不同水凝膠支架材料用于軟骨損傷修復(fù)研究進(jìn)展

陳有榮 顏昕 葉景 原福貞 官劍 宋士堂 王星 余家闊

1 北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，北京大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)傷病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100191）

2 中國科學(xué)院化學(xué)研究所高分子物理與化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100190）

3 中國科學(xué)院大學(xué)（北京100049）

運(yùn)動(dòng)相關(guān)外傷或退行性變均可導(dǎo)致軟骨損傷，由于軟骨無血管、無神經(jīng)、無淋巴管、低代謝率、非動(dòng)態(tài)性和低細(xì)胞密度的特性，軟骨損傷發(fā)生后難以自我修復(fù)。目前，臨床治療方法主要包括關(guān)節(jié)鏡清理、軟骨磨削成形、骨髓刺激技術(shù)、自體或同種異體骨軟骨移植、自體軟骨細(xì)胞移植、金屬或硅橡膠移植局部替代等，但以上治療方法存在不能逆轉(zhuǎn)軟骨退變、纖維軟骨再生、供區(qū)并發(fā)癥、免疫排斥、假體松動(dòng)、關(guān)節(jié)感染等缺點(diǎn)，使軟骨修復(fù)不能達(dá)到滿意的治療效果[1]。組織工程技術(shù)為軟骨損傷提供了一種很有希望的治療策略。水凝膠作為一種典型的生物材料，具有類似于人體軟組織結(jié)構(gòu)、高含水量和良好生物相容性等特征，可為組織再生提供富含水的三維聚合物網(wǎng)絡(luò)，用于輸送種子細(xì)胞、生長因子、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物。同時(shí)，還可以根據(jù)特殊需要，使用物理或化學(xué)交聯(lián)方法、聚合物種類、不同分子的摻入，調(diào)節(jié)水凝膠的溶脹率、降解率、孔隙率、生物相容性、力學(xué)強(qiáng)度等性能進(jìn)行定制。近些年來，水凝膠被廣泛作為細(xì)胞/生長因子載體的組織工程支架用來促進(jìn)軟骨修復(fù)再生或用作永久性的植入物來代替受損的軟骨，具有修復(fù)大面積組織缺損、避免供體并發(fā)癥和兩期侵襲性手術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并顯示出較好的軟骨修復(fù)效果[2]。根據(jù)水凝膠組成的來源，水凝膠可分為天然聚合物、合成聚合物和混合聚合物。本文主要就近些年來用于軟骨病損修復(fù)中常用的水凝膠種類、軟骨再生情況及各自優(yōu)缺點(diǎn)等進(jìn)行綜述，并對(duì)水凝膠的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀及后續(xù)研究方向進(jìn)行分析探討。

1 天然聚合物水凝膠用于軟骨損傷修復(fù)研究進(jìn)展

動(dòng)物和植物是天然聚合物水凝膠的主要來源，主要有瓊脂糖、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、明膠、膠原蛋白、殼聚糖（chitosan，CHI）、藻酸鹽、絲素、纖維蛋白等。這些聚合物具有與軟骨相似的生化特性，已被證實(shí)可在體外提供適宜的微環(huán)境來維持軟骨細(xì)胞的表型，在緩慢降解的同時(shí)，持續(xù)支持軟骨再生[3]。

1.1 瓊脂糖

瓊脂糖是一種多糖，呈白色粉末狀，通常從海藻中分離獲得，含有1，4連結(jié)的3，6-內(nèi)醚-L-半乳糖和1，3連結(jié)的β-D-半乳糖的交替重復(fù)單位。瓊脂糖具有加熱后溶解性增加、與冷介質(zhì)混合后形成凝膠、能有效包封細(xì)胞等優(yōu)良性能，其功能特性與天然關(guān)節(jié)軟骨非常相似[4]。在一項(xiàng)研究中，將載有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchemal stem cells，BMMSCs）或軟骨細(xì)胞的瓊脂糖水凝膠植入骨軟骨缺損中，結(jié)果顯示修復(fù)組織中含有較多的蛋白多糖和膠原[5]。然而，瓊脂糖在植入后可能會(huì)觸發(fā)免疫反應(yīng)，由于缺乏合適的酶降解體系，在體內(nèi)不能生物降解。同時(shí)，瓊脂糖凝膠的組成、力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)很難定制，這阻礙了其作為組織工程軟骨支架的廣泛應(yīng)用[6]。

1.2 膠原蛋白

膠原蛋白是一種常見的天然聚合物，廣泛存在于皮膚、骨骼、軟骨、血管、椎間盤、韌帶和肌腱等組織中，是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的重要組成部分。膠原蛋白具有低免疫原性、生物可降解性、生物相容性和細(xì)胞黏附性等突出的生物學(xué)特性，被廣泛應(yīng)用于軟骨再生。在含有Ⅰ型和Ⅱ型膠原的混合水凝膠中，軟骨細(xì)胞保持良好的細(xì)胞形態(tài)，并分泌軟骨特異性ECM，通過調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原的含量可使水凝膠的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)達(dá)到最優(yōu)[7]。然而，機(jī)械強(qiáng)度弱、降解速度快是膠原蛋白的主要缺點(diǎn)。核黃素是一種生物相容性維生素B2，常作為無毒的交聯(lián)劑使用，通過紫外照射可明顯改善膠原蛋白水凝膠的力學(xué)性能、延長酶促降解時(shí)間。使用核黃素作為交聯(lián)劑，經(jīng)光誘導(dǎo)獲得交聯(lián)的膠原水凝膠，包裹成纖維軟骨細(xì)胞并經(jīng)一定時(shí)間的體外培養(yǎng)，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因表達(dá)水平明顯升高[8]。在另一項(xiàng)研究中，膠原自組裝、硫酸軟骨素和HA 交聯(lián)制備的復(fù)合水凝膠模擬了天然軟骨的組成和功能，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明成功實(shí)現(xiàn)了軟骨的修復(fù)[9]。

1.3 透明質(zhì)酸

HA是由N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸組成的二糖單元。它廣泛分布于人體，包括皮膚、晶狀體和軟骨的ECM 中。作為ECM 的主要成分之一，HA 在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、傷口愈合、關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)和其他生理過程中起著重要作用。因此，HA水凝膠可直接作為軟骨組織工程的支架材料[10]。HA 通過減輕炎癥和抑制分解代謝酶來保護(hù)軟骨細(xì)胞和ECM，同時(shí)通過刺激干細(xì)胞增殖和分化、上調(diào)基質(zhì)蛋白的合成促進(jìn)軟骨再生，維持軟骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。硫酸化的HA 在體內(nèi)外均表現(xiàn)出明顯的降解速率變緩、促進(jìn)軟骨形成，并抑制被包裹的MSCs 肥大老化，同時(shí)還可以避免動(dòng)物骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的軟骨磨損和肥大[11]。一種含有小分子藥物軟骨生成素（kartogenin，KGN）的可注射甲基丙烯酸酐（methacrylic anhydride，MA）修飾的HA水凝膠被證明具有良好的原位成膠及軟骨缺損修復(fù)能力[12]。目前，基于HA 的醫(yī)用水凝膠已經(jīng)商品化，注射用Sinovial?（其他商品名:Yaral?，Intragel?）的有效活性成分為低分子量HA，是OA患者緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)功能的增粘劑[13]。然而，HA也有一些局限性，例如力學(xué)強(qiáng)度低，同時(shí)由于基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的降解作用，HA的使用壽命短。

1.4 明膠

明膠源于動(dòng)物膠原蛋白，通過膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)解體而成，是結(jié)締組織的主要成分。明膠凝膠在30 ℃～40 ℃的水溶液中發(fā)生熱可逆變化，是制造軟骨組織工程支架的理想材料。為提高水凝膠的抗壓強(qiáng)度，研究者引入微纖化纖維素和高碘酸鹽制備了明膠水凝膠，復(fù)合水凝膠的楊氏模量可達(dá)1.6 MPa以上，是純明膠的41 倍，該復(fù)合支架還表現(xiàn)出良好的抗溶脹能力，能夠在緩沖液中保持其形狀[14]。將己二酸二酰肼（adipic acid dihydrazide，ADH）接枝到硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）和明膠上，分別得到CS-ADH和明膠-ADH。經(jīng)1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcar?bodiimide hydrochloride，EDC]介導(dǎo)的后續(xù)反應(yīng)，獲得了具有良好生物相容性的原位明膠-CS 水凝膠，研究者認(rèn)為該水凝膠具有應(yīng)用于軟骨組織工程中的潛力[15]。明膠微球作為一種不同于明膠水凝膠的形態(tài)，可以負(fù)載生長因子并嵌入大孔水凝膠中，明膠在體內(nèi)生物降解時(shí)生長因子的緩慢釋放為MSCs 的成軟骨分化提供了良好的微環(huán)境[16]。

1.5 蠶絲

蠶絲是由絲心蛋白和絲膠蛋白組成的天然纖維。絲心蛋白具有力學(xué)性能佳、降解速度慢、生物相容性好等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，通過添加酸、離子和其他添加劑，可以使絲素溶液凝膠化獲得絲素水凝膠。絲素水凝膠可提供獨(dú)特的親水中性微環(huán)境，與明膠等生物聚合物共混，能改善生化和力學(xué)性能，支持軟骨細(xì)胞的附著、增殖和維持軟骨細(xì)胞的球形形態(tài)，增加軟骨細(xì)胞的軟骨表型表達(dá)[17]。Li等開發(fā)了一種絲素蛋白和羧甲基殼聚糖的復(fù)合水凝膠，其具有良好的生物相容性、可調(diào)的生物力學(xué)性能和降解速度，能有效促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞的黏附、增殖及糖胺聚糖的合成[18]。通過在絲素蛋白水凝膠中加入富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）可獲得一種緩釋生長因子，適用于3D 打印的生物墨水，由此制得的水凝膠支架能最大程度地增加膠原和糖胺聚糖的分泌，是軟骨組織工程潛在的候選材料[19]。

1.6 纖維蛋白

目前，商品化的纖維蛋白由凝血酶和纖維蛋白原組成，凝血酶和纖維蛋白原從含有少量纖維結(jié)合蛋白和其他生物分子的血漿中冷沉淀而來，為降低免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，通常從自體血液中提取[20]。將去分化的軟骨細(xì)胞與含有轉(zhuǎn)化生子因子-β3（transforming growth factor-β3，TGF-β3）的纖維蛋白水凝膠復(fù)合后體外培養(yǎng)，能明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞再分化及軟骨組織形成，體內(nèi)植入6周后提示透明軟骨成分再生[21]。Almeida等開發(fā)了一種含有軟骨ECM微粒、TGF-β3和MSCs的可注射纖維蛋白水凝膠，體外結(jié)果表明其糖胺聚糖和膠原蛋白分泌量明顯高于明膠微粒組，在體內(nèi)形成的組織與透明軟骨也更為相似[22]。纖維蛋白凝膠亦被用作OA患者自體軟骨細(xì)胞移植的三維載體支架，并發(fā)現(xiàn)高細(xì)胞密度組更能促進(jìn)蛋白聚糖和膠原蛋白基因的表達(dá)及高質(zhì)量軟骨樣組織的再生，但纖維蛋白凝膠的力學(xué)性能較差是其弱點(diǎn)[23]。

1.7 海藻酸鈉

海藻酸鈉（藻酸鹽）是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取一種天然多糖，由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannu?ronic，M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronic，G）按（1→4）鍵連接而成，能與Ca2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+等二價(jià)陽離子有效絡(luò)合，在水介質(zhì)中形成可逆的水凝膠。與其他蛋白質(zhì)或天然高分子材料相比，海藻酸鹽具有成本低、對(duì)細(xì)胞無毒、易于制備微球或三維多孔支架等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)藻酸鹽水凝膠還具有維持ECM 合成和軟骨細(xì)胞表型的能力，因此被廣泛作為軟骨組織工程的基質(zhì)材料[24]。除常規(guī)的海藻酸鹽外，氧化海藻酸鹽基水凝膠也常用于軟骨修復(fù)，雖然彈性模量低于正常海藻酸鹽基水凝膠，但氧化海藻酸鹽水凝膠具有更好的軟骨修復(fù)能力[25]。藻酸鹽基質(zhì)材料也被應(yīng)用于體內(nèi)軟骨修復(fù)。Cartipatch（法國，里昂，法國組織庫）是一種海藻酸-瓊脂糖混合水凝膠，它與自體軟骨細(xì)胞復(fù)合后植入體內(nèi)用于修復(fù)軟骨缺損，結(jié)果顯示，13例患者中的8例在術(shù)后24 個(gè)月的活組織檢查中出現(xiàn)了新的透明軟骨[26]。但另一項(xiàng)多中心隨機(jī)對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后2年隨訪時(shí)，Cartipatch 組的股骨局灶性骨軟骨缺損修復(fù)效果明顯差于自體骨軟骨移植組[27]。

1.8 殼聚糖（chitosan，CHI）

CHI，也被稱為β-（1，4）-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，是甲殼素N-脫乙酰基的產(chǎn)物。CHI廣泛存在于自然界，作為結(jié)締組織的主要成分，具有絡(luò)合、抑菌、吸收、抗炎、抗氧化等特性，由于CHI及其衍生物的獨(dú)特性質(zhì)，CHI 及其衍生物在基因治療、創(chuàng)面修復(fù)、組織工程等方面具有廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景，被認(rèn)為是潛在的軟骨修復(fù)材料[28]。以四乙氧基硅烷為交聯(lián)劑，制備含CHI 和聚乙烯醇[Poly（vinyl alcohol），PVA]的復(fù)合支架材料，通過改變CHI與PVA的摩爾比，可以調(diào)節(jié)支架的理化性質(zhì)，特別是拉伸強(qiáng)度和斷裂應(yīng)變，從而對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖產(chǎn)生不同的影響[29]。為了克服不溶于水的限制，研究者制備了結(jié)構(gòu)更為致密的水溶性N-琥珀酰殼聚糖-雙醛淀粉復(fù)合水凝膠，用于修復(fù)軟骨缺損[30]。一種基于殼聚糖和磷酸甘油的原位凝膠與血液的混合物（BST-CarGel，Biosyntech，Quebec，Canada）被用于修復(fù)大面積踝關(guān)節(jié)骨軟骨損傷，術(shù)后平均隨訪2年，踝關(guān)節(jié)預(yù)后評(píng)分有顯著改善[31]。

1.9 硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）

CS是結(jié)締組織、骨骼、韌帶、肌腱和軟骨ECM中的一種結(jié)構(gòu)成分，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺的不同硫酸化殘基通過β鍵連接的交替序列組成，通常從動(dòng)物組織中提取獲得，呈白色粉末狀。CS作為一種天然聚合物，具有抗炎活性，能有效促進(jìn)蛋白多糖和透明質(zhì)酸的合成、降低軟骨細(xì)胞的分解代謝活性、增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的特異性基因表達(dá)、抑制蛋白水解酶的合成，通過單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用葡萄糖胺能明顯減輕OA 癥狀[32]。目前，由其制備的水凝膠被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建組織工程軟骨。將低分子量肝素（low-molecular-weight heparin，LMWH）加入羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）-氧化硫酸軟骨素（oxidized chondroi?tin sulfate，OCS）（CMC-OCS）水凝膠中，負(fù)載TGF-β3作為PB-MSCs的基質(zhì)，構(gòu)建組織工程軟骨，體外培養(yǎng)2周后，軟骨特異性基因及蛋白的表達(dá)和分泌明顯增加[33]。Chen等在生理?xiàng)l件下使用辣根過氧化物酶和過氧化氫，成功開發(fā)了一種由羧甲基普魯蘭-酪胺（carboxy?methyl pullulan-tyramine，CMP-TA）和硫酸軟骨素-酪胺（chondroitin sulfate-tyramine，CS-TA）結(jié)合的可注射可降解水凝膠體系，用于軟骨組織工程。該水凝膠與豬耳軟骨細(xì)胞復(fù)合能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖及軟骨ECM沉積；將其置入小鼠皮下，組織學(xué)分析表明，水凝膠具有良好的組織相容性，并認(rèn)為該CMP-TA/CS-TA 復(fù)合水凝膠有望成為軟骨再生的良好生物材料支架[34]。

2 合成聚合物水凝膠用于軟骨損傷修復(fù)研究進(jìn)展

由天然高分子材料制備的水凝膠力學(xué)性能通常較差，限制了其作為承重支架材料的應(yīng)用。同時(shí)，使用動(dòng)物源性材料可能造成疾病傳播。與天然聚合物相比，合成聚合物在結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能以及組成方面具有良好的可控性，可以針對(duì)特定的應(yīng)用進(jìn)行定制，其化學(xué)性質(zhì)也更容易修改。此外，合成聚合物可以大批量生產(chǎn)，并提供比天然聚合物更多的可再生結(jié)果[35]。目前，大量的合成聚合物被廣泛應(yīng)用于軟骨再生，主要包括聚乙烯醇（PVA）、聚乙二醇[Poly（ethylene glycol），PEG]和低聚乙二醇富馬酸酯水凝膠{oligo [poly（ethylene gly?col）fumarate]，OPF}，均含有大量的羥基，在凝膠化過程中可以通過物理、離子或共價(jià)等方式進(jìn)行交聯(lián)[36-38]。

2.1 聚乙烯醇（PVA）

PVA水凝膠具有許多優(yōu)異的性能，包括力學(xué)性能、流體流動(dòng)性能和摩擦性能。研究人員使用PVA作為軟骨替代物，發(fā)現(xiàn)PVA 水凝膠在力學(xué)和結(jié)構(gòu)上與軟骨有相似之處，包括拉伸、剪切和壓縮模量以及滲透系數(shù)均與關(guān)節(jié)軟骨相似，PVA水凝膠也是研究關(guān)節(jié)軟骨腫脹、摩擦和潤滑特性的良好模型系統(tǒng)。它們的潤滑和摩擦行為也接近于關(guān)節(jié)軟骨，在摩擦系數(shù)相近的情況下，根據(jù)高載荷下的邊界潤滑模型和低載荷下的擠壓潤滑模型，將流體引導(dǎo)到接觸區(qū)[36]。彈性模量為1～5 MPa 的改性/未改性PVA水凝膠可被用于修復(fù)軟骨組織，由于PVA 不能生物降解，因此只能作為永久性軟骨替代物使用[39]。與其他水凝膠相比，盡管PVA 水凝膠的力學(xué)性能更接近于關(guān)節(jié)軟骨，但由于PVA 與周圍軟骨組織的整合能力欠佳，其作為軟骨替代品的應(yīng)用也受到限制。有研究指出，PVA 水凝膠經(jīng)CS 修飾后，具有可控的溶脹性，提高了水凝膠與軟骨的生化相似性，且容易被軟骨素酶降解[40]。

2.2 聚乙二醇（PEG）

PEG又稱聚環(huán)氧乙烷，易于修飾改性，被廣泛作為生物材料用于軟骨修復(fù)再生。多種種子細(xì)胞，如MSCs、胚胎干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，包裹在PEG水凝膠中，可通過生長因子誘導(dǎo)促進(jìn)軟骨形成[37，41]。Fu等證明聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PCL-PEG-PCL）膜能增強(qiáng)細(xì)胞的黏附和增殖能力，促進(jìn)軟骨缺損修復(fù)[42]。為了改善水凝膠的仿生特性，對(duì)PEG 大分子單體進(jìn)行改性，與純CS水凝膠相比，添加CS的PEG水凝膠能增加水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度，促進(jìn)其包裹的MSCs向軟骨細(xì)胞進(jìn)行分化，增加ECM 沉積[41]。聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG diacrylate，PEGDA）水凝膠已廣泛用于軟骨再生研究，一種基于PEGDA 纖維蛋白原的復(fù)合水凝膠（商業(yè)上稱為GelrinC）已被證明支持MSCs 的軟骨生成，同時(shí)能最大限度地減少細(xì)胞肥大，這表明通過設(shè)計(jì)復(fù)合水凝膠可提高軟骨再生的能力[43]。

2.3 低聚乙二醇富馬酸酯（OPF）

OPF 水凝膠是由富馬酸修飾PEG 大環(huán)形成的，具有可注射和光交聯(lián)特性，其壓縮模量可達(dá)到關(guān)節(jié)軟骨的大小。在家兔骨軟骨缺損模型中，無細(xì)胞的OPF 水凝膠促進(jìn)宿主MSCs 的遷移并誘導(dǎo)其向軟骨分化[38]。此外，這些水凝膠還能提高M(jìn)SCs形成再生軟骨的質(zhì)量[44]。OPF 水凝膠也被用于研究各種生長因子體外和體內(nèi)釋放對(duì)軟骨再生的影響[45]。

3 混合水凝膠用于軟骨損傷修復(fù)研究進(jìn)展

天然生物大分子及其衍生物具有良好的生物相容性和生物可降解性，但由其制備的水凝膠力學(xué)強(qiáng)度往往較弱。而合成聚合物水凝膠可以精確調(diào)控其結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能。混合水凝膠可以將天然和合成聚合物等不同類型水凝膠的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，并將它們的缺點(diǎn)最小化，從而制備適合用于軟骨修復(fù)的生物水凝膠。Peng等通過調(diào)節(jié)PVA 和殼聚糖（CHI）的比例設(shè)計(jì)了一種力學(xué)性能佳、理化性能穩(wěn)定、且具有良好孔隙率和含水量的新型PVA/CHI多孔水凝膠，將其與BM-MSCs復(fù)合能明顯促進(jìn)骨軟骨缺損的修復(fù)[46]。Su等采用定向凍融和電泳相結(jié)合的方法制備了具有各向異性和梯度力學(xué)性能的雙層PVA/羥基磷灰石復(fù)合水凝膠。PVA/羥基磷灰石復(fù)合水凝膠的排列孔結(jié)構(gòu)類似于天然關(guān)節(jié)軟骨的各向異性結(jié)構(gòu)。在兩層的界面處未觀察到明顯的內(nèi)應(yīng)力或缺陷。這種雙層水凝膠的梯度力學(xué)強(qiáng)度和雙細(xì)胞粘附特性使其有可能同時(shí)用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨[47]。Sargeant 等開發(fā)了一種由膠原蛋白和多臂PEG組成的可注射混合水凝膠體系。其中的膠原蛋白成分有利于細(xì)胞黏附，并能被酶降解；而多臂PEG成分具有胺化學(xué)反應(yīng)和可降解性能，同時(shí)還可結(jié)合蛋白質(zhì)/組織。該水凝膠表現(xiàn)出可調(diào)的力學(xué)性能、可變的溶脹度和合適的降解率，能作為可注射組織支架用于治療各種簡單和復(fù)雜的組織缺損。氨基葡萄糖（Glucos?amine，GA）作為糖胺聚糖生物合成的重要軟骨基質(zhì)前體，對(duì)軟骨再生具有積極作用[48]。Yao 等合成了GA 改性的PEG 水凝膠，并將BM-MSCs 包埋于該水凝膠中，在三維培養(yǎng)條件下GA 修飾的PEG 水凝膠促進(jìn)了BMMSCs向軟骨細(xì)胞分化及軟骨形成，且隨著氨基葡萄糖的增加，改性水凝膠在蛋白水平下調(diào)了軟骨纖維化和肥大標(biāo)志物的表達(dá)。因此，這可能是一種利用組織工程學(xué)方法進(jìn)行軟骨修復(fù)的新方法[49]。Guo 等制備了含有明膠微粒的OPF混合水凝膠，將其與BM-MSCs復(fù)合后置入骨軟骨缺損，12周后水凝膠部分降解，缺損區(qū)被新生組織填充，新形成的軟骨組織呈透明狀，且無持續(xù)炎性癥狀[50]。

4 水凝膠支架的先進(jìn)制備方法

4.1 微流控加工方法

微流控生物加工方法被廣泛用于制備具有梯度結(jié)構(gòu)的水凝膠支架。在光交聯(lián)之前，前體溶液先由被動(dòng)泵引導(dǎo)向前流動(dòng)，然后通過蒸發(fā)引導(dǎo)向后流動(dòng)，從而形成基于材料/種子細(xì)胞/生長因子的梯度水凝膠支架，這種梯度支架可能有利于恢復(fù)骨軟骨和軟骨組織的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和生物功能。該方法簡單而常用，可較為容易地制造出簡單幾何結(jié)構(gòu)和小尺寸的水凝膠組織工程支架，但在制備具有復(fù)雜三維解剖結(jié)構(gòu)的支架時(shí)仍有一定的難度[51]。

4.2 3D模鑄成型

Mesallati 等對(duì)股骨髁和（或）脛骨平臺(tái)進(jìn)行三維醫(yī)學(xué)成像、建模、逆向模具設(shè)計(jì)、制造，獲得模具，然后將海藻酸水凝膠前體溶液與軟骨細(xì)胞、MSCs混合后注入預(yù)先制備的模具中，待充分成膠獲得了具有膝關(guān)節(jié)復(fù)雜解剖形狀的組織工程骨軟骨水凝膠支架，將其植入體內(nèi)8 周，在其表面及底部分別再生出軟骨和骨組織。同時(shí)，對(duì)于制備單純的水凝膠支架，還可在水凝膠中混入水溶性或脂溶性致孔劑，待成膠后經(jīng)三蒸水或有機(jī)溶劑洗滌予以去除，從而獲得多孔支架[52]。然而，該模鑄成型方法并不適用于制造具有梯度結(jié)構(gòu)的水凝膠支架。

4.3 3D生物打印技術(shù)

3D生物打印是一種很有前景的先進(jìn)制造技術(shù)，通過生物墨水的多層沉積過程，可制備具有復(fù)雜形狀和梯度結(jié)構(gòu)的支架，同時(shí)還可將種子細(xì)胞包裹于生物墨水中一并進(jìn)行打印，獲得載細(xì)胞組織工程產(chǎn)品。Hong等首先開發(fā)了由絲素蛋白和甲基丙烯酸縮水甘油酯（glycidyl-methacrylate，GMA）組成，具有生物相容性、生物降解性和可打印性的生物墨水，然后利用數(shù)字光處理打印機(jī)進(jìn)行3D 打印，得到具有均勻孔隙的Silk-GMA水凝膠支架，該支架可支持干細(xì)胞的增殖、成軟骨分化及軟骨樣組織的沉積[53]。

4.4 水凝膠支架的3D組裝技術(shù)

單塊體積較大的含細(xì)胞水凝膠存在細(xì)胞間相互作用不足、分化效率低、組織粘附性差等缺點(diǎn)，阻礙了高質(zhì)量透明軟骨的形成。Li 等使用可注射的含BMMSCs微凝膠作為組裝單元，通過N-羥基琥珀酰亞胺-胺偶聯(lián)反應(yīng)使微凝膠進(jìn)行3D 組裝，形成水凝膠支架。研究者認(rèn)為，該組裝過程保持了包封的干細(xì)胞的活力和功能，有利于微凝膠與周圍組織的快速結(jié)合，為軟骨形成提供了一個(gè)物理穩(wěn)定和生物活性的微環(huán)境。研究結(jié)果顯示，與大塊水凝膠相比，3D 組裝微凝膠有更佳的軟骨ECM分布和更高的Ⅱ型膠原含量[54]。

5 臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，用于臨床軟骨修復(fù)的商品化水凝膠結(jié)構(gòu)均相對(duì)簡單，大多數(shù)作為細(xì)胞載體或人工假體，主要有纖維蛋白、HA、膠原蛋白、PVA 等。Koh 等將脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）與纖維蛋白膠混合，聯(lián)合微骨折法治療股骨髁部軟骨缺損，術(shù)后隨訪2年，明顯改善了KOOS 疼痛及癥狀評(píng)分，且軟骨再生質(zhì)量優(yōu)于單獨(dú)使用微骨折組[55]。Park 等將同種異體人臍血 源 性MSCs（umbilical cord blood-derived MSCs，hUCB-MSCs）與透明質(zhì)酸（HA）混合后用于治療骨關(guān)節(jié)炎4 度軟骨缺損患者，12 周后關(guān)節(jié)鏡評(píng)估軟骨修復(fù)情況，觀察到成熟的透明軟骨樣再生組織，術(shù)后3年MRI提示再生軟骨持續(xù)存在[56]。一項(xiàng)多中心隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)比較了關(guān)節(jié)內(nèi)分別注射超高分子量HA或中分子量HA用于治療髖關(guān)節(jié)OA的效果，結(jié)果表明單劑量超高分子量HA的療效與雙劑量中分子量HA相似，均可明顯降低疼痛及減少殘疾[57]。Sharafat-Vaziri 等將膠原/絲素蛋白支架與自體軟骨細(xì)胞復(fù)合，用于修復(fù)2 例軟骨缺損患者，術(shù)后1年時(shí)膝關(guān)節(jié)IKDC評(píng)分明顯提高，MRI顯示移植物與周圍組織整合完好，缺損局部無滲出、水腫，軟骨形成信號(hào)減少，同時(shí)也證實(shí)了該組織工程修復(fù)軟骨缺損的可行性[58]。另一項(xiàng)研究則比較了由PVA材料制得的水凝膠植入物（CartivaTM）和自體軟骨移植治療膝關(guān)節(jié)局灶性軟骨缺損的效果，隨訪2年，結(jié)果提示兩種技術(shù)均顯示出滿意的療效，水凝膠植入物安全有效、穩(wěn)定性良好[59]。

6 總結(jié)與展望

本文主要就近些年來常用于軟骨病損修復(fù)的天然水凝膠、合成水凝膠及混合水凝膠的特點(diǎn)、軟骨再生情況、各自優(yōu)缺點(diǎn)以及水凝膠支架的先進(jìn)制備方法、臨床應(yīng)用現(xiàn)狀等方面的情況進(jìn)行了綜述。水凝膠作為細(xì)胞/生長因子和其他調(diào)控物質(zhì)的載體被用作組織工程支架或用作永久性的植入物來代替受損的軟骨，在大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中顯示出較好的軟骨修復(fù)效果。天然生物大分子及其衍生物制備的水凝膠具有良好的生物相容性、生物降解性和較低的成本，但力學(xué)強(qiáng)度往往較弱，限制了其作為承重支架材料的應(yīng)用。合成聚合物水凝膠可以精確調(diào)控其結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能以及組成，但細(xì)胞親和性及生物降解性通常較差。通過將天然和合成聚合物兩種不同類型水凝膠的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，所制備的混合水凝膠可以使它們的缺點(diǎn)最小化。

盡管目前報(bào)道的多種水凝膠具有良好的軟骨修復(fù)效果、多種先進(jìn)方法被用于制備水凝膠支架，但商品化、用于軟骨修復(fù)的水凝膠種類仍然較少，且結(jié)構(gòu)均相對(duì)簡單，對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的水凝膠，其臨床轉(zhuǎn)化還存在一些障礙。這是由于利用先進(jìn)的生物制造技術(shù)制備復(fù)合水凝膠通常需要特殊的配方和設(shè)備，其制備時(shí)間相對(duì)較長，成本遠(yuǎn)高于簡單結(jié)構(gòu)水凝膠產(chǎn)品；同時(shí)，水凝膠中不同組分、不同形態(tài)結(jié)構(gòu)和理化性能對(duì)于軟骨修復(fù)的影響并不明確，相關(guān)混雜因素較多，這無疑加大了復(fù)雜結(jié)構(gòu)水凝膠進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化的難度。我們認(rèn)為，一種理想的水凝膠組織工程軟骨產(chǎn)品應(yīng)具備以下特點(diǎn)：（1）模擬天然軟骨的力學(xué)特征，水凝膠需具備良好的力學(xué)性能，能夠吸收壓縮載荷，抵抗縱向變形，足以應(yīng)對(duì)關(guān)節(jié)腔內(nèi)復(fù)雜的力學(xué)環(huán)境；（2）合理的微觀孔隙結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞浸潤、遷移，營養(yǎng)物質(zhì)、電解質(zhì)、代謝廢物的擴(kuò)散和交換；（3）制備水凝膠所用原料及降解產(chǎn)物安全無毒，具有良好的生物安全性；（4）可控的的生物降解性，使水凝膠支架與新生軟骨的生長速度相匹配；（5）良好的細(xì)胞親和性和功能特異性，能負(fù)載并緩釋生物活性因子，具有適宜種子細(xì)胞黏附、增殖和分化的仿生微環(huán)境，同時(shí)不會(huì)誘發(fā)機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)；（6）水凝膠制備流程簡單、顯著減少制造時(shí)間及生產(chǎn)成本，便于儲(chǔ)存及運(yùn)輸。隨著對(duì)以上各方面的深入研究，基于水凝膠的組織工程技術(shù)在骨、軟骨、半月板等承重組織的修復(fù)再生中應(yīng)用前景廣闊，有望獲得一種適用于臨床的理想仿生水凝膠組織工程軟骨產(chǎn)品，這是未來研究工作的重點(diǎn)。