Cyclophilin A在病毒感染中的作用研究進(jìn)展①

岳巖磊 張穩(wěn)穩(wěn) 張夢(mèng)豪 劉 薇（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002）

Cyclophilin A（CypA）為Cyclophilin家族成員，具有順反異構(gòu)酶活性，是一個(gè)高度保守并廣泛存在的蛋白質(zhì)。在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)有16個(gè)Cyclophilin家族成員，包括CypA、CypB、CypC、CypD、Cyp33、Cyp40，其中CypA和Cyp40主要定位于細(xì)胞質(zhì)，CypB和CypC主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，CypD可直接與線粒體膜蛋白結(jié)合定位于線粒體，Cyp33的氨基酸末端含有RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而定位于細(xì)胞核［1］。

CypA是Cyclophilin家族中含量最多、細(xì)胞內(nèi)分布最廣的蛋白，約占細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)的0.4%。人CypA基因定位于染色體7p13，DNA片段全長(zhǎng)2 276 bp，包含5個(gè)外顯子。CypA是一條含有165個(gè)氨基酸的多肽鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約為18 kD，其二級(jí)結(jié)構(gòu)含有8條反向平行的β折疊，另一面由兩條α螺旋形成桶狀結(jié)構(gòu)［1］。CypA是第一個(gè)從小牛胸腺分離出的免疫抑制劑環(huán)孢素A（Cyclosporin，CsA）的宿主細(xì)胞受體，因此被認(rèn)為是一種重要的免疫因子［2］。CypA和CsA的復(fù)合物能夠抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活性，進(jìn)而抑制T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）的去磷酸化，使其不能從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而影響下游基因活化，起到免疫抑制作用［3］。

作為Cyclophilin家族的重要成員，CypA也具有順反異構(gòu)酶活性，其機(jī)制是催化中心的電子層和脯氨酸殘基的羰基基團(tuán)改變了催化中心的偶極，這種變化導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸殘基間肽鍵的旋轉(zhuǎn)，從而使底物發(fā)生順式和反式的變化［4］。最近發(fā)現(xiàn)CypA的順反異構(gòu)酶活性還具有其他功能，包括調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子伴侶、RNA加工、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答等過程［5-6］。隨著對(duì)CypA研究的深入，發(fā)現(xiàn)CypA還參與許多病毒的復(fù)制，且具有促進(jìn)病毒復(fù)制的作用，如HIV-1、HBV等［7］。然而，CypA在流感等病毒的復(fù)制過程中卻具有抑制作用［8］。

1 CypA在人類免疫缺陷病毒（human immu-nodeficiency virus，HIV）感染中的作用

HIV是反轉(zhuǎn)錄病毒，該病毒感染人類后可破壞人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致人類獲得性免疫缺乏綜合癥（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）的發(fā)病。人CypA可與HIV-1病毒結(jié)合并摻入病毒顆粒，參與HIV-1的病毒復(fù)制、脫殼等過程［9］。最初發(fā)現(xiàn)這一過程與HIV-1的多聚蛋白Gag結(jié)合相關(guān)，其通過與Gag前體（Pr55gag）的CA功能域相互作用影響病毒粒子的組裝，尤其是第89位甘氨酸和第90位脯氨酸，而第25位丙氨酸、第27位賴氨酸、第29位脯氨酸和第30位賴氨酸位點(diǎn)突變后并未影響CypA與CA的互作［10-11］。抑制CypA和CA的結(jié)合時(shí)，HIV-1病毒的逆轉(zhuǎn)錄及cDNA的入核也受到抑制［12］。隨后，GOLDSTONE等［13］證實(shí)CypA可與哺乳動(dòng)物體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒限制因子Fv1結(jié)合形成融合蛋白Fv1CypA，而Fv1CypA能夠阻止CypA與CA的結(jié)合，從而降低HIV-1的感染力。CsA處理后，CA突變體N57A的傳染性明顯減弱，表明其傳染性依賴于CypA［14］。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)核HIV-1 DNA的積累依賴于CypA，且CypA在非洲綠猴腎細(xì)胞Vero中抑制HIV-1的感染是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒限制因子Trim5α結(jié)合到衣殼，然后阻斷HIV-1預(yù)整合復(fù)合物的核輸入過程［15］。

研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1轉(zhuǎn)錄蛋白的反式激活因子Tat（trans-activator of transcription，Tat）入核能夠保證病毒基因的有效轉(zhuǎn)錄，大部分Tat由定位在質(zhì)膜的磷脂酰肌醇4，5二磷酸PI（4，5）-P2招募而分泌到胞外，而Tat的棕櫚?；軌蜃柚筎at分泌。CHOPARD等［16］證實(shí)CypA促進(jìn)HIV-1的Tat棕櫚?；⒃谖锤腥綡IV-1的細(xì)胞中大量積累，然而，由于病毒的出芽過程中Gag與CypA的結(jié)合消耗了Cy?pA，因此該過程特異性抑制Tat-棕櫚?；?。與HIV-1相似，HIV-2原代分離株衣殼介導(dǎo)的感染同樣需要CypA，且該過程也依賴于HIV-2與CypA的相互作用［17］。盡管CypA參與HIV復(fù)制過程的作用機(jī)制尚無定論，但CypA對(duì)HIV的復(fù)制是不可或缺的，由于CypA在HIV-1復(fù)制早期即發(fā)揮重要作用，因此其可能成為阻止HIV-1復(fù)制的藥物靶點(diǎn)。

2 CypA在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染中的作用

HCV屬于黃病毒科，是一種RNA病毒。與HIV-1相同，CypA在HCV病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用，CypA敲除細(xì)胞或用CsA處理的小鼠均可顯著抑 制HCV病 毒 復(fù) 制［18-19］。CsA處 理 細(xì) 胞 后 發(fā) 現(xiàn)HCV的復(fù)制受到抑制，證實(shí)CypA能夠抑制HCV RNA的 合成［20］。FOSTER等［21］證實(shí)CypA通 過與HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白5A（non-structural protein 5A，NS5A）的第二、第三個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合催化NS5A，使NS5A更容易和HCV的正鏈RNA結(jié)合。此外，KAUL等［22］發(fā)現(xiàn)HCV-NS5A第二結(jié)構(gòu)域上的兩個(gè)突變（D2229G、L2266F）和第三結(jié)構(gòu)域上一個(gè)突變（V2440A）的復(fù)制都失去了對(duì)CypA的依賴性，并增加了對(duì)非免疫抑制的CsA類似物Alisporivir（ALV）的抵抗力。第二結(jié)構(gòu)域中另外兩個(gè)突變（D320E、R318W）可能引起局部或整體折疊擾動(dòng)，從而影響構(gòu)象的變換，但并未影響CypA與第二結(jié)構(gòu)域的相互作用［23］。另有報(bào)道證實(shí)，NS5A第二個(gè)結(jié)構(gòu)域第314位的脯氨酸-色氨酸轉(zhuǎn)變對(duì)HCV復(fù)制及與CypA相互作用至關(guān)重要，這項(xiàng)工作為進(jìn)一步探究HCVNS5A第二結(jié)構(gòu)域內(nèi)無序蛋白質(zhì)提供了分子基礎(chǔ)［24］。CypA其他抑制劑SMCypI（small-molecule cy?clophilin inhibitor，SMCypI）、ALV和SCY-635通過與CypA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抑制CypA的肽脯氨酰順反異構(gòu)酶活性，進(jìn)而破壞CypA與NS5A的相互作用，從而影響HCV的復(fù)制［25-26］。NAG等［27］證實(shí)CsA能夠影響HCV的極低密度脂蛋白（very low-density lipopro?tein，VLDL）合成途徑，導(dǎo)致脂質(zhì)滴增大、載脂蛋白B在脂質(zhì)滴上的積累，抑制感染病毒的裝配，提示CypA在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和HCV發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。

HOPKINS等［25］證實(shí)CypA還能與非結(jié)構(gòu)蛋白5B（non-structural protein 5B，NS5B）相互作用。NS5B被CypA招募至病毒復(fù)制復(fù)合體，該過程可能有利于NS5B在病毒復(fù)制過程中構(gòu)象的正確轉(zhuǎn)變，且依賴于CypA的順反異構(gòu)酶活性。通過分解位點(diǎn)的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明，HCV的復(fù)制與CypA對(duì)NS5A-NS5B蛋白分解存在相關(guān)性，表明病毒多聚蛋白的裂解在一定程度上依賴于CypA［28］。在HCV感染過程中，CypA還參與調(diào)控干擾素（interferon，IFN）產(chǎn)生的信號(hào)通路，BOBARDT等［29］發(fā)現(xiàn)，CypA可通過其順反異構(gòu)酶口袋與干擾素調(diào)節(jié)因子9（interferon regulatory factor 9，IRF9）的碳末端區(qū)域結(jié)合，誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生；而NS5A可競(jìng)爭(zhēng)性地與CypA結(jié)合，破壞CypA和IRF9復(fù)合物的形成。CypA抑制劑SCY-635能夠抑制雙鏈RNA依賴的蛋白質(zhì)激酶PKR（protein kinase R，PKR）和真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）的磷酸化，促使干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)受到抑制，由此，CypA在該通路可能成為開發(fā)治療丙肝病毒感染的新靶標(biāo)［30］。在小鼠、樹鼩和七種非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中研究CypA對(duì)HCV復(fù)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有在鼠的穩(wěn)定表達(dá)CypA細(xì)胞中拯救出HCV，提示CypA參與HCV復(fù)制存在種屬特異性［31］。隨著越來越多新的抗HCV藥物出現(xiàn)，包括直接抗病毒藥物DAA（direct-acting antiviral agents）和具有非病毒靶點(diǎn)的藥物（CypA抑制劑、IFN-λ、疫苗治療），HCV治療領(lǐng)域發(fā)生了巨大變化。鑒于這些藥物具有更高的安全性和抗病毒效力，其用于治療HCV的感染正在形成趨勢(shì)［32］。

3 CypA在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染中的作用

HBV是一種DNA病毒，目前發(fā)現(xiàn)只有人和猩猩對(duì)HBV有易感性，能夠引發(fā)乙型病毒性肝炎疾病。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了CypA與HBV的小乙型肝炎病毒表面抗原SHBs（small hepatitis B virus sur?face，SHBs）間的互作情況，而人肝癌細(xì)胞系中SHBs的表達(dá)能顯著促進(jìn)CypA分泌。給小鼠注射HBVSHBs后，隨著小鼠炎癥浸潤(rùn)程度的加劇，其血清中CypA水平也隨之增加，而使用CsA處理的炎癥應(yīng)答反應(yīng)與之相比較低［33］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBV表面抗原陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)CypA蛋白水平有所下降，而過表達(dá)乙肝表面抗原HBsAg（hhepatitis B sur?face antigen，HBsAg）細(xì)胞的培養(yǎng)基上清中，可以檢測(cè)到高水平的CypA，提示HBsAg陽(yáng)性細(xì)胞中的Cy?pA可能分泌至細(xì)胞上清［33］。利用Hex 8.0.0軟件進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)化合物HBF-0259與已知參與HBV組裝的細(xì)胞因子和HBsAg分泌因子之間的相互作用發(fā)現(xiàn)，HBF-0259與CypA間存在相互作用，并且參與HBsAg分泌及HBV整合過程［34］。此外，研究表明非免疫抑制劑ALV通過抑制肝細(xì)胞系中CypA的表達(dá)，進(jìn)而抑制HBV的DNA復(fù)制及HBsAg的產(chǎn)生和分泌［35］。NKONGOLO等［36］發(fā)現(xiàn)CsA通過與鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接結(jié)合，并與介導(dǎo)病毒進(jìn)入的前S1蛋白（preS1）結(jié)構(gòu)域重疊，從而抑制HBV的進(jìn)入，且CsA通過CypA發(fā)揮免疫抑制作用。共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）分子的清除是未來治療HBV的主要挑戰(zhàn)，因此，宿主分子如TLR7（Toll-like receptors 7，TLR7）和CypA已成為預(yù)防HBV侵入和復(fù)制的潛在靶點(diǎn)［37］。

4 CypA在流感病毒（influenza virus，IV）感染中的作用

流行性感冒病毒簡(jiǎn)稱流感病毒，是一種造成人類及其他動(dòng)物患流行性感冒的病毒。有報(bào)道證實(shí)CypA可被包裝到IV粒子中，早期研究發(fā)現(xiàn)，CypA既不影響病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，也不影響病毒mRNA的出核，但卻在IV復(fù)制的蛋白水平上有明顯抑制效果。例如，人的CypA可與IV的基質(zhì)蛋白1（matrix protein 1，M1）中間結(jié)構(gòu)域結(jié)合，通過影響新合成的M1蛋白入核，從而影響IV的早期復(fù)制。CsA在CypA缺失的情況下可抑制病毒mRNA的出核，而在CypA存在的情況下又可促進(jìn)CypA和M1蛋白的結(jié)合進(jìn)而影響病毒的復(fù)制［38］。CypA能夠通過泛素/蛋白酶體途徑促進(jìn)M1蛋白的降解從而抑制IV的復(fù)制［39］。MAHESUTIHAN等［40］證實(shí)CypA可通過E3泛素連接酶AIP4（atrophin-1 interacting protein 4）介導(dǎo)M1的K102和K104位點(diǎn)泛素化調(diào)控M1蛋白穩(wěn)定性。有趣的是，CypA對(duì)AIP4介導(dǎo)的M1以上兩個(gè)位點(diǎn)的泛素化還能抑制M1的出核過程，該結(jié)果進(jìn)一步解釋了CypA對(duì)M1的出核調(diào)控及復(fù)制機(jī)制。XU等［41］發(fā)現(xiàn)雞的CypA同樣具有抑制IV復(fù)制的作用。此外，LIU等［42］證實(shí)CypA還能通過調(diào)控RIG-Ⅰ（reti?noic acid inducible gene-Ⅰ）介導(dǎo)的Ⅰ型IFN的產(chǎn)生抑制IV的復(fù)制。

5 CypA在其他病毒感染中的作用

在感染輪狀病毒（rotavirus，RV）的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CypA與其非結(jié)構(gòu)蛋白5（nonstructural protein 5，NSP5）存在共定位，說明CypA可能被招募到RV病毒粒子中，并且發(fā)現(xiàn)CypA能通過其順反異構(gòu)酶活性抑制RV的復(fù)制［43］。HE等［44］證明CypA除了能夠與RV的結(jié)構(gòu)蛋白VP2（viral protein 2）相互作用外，還能通過促進(jìn)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生抑制RV復(fù)制，此過程不依賴CypA的PPIase活性，而是依賴于CypA對(duì)JNK（c-Jun N-terminal kinase）信號(hào)通路的激活。黃熱病毒（yellow fever virus，YFV）的復(fù)制同樣高度依賴宿主因子，YFV的非結(jié)構(gòu)蛋白4B（non-structural protein 4B，NS4B）參與病毒的復(fù)制和免疫逃逸，通過GST pull-down和LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)證實(shí)CypA與NS4B間存在相互作用，進(jìn)而調(diào)控YFV的復(fù)制［45］。人類冠狀病毒（human corona virus，HCoV）-NL63和HCoV-229E的復(fù)制也受CypA敲低或敲除的影響［46-47］。另外，CypA抑制劑CsA處理后能夠抑制多種CoV的復(fù)制［48］。WILDE等［48］通過對(duì)CsA等CypA抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)，CypA是巢式病毒復(fù)制的宿主因子，多種冠狀病毒和動(dòng)脈病毒的復(fù)制受極低濃度的CsA、ALV及NIM-811的抑制［47，49-50］。目前，ALV是臨床上最先進(jìn)的廣譜抗病毒藥物，其通過靶向宿主蛋白CypA發(fā)揮作用。在組織培養(yǎng)中觀察到ALV對(duì)makona埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）表現(xiàn)出輕微的抗病毒作用，與許多其他對(duì)人類有致病性的病毒相比，EB?OV的復(fù)制不依賴于CypA［51］。研究發(fā)現(xiàn)，感染人巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）后，CypA表達(dá)上調(diào)并向細(xì)胞外分泌，作為CypA胞外受體，CD147（cluster of differentiation 147，CD147）通過Cy?pA-CD147-ERK（extracellular regulated protein kinas?es）調(diào)控核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的激活及IFN-β的產(chǎn)生，從而介導(dǎo)抗病毒反應(yīng)［52］。隨后，ABDULLAH等［53］發(fā)現(xiàn)CsA在HCMV發(fā)病機(jī)制中具有雙重作用，一方面，CsA可通過抑制T細(xì)胞功能參與病毒復(fù)制，另一方面，其還參與由反式激活因子IE2（immediate early 2）介導(dǎo)的抗巨細(xì)胞病毒作用，以上兩個(gè)過程中均有CypA參與。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)CypA的方法研究CypA對(duì)新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）復(fù)制增殖的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，CypA過表達(dá)可抑制NDV的復(fù)制和增殖，且NDV感染后CypA表達(dá)上調(diào)，說明在NDV感染過程中Cy?pA起負(fù)調(diào)節(jié)作用［54］。通過檢測(cè)110位因EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）感染而患鼻咽癌的患者血清發(fā)現(xiàn)，CypA的mRNA和蛋白水平顯著高于正常人，提示CypA與鼻咽癌標(biāo)志物EBV-VCA-IgA聯(lián)合分析將提高鼻咽癌的診斷準(zhǔn)確度［55］。

6 總結(jié)與展望

體外研究表明許多DNA或RNA病毒感染宿主細(xì)胞后可誘導(dǎo)CypA表達(dá)，一方面，CypA可能通過蛋白質(zhì)的折疊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥等過程參與免疫應(yīng)答，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；另一方面，CypA在部分病毒的復(fù)制過程中與病毒蛋白互作，參與病毒入核及病毒復(fù)制等多個(gè)過程。

雖已證實(shí)CypA在病毒感染中發(fā)揮重要作用，但仍有許多問題有待深入研究，如在病毒感染后，介導(dǎo)CypA變化的關(guān)鍵病毒蛋白有哪些；細(xì)胞感染病毒后CypA的表達(dá)變化及機(jī)制還有待進(jìn)一步探索；在天然免疫中，不同病毒感染后CypA既參與對(duì)I型干擾素的調(diào)控，又參與病毒復(fù)制過程，而CypA在兩者間的動(dòng)態(tài)平衡過程中發(fā)揮何種作用尚不明確；以及CypA是否可通過干預(yù)病毒復(fù)制而成為一種新的抗病毒靶點(diǎn)藥物也有待深入研究。