 Comparison of blood pressure between Wistar rats and SHR

Fig 1 Expressions of TET1, TGF-β and fibrosis related protein in myocardium of Wistar rats and SHR

3.2 高壓對(duì)NRCFs中纖維化相關(guān)蛋白及TGF-β的表達(dá)水平的影響將P2-P5代心肌成纖維細(xì)胞置于不同的壓力(0、120、180 mmHg)中培養(yǎng)24 h，使用Western blot 檢測(cè)不同壓力梯度下COL-1和COL-3的表達(dá)，以及檢測(cè)促纖維化因子TGF-β的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，隨著120 mmHg與180 mmHg壓力梯度的增高，TGF-β蛋白表達(dá)水平以及COL-1和COL-3蛋白均逐漸升高，在180 mmHg壓力下達(dá)最高水平(P<0.01,Fig 2A)；而與120 mmHg壓力組相比，180 mmHg壓力組的上述蛋白表達(dá)水平均有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，F(xiàn)ig 2A)。

Fig 2 High pressure affected expression of fibrosis-related proteins and TGF-β in NRCFs

3.3 高壓處理NRCFs對(duì)TET家族蛋白表達(dá)及5-hmc水平的影響在高壓誘導(dǎo)NRCFs中纖維化相關(guān)蛋白高表達(dá)的基礎(chǔ)上，使用Western blot 檢測(cè)TET1、TET2和TET3的蛋白表達(dá)，以及使用免疫熒光檢測(cè)5-hmC的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，壓力負(fù)荷組5-hmC的熒光強(qiáng)度明顯增加，并呈壓力依賴性(P<0.01,Fig 3C)；去甲基化相關(guān)酶TET1蛋白表達(dá)隨著壓力梯度的升高而升高，但僅在180 mmHg組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,Fig 3A)，而TET2和TET3無明顯的變化(P>0.05,Fig 3A)。以上結(jié)果顯示，在高壓誘導(dǎo)心肌纖維化模型中，細(xì)胞呈現(xiàn)了去甲基化的趨勢(shì)，且這種改變與TET1表達(dá)升高相關(guān)，提示TET1在高壓誘導(dǎo)的心肌纖維化中可能發(fā)揮著重要的作用。

Fig 3 High pressure affected TET1 expression and 5-hmC level in NRCFs

3.4 敲低TET1對(duì)高壓誘導(dǎo)的5-hmC水平的影響為了進(jìn)一步明確高壓狀態(tài)下5-hmC的水平增加與TET1的高表達(dá)相關(guān)，我們對(duì)180 mmHg壓力下的NRCFs予以TET1 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲低TET1(轉(zhuǎn)染效率見補(bǔ)充Fig 1)，觀察5-hmC水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TET1 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后TET1表達(dá)水平降低(P<0.01,Fig 4A)并伴隨著5-hmC水平的降低(P<0.01,Fig 4C)，說明TET1參與調(diào)控高壓狀態(tài)下5-hmC水平的變化。

Fig 4 Knockdown of TET1 affected 5-hmC level under high pressure

3.5 敲低TET1對(duì)高壓誘導(dǎo)TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域5-hmC水平、TGF-β蛋白表達(dá)以及心肌纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為了確定TET1在高壓相關(guān)的心肌纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在高壓下敲低TET1的NRCFs中進(jìn)一步檢測(cè)纖維化相關(guān)蛋白和TGF-β的表達(dá)，以及TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域5-hmC的水平。結(jié)果顯示，敲低TET1之后，TGF-β表達(dá)水平下降(P<0.01，F(xiàn)ig 5C)，并伴隨著纖維化相關(guān)蛋白COL-1和COL-3表達(dá)降低(P<0.05，F(xiàn)ig 5C)；此外，TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域5-hmC在敲低TET1后水平明顯降低(P<0.01，F(xiàn)ig 5B)，而5-mC和5-hmC的總水平升高(P<0.05，F(xiàn)ig 5A)，提示敲低TET1促使TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域甲基化。此部分研究顯示，高壓狀態(tài)下敲低TET1可以通過促進(jìn)TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域甲基化從而降低TGF-β表達(dá)以及降低纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。

Fig 5 Knockdown of TET1 affected 5-hmC level in TGF-β promoter region, TGF-β expression and fibrosis related proteins induced by high pressure

4 討論

本研究結(jié)果表明，壓力負(fù)荷增高，DNA加雙氧酶TET1、5-hmC、TGF-β以及纖維化相關(guān)蛋白增加；高壓下敲低TET1可以降低TGF-β啟動(dòng)子區(qū)5-hmC水平、增加5-mC和5-hmC總水平，以及降低TGF-β表達(dá)，抑制纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)。提示TET1可能通過調(diào)控TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化進(jìn)而激活TGF-β表達(dá)，參與高壓負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化。

心臟高壓負(fù)荷會(huì)通過持續(xù)的機(jī)械應(yīng)力誘發(fā)心臟的一系列自我保護(hù)作用，包括心肌肥大以及心肌纖維化等，其中心肌纖維化以膠原沉積為主要特征，最終會(huì)導(dǎo)致心臟順應(yīng)性下降，收縮與舒張功能障礙，心力衰竭。已有研究表明，機(jī)體內(nèi)心血管系統(tǒng)承受的三種不同的力學(xué)刺激，剪切應(yīng)力、牽張力和靜水壓[9]；剪切應(yīng)力是指血流對(duì)細(xì)胞表面產(chǎn)生的摩擦力[10]。牽張力是指血流導(dǎo)致血管擴(kuò)張和回縮產(chǎn)生的力[11]；靜水壓是指血流對(duì)單位面積血管壁的壓力(即血壓)[9]。我們認(rèn)為高壓負(fù)荷所導(dǎo)致心臟的一系列病理改變，其主要的力學(xué)改變是高靜水壓。靜水壓升高進(jìn)而導(dǎo)致心臟擴(kuò)大，發(fā)生牽拉，導(dǎo)致牽張力的增加。因此，本研究使用自行研制的高靜水壓裝置，在體外給予一定的壓力負(fù)荷，以觀察高壓負(fù)荷導(dǎo)致心肌纖維化的病理機(jī)制。在本課題組已報(bào)道研究中，通過體外高壓裝置給與心房肌成纖維細(xì)胞20 mmHg及40 mmHg壓力梯度來模仿心房高壓狀態(tài)，并發(fā)現(xiàn)心肌纖維化相關(guān)因子水平隨壓力梯度升高，成功構(gòu)建心房肌成纖維細(xì)胞心肌纖維化模型[12]。在本研究中，通過體外給與NRCFs 120 mmHg及180 mmHg的壓力來模仿心室的正常壓力和高壓狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)NRCFs在120 mmHg及180 mmHg壓力處理24 h后，促纖維化因子TGF-β以及心肌纖維化相關(guān)蛋白COL-1和COL-3呈現(xiàn)穩(wěn)定的梯度增加，以高壓180 mmHg更為明顯。

TGF-β作為已知的心肌纖維化發(fā)病重要靶點(diǎn)，主流研究聚焦于TGF-β與Smad家族蛋白之間的關(guān)系，認(rèn)為TGF-β可以通過結(jié)合于細(xì)胞膜TGF-β的I型和Ⅱ型受體形成復(fù)合體，然后作用于胞質(zhì)中的Smad家族蛋白并使其磷酸化活化，進(jìn)而啟動(dòng)纖維化的發(fā)生[13-14]。但是在心肌纖維化中何種機(jī)制能夠調(diào)控TGF-β還未得到很好闡明。本研究中，不論是細(xì)胞高壓模型還是SHR動(dòng)物模型中，TGF-β表達(dá)均明顯升高，與目前主流研究一致，因此需進(jìn)一步探索調(diào)控TGF-β的作用機(jī)制。

TET家族蛋白是DNA去甲基化最主要的因子，通過將5-mC氧化成5-hmC啟動(dòng)去甲基化過程進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)[15]。研究表明，DNA去甲基化與心肌纖維化存在密切關(guān)系。如在升主動(dòng)脈縮窄模型小鼠中，骨形成蛋白7通過促進(jìn) RASAL1啟動(dòng)子去甲基化，促進(jìn)RASAL1表達(dá)增加，進(jìn)而減少了心肌纖維化[8]；在SHR心臟中，也發(fā)現(xiàn)抑制DNA甲基化可以顯著減少心肌膠原蛋白沉積以及心肌細(xì)胞的大小[16]。雖然直接關(guān)注TET家族蛋白在器官纖維化中作用的研究不多，但在硬皮病患者的成纖維細(xì)胞中，TET1的mRNA水平明顯高于正常成纖維細(xì)胞，5-hmC水平明顯升高，總體甲基化水平降低[17]，提示TET1與硬皮病患者的纖維化有著密切關(guān)系。本研究中，在120 mmHg與180 mmHg壓力造模成功的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)5-hmC的水平梯度上升，TET1蛋白表達(dá)梯度升高，而TET2和TET3并無明顯改變，并在SHR中也發(fā)現(xiàn)了TET1表達(dá)升高，提示TET1可能通過調(diào)控DNA去甲基化參與高壓誘導(dǎo)的心肌纖維化。進(jìn)一步在180 mmHg壓力狀態(tài)下敲低NRCFs的TET1，發(fā)現(xiàn)5-hmC水平和TGF-β蛋白表達(dá)均下降，且伴隨著COL-1和COL-3蛋白表達(dá)下降，說明TET1在高壓誘導(dǎo)的TGF-β參與的心肌纖維化中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病中，TET2可以通過調(diào)節(jié)TGF-β調(diào)節(jié)區(qū)域的去甲基化進(jìn)而激活TGF-β的表達(dá)來調(diào)控糖尿病腎病的發(fā)病。本研究中，在敲低TET1的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域5-hmC水平降低，而5-mC及5-hmC總水平升高，說明敲低TET1后TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域中甲基化水平增高，抑制了高壓狀態(tài)下被激活的TGF-β，進(jìn)一步說明在高壓誘導(dǎo)的心肌纖維化模型中，TET1可以調(diào)控TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域的去甲基化進(jìn)而調(diào)控TGF-β的表達(dá)。

綜上所述，本研究初步證實(shí)TET1可能通過調(diào)控TGF-β啟動(dòng)子區(qū)域的去甲基化來激活TGF-β參與高壓誘導(dǎo)的心肌纖維化。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于將DNA去甲基化相關(guān)酶TET1與TGF-β參與的高壓誘導(dǎo)的心肌纖維化關(guān)聯(lián)起來，旨在探索高壓誘導(dǎo)的心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制，尋找高壓誘導(dǎo)心肌纖維化的潛在藥物治療靶點(diǎn)。