腹瀉型腸易激綜合征中醫(yī)病證結(jié)合動物模型研究?

楊清瑞， 胡澤玉， 杜曉泉， 周 鋮， 劉海濤

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種以腸功能紊亂為主的臨床綜合征，主要特征為腹部疼痛不適反復(fù)發(fā)作，常伴隨糞便性狀和排便習(xí)慣的改變[1]。建立有效且擬合臨床度高的腸易激綜合征中醫(yī)證候動物模型，可以為本病的中醫(yī)藥治療及相關(guān)科研提供重要幫助。目前IBS動物模型的相關(guān)研究尚處于探索階段,造模方法尚不成熟,缺乏統(tǒng)一公認的復(fù)制方法。動物模型能否充分反映IBS的疾病特性，決定了研究結(jié)果的準確性及合理性。因此，為探究腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome, IBS-D)中醫(yī)病證結(jié)合動物模型復(fù)制方法，遂整理分析現(xiàn)有中醫(yī)證候模型復(fù)制方法的文獻，將切實可行的復(fù)制方法詳述，以期在IBS-D中醫(yī)證候動物模型的選擇方面為本領(lǐng)域研究者提供有效參考。

1 動物模型造模思路概述

目前，腸易激綜合征的病因及發(fā)病機制尚不清楚。最新的共識指南認為，主要與內(nèi)臟高敏感、腸-腦互動異常、腸道動力異常、胃腸道激素、腸道感染、腸道微生物、精神心理障礙以及遺傳和飲食等多種因素相關(guān)[2]。在臨床根據(jù)排便特點和糞便形狀，可將IBS分為腹瀉型、便秘型、混合型、未定型[3]。根據(jù)IBS的主要癥狀，其屬于中醫(yī)學(xué)“腹痛”“泄瀉”“便秘”等范疇。同時，根據(jù)《腸易激綜合征中醫(yī)診療專家共識意見(2017)》[4]，將IBS-D分為肝郁脾虛證、脾腎陽虛證、寒熱錯雜證、脾虛濕盛證、脾胃濕熱證5種證型。近年來，諸多學(xué)者為IBS病證結(jié)合動物模型的構(gòu)建和評價奠定了大量理論與實踐基礎(chǔ),促進了IBS病證結(jié)合動物模型的發(fā)展。目前，已有的腸易激綜合征腹瀉型中醫(yī)病證結(jié)合動物模型的復(fù)制方法有肝郁脾虛型、脾胃濕熱型、脾胃虛寒型、脾腎陽虛型，其構(gòu)建方法主要是在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病動物模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合情志與證候多因素制備而成，即分別復(fù)制出IBS動物模型和中醫(yī)證候動物模型，疊加之后形成“病證結(jié)合”的腸易激綜合征中醫(yī)證候動物模型。

2 IBS-D模型常用復(fù)制方法及評價指標

2.1 IBS-D模型常用復(fù)制方法

常用的IBS腹瀉型動物模型構(gòu)建方法有早期生活應(yīng)激、直結(jié)腸球囊擴張、化學(xué)藥物刺激、病原體感染、復(fù)合方法及其他方法等，現(xiàn)將幾種常用的IBS模型復(fù)制方法介紹如下。

2.1.1 束縛應(yīng)激(wrap restraint stress,WRS) 使用包裹局部約束壓力(WRS)程序誘發(fā)壓力。先用異氟烷麻醉大鼠，然后用膠帶束縛大鼠的前上肢和胸部2 h，每天1次[5]。

2.1.2 直結(jié)腸球囊擴張(colorectal distension,CRD) 對出生第8天的乳鼠進行直結(jié)腸球囊擴張刺激,向血管成形術(shù)的球囊(2 cm×0.3 cm)中注入0.3 mL的水，施加等同于60 mmHg的壓力刺激1 min,每天2次(相隔30 min),共刺激2周[6]。

2.1.3 旋毛蟲感染(Trichinization) 將含有旋毛蟲感染的大鼠肌肉切碎后置于37 ℃的消化液(含有1%胃蛋白酶A和1%HCl)中16 h。經(jīng)篩過濾、分離的感染幼蟲用0.85%NaCl洗滌幾次后，給予造模組大鼠0.2 mL懸液(含有8000個幼蟲)灌胃[7]。

2.1.4 乙酸灌腸 給予大鼠乙醚輕微麻醉(吸入30 s)后，在肛內(nèi)8 cm處滴注1 mL4%乙酸30 s，然后再滴入1 mL磷酸鹽緩沖鹽水稀釋乙酸并沖洗結(jié)腸[8]。

2.1.5 母嬰分離(maternal separation,MS) 將出生第2～14天的幼鼠與母鼠分離，放入盒中(規(guī)格5 cm×15 cm，溫度32.0 ℃±0.5 ℃)獨處3 h,結(jié)束后放回母鼠籠中,每日1次，連續(xù)造模14 d[9]。

2.1.6 急慢性應(yīng)激法 給予大鼠以下刺激：水平振動(120次/min)40 min；禁食24 h；禁水24 h；4 ℃環(huán)境3 min；45 ℃環(huán)境5 min；夜間連續(xù)照明12 h；夾尾1 min。隨機給予模型組上述刺激,且連續(xù)2 d給予刺激順序不能相同,連續(xù)3周。同時給予紙帶束縛前肩、前上肢和胸部,限制前上肢搔抓頭面部,但不限制其活動,束縛1h[10]。

2.2 IBS模型評價指標

IBS模型的觀測評價指標主要包括腹部撤回反射和胃腸動力的測定，具體評分標準如下。

2.2.1 腹部撤回反射(abdominal withdrawal reflex,AWR) 在直結(jié)腸球囊擴張(CRD)下進行評估。評分標準參考文獻[11]：對CRD無反應(yīng)計0分；身體保持靜止或頭部輕微移動計1分；腹肌收縮計2分；壁從底部抬起并明顯收縮計3分；身體拱起以及骨盆和陰囊的抬高計4分，進行相同的壓力刺激3次，將平均分數(shù)作為最終分數(shù)。

2.2.2 胃腸動力的測定 在禁食不禁水24 h后,按照10 mL/kg的劑量給予大鼠活性碳墨水灌胃。30 min后用頸脫位法處死大鼠，立即取出整個小腸,剪切過程中不能拉伸。浸入5%福爾馬林液以終止蠕動,然后測量活性碳墨水行進的距離以及小腸的總長度。用活性碳墨水染黑腸管長度/總腸管長度的比例(%)以評估胃腸動力[12]。

3 IBS-D中醫(yī)證候動物模型復(fù)制方法及模型評價

3.1 肝郁脾虛型IBS-D動物模型復(fù)制方法

3.1.1 母子分離+慢性束縛+番瀉葉灌胃法 張北華[13]和趙迎盼等[14]通過動物實驗對3種造模方法進行了比較，最終研究表明，母子分離8周+慢性束縛應(yīng)激3周+番瀉葉灌胃1周為最佳的肝郁脾虛證IBS-D大鼠模型，并分為以下3步：(1)幼鼠出生后第2～14天，每天母子分離3 h后放回母鼠籠中。到第22天斷奶，第30天隨機分籠飼養(yǎng)，至8周后體質(zhì)量超過250 g者進入下一步造模；(2)從第9周開始，每天在自制束縛架上黏貼軟帶束縛大鼠胸部和腹部3 h，連續(xù)3周；(3)束縛應(yīng)激的同時，每天給予番瀉葉水煎劑(濃度0.45 g生藥/mL，劑量4.5 g/kg)灌胃，每日1次，持續(xù)1周。

3.1.2 番瀉葉灌胃+慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激法 羅丹妮等[15]采用番瀉葉浸劑灌胃結(jié)合慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激(hronic unpredictable mild stress,CUMS)造模方式：(1)給予番瀉葉浸劑(濃度0.3 g/mL，劑量10 mL/kg)灌胃；(2)灌胃1 h后隨機(抓鬮分配法)進行多種慢性不可預(yù)見性刺激，包括束縛(固定于木制大鼠束縛固定器上2 h)、夾尾20 min、搖擺-擁擠(1 min內(nèi)220次,時長1 h，每籠6只)、45 ℃溫水游泳(5～10 min,當大鼠無力游動時立即撈出)、足底電擊(電流1.5 mA,15 min內(nèi)3次,每次30 s)、擁擠飼養(yǎng)24 h(6只大鼠)、孤養(yǎng)24 h，連續(xù)造模14 d。

3.1.3 饑飽失常+番瀉葉灌胃+游泳實驗法 郭紅[16]采用這種方法在禁食12 h(不禁水)后給予大鼠灌胃番瀉葉顆粒劑(濃度0.4 g/kg，劑量1 mL/100 g)；在灌胃1 h后強迫游泳(水溫22 ℃～25 ℃,水深70 cm)，直到大鼠無力游動(頭部沉入水中超過10 s)才撈出，連續(xù)造模14 d。

3.1.4 番瀉葉灌胃+束縛應(yīng)激法 郭軍雄[17]采用以下方法：各組造模大鼠在實驗前10 h禁食不禁水，按照4 g/kg劑量分別給予番瀉葉煎劑灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃7、14、21 d。采用透明寬膠帶束縛大鼠的前肢、胸部和腹部，限制其搔抓頭面部(但不限制其活動)，束縛1 h,每天1次，分別束縛7、14、21 d。

3.2 脾胃濕熱型IBS-D動物模型復(fù)制方法

3.2.1 慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激+高糖高脂飼料喂養(yǎng)法 文獻[18-20]采用以下方法：(1)先將大鼠放入高溫高濕環(huán)境造模箱(溫度(32±2) ℃,相對濕度90%～95%)中，給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)7 d；第15天時給予白酒(酒精度56%，劑量10 mL/kg)灌胃，每天1次，共7 d。與此同時隨機進行多種慢性不可預(yù)見性刺激，包括夜間連續(xù)照明12 h，水平振蕩(160次/min)45 min，禁食禁水24 h，(2)45 ℃環(huán)境5 min，夾尾1 min，4 ℃冰水游泳3 min。每日隨機給予模型組上述刺激,并每連續(xù)2 d給予刺激且順序不能相同,持續(xù)造模21 d。

3.3 脾胃虛寒型IBS-D動物模型復(fù)制方法

3.3.1 番瀉葉灌胃+束縛應(yīng)激法 文獻[21，22]采用以下方法：(1)禁食不禁水10 h后給予大鼠番瀉葉水煎劑(濃度0.3 g生藥/mL，劑量20 mL/kg)灌胃，每天1次，連續(xù)14 d；(2)灌胃結(jié)束后用繩束縛住大鼠的后下肢1 h,每天1次，連續(xù)14 d。

3.4 脾腎陽虛型IBS-D動物模型復(fù)制方法

3.4.1 番瀉葉灌胃+物理化學(xué)刺激法 文獻[23-26]采用以下方法共分為4步:(1)冰醋酸灌腸。用石蠟潤滑后的導(dǎo)管插入大鼠肛門內(nèi)3～5 cm處，注入0.5%冰醋酸(首劑0.2 mL，每天增加0.1 mL，至0.5 mL時保持不變)，然后倒置大鼠1 min以防漏出，每天1次，連續(xù)14 d；(2)直腸擴張。將涂抹石蠟油的兒童型導(dǎo)尿管球囊塞入肛門內(nèi)2～3 cm處，用5 mL注射器向球囊內(nèi)充氣(每天2次，每次充氣1.5～2.0 mL，間斷持續(xù)3～5 min)，連續(xù)14 d；(3)夾尾刺激。間斷持續(xù)3～5 min，每天2次，持續(xù)2周；(4)疊加脾腎陽虛證模型，給予番瀉葉濃縮劑(濃度0.3～0.5 g/mL，劑量20 mL/kg)灌胃，每天1次，持續(xù)4周。

3.4.2 番瀉葉灌胃+避水應(yīng)激法 侯理偉[27]和朱佳杰[28]采用以下這種方法：給予番瀉葉濃縮劑(濃度1 g/mL，劑量10 mL/kg)灌胃，每天1次，持續(xù)28 d。4周后給予避水應(yīng)激，取一個玻璃水槽(60 cm×30 cm×40 cm),中央有個小平臺(10 cm×10 cm×10 cm)，水槽內(nèi)注水9 cm,每天將大鼠置于平臺上2 h，連續(xù)10 d。

3.4.3 番瀉葉灌胃+直腸擴張法 韓博宇[29]通過對3種造模方法進行動物實驗對比，結(jié)果表明高劑量番瀉葉灌胃6周+直腸擴張法為最佳的脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型。給予大鼠番瀉葉濃縮劑(濃度1 g/mL，劑量5 g/kg)灌胃，每天1次，連續(xù)6周。將涂抹石蠟油的自制球囊插入距肛緣約7 cm處，然后將大鼠置于自制小籠中使其不得轉(zhuǎn)頭,給予直結(jié)腸球囊擴張(壓力80 mmHg，每天2次，每次間斷持續(xù)5 min)，連續(xù)14 d。

3.4.4 番瀉葉灌胃+束縛應(yīng)激法 譚瑋璐[30]和武志娟等[31]采用以下方法：(1)禁食24 h(不禁水)后給予大鼠番瀉葉溶液(濃度200%，劑量20 mL/kg)灌胃，每天2次，連續(xù)14 d；(2)灌胃1 h后，用透明膠帶束縛大鼠的前肢、肩部和胸部1 h，限制其搔抓頭面部(但不限制其他活動)，每天1次，連續(xù)14 d。

3.5 IBS-D中醫(yī)證候模型評價

IBS-D中醫(yī)證候模型的宏觀評價指標，主要記錄大鼠每天的精神狀態(tài)、活動情況、進食、皮毛色澤、口唇黏膜、體質(zhì)量變化、糞便性狀等一般狀態(tài)。

3.5.1 肝郁脾虛證 各模型組大鼠神態(tài)倦怠易激惹，防御性強，毛發(fā)干枯散亂無光澤，消瘦，食欲減退，活動減少，反應(yīng)遲緩，扎堆或蟄伏在角落，多數(shù)弓背靜臥少動，眼角有分泌物，大便變軟或不成形，肛門部有糞便污物附著等，類似中醫(yī)肝郁脾虛表現(xiàn)[13-15,17]。

3.5.2 脾胃虛寒證 造模后大鼠初期表現(xiàn)為極度煩躁,尖叫易怒，后來開始腹瀉、毛發(fā)無光澤、消瘦、活動減少、精神萎靡，類似中醫(yī)脾胃虛寒表現(xiàn)[22]。

3.5.3 脾胃濕熱證 造模后IBS模型組大鼠易激惹，糖水攝取量明顯減少，大鼠精神倦怠，萎靡不振，反應(yīng)遲鈍，嗜臥，活動減少，大便稀或溏泄,肛周污穢，皮毛枯槁無光澤,豎毛，飲食量下降，體質(zhì)量增長緩慢，類似中醫(yī)脾胃濕熱表現(xiàn)[19]。

3.5.4 脾腎陽虛證 造模后大鼠的活動開始減少，精神倦怠；隨著時間延長，出現(xiàn)萎靡不振，蜷臥貼籠，拱背，扎堆，大鼠洗臉、舔足、理毛的動作減少，皮毛發(fā)黃少光澤，胡須下垂，活動量少，反應(yīng)遲緩，體質(zhì)量下降，飲水增多，進食減少，排便次數(shù)增多，肛周糞便污物附著[23,27，28]。

4 討論

腹瀉型腸易激綜合征中醫(yī)病證結(jié)合動物模型是西醫(yī)辨病和中醫(yī)辨證相結(jié)合的復(fù)合模型，其本質(zhì)是模擬臨床中西醫(yī)結(jié)合模型，是目前較為符合臨床的一種中醫(yī)證候動物模型復(fù)制方法。當前IBS中醫(yī)病證結(jié)合動物模型復(fù)制方法主要分2種，一是先構(gòu)建IBS模型,在此基礎(chǔ)上再復(fù)制中醫(yī)證型模型；二是先復(fù)制中醫(yī)證型，在此基礎(chǔ)上再構(gòu)建IBS模型。

雖然這些模型的復(fù)制方法同時兼顧IBS的西醫(yī)病理表現(xiàn)和中醫(yī)證候的病機特征，有利于研究疾病不同證型宏觀與微觀的具體生物學(xué)表現(xiàn)，為中醫(yī)藥治療疾病提供客觀化證據(jù)，但仍有一些地方有待商榷。如在IBS中醫(yī)證候模型的復(fù)制過程中，不同的中醫(yī)證型使用相同或相似的造模方法，容易造成臟腑兼證候的混淆。筆者所納入的文獻研究中，肝郁脾虛型[17]、脾胃虛寒型[21，22]和脾腎陽虛型[30，31]IBS動物模型的復(fù)制方法都有使用番瀉葉灌胃聯(lián)合束縛應(yīng)激的復(fù)合造模法，雖然造模藥物的用量及用法有所不同，慢性應(yīng)激刺激的強度也不一樣，但也很難判定復(fù)制的IBS動物模型中醫(yī)證候的真實屬性。在中醫(yī)證候模型的評價指標中，僅以宏觀體征和行為表現(xiàn)中包含的中醫(yī)證候臨床表現(xiàn)為判定依據(jù)，使得中醫(yī)證候模型的評價標準不夠客觀和科學(xué)，不但影響了中醫(yī)證候建模率和后續(xù)實驗的進展，還降低了造模方法可復(fù)制性，實驗結(jié)果難以得到其他學(xué)者的認可和推廣。

鑒于此，有學(xué)者[32]提出從生物代謝的視角來認識中醫(yī)藥的現(xiàn)代內(nèi)涵，通過代謝組學(xué)的研究方法獲取人體內(nèi)動態(tài)代謝變化的綜合信息，從而提供中醫(yī)證候的量化證據(jù)并闡明中醫(yī)藥的機理。

因此，后續(xù)開展的中醫(yī)實驗研究可以從多途徑探索機體與內(nèi)外環(huán)境之間的整體性規(guī)律，進而建立起病證結(jié)合動物模型客觀、準確的評判標準和體系，并探索更加科學(xué)合理的中醫(yī)證候與動物模型相結(jié)合的方法，為中醫(yī)藥治療腹瀉型腸易激綜合征的實驗研究提供更有效的工具。