SAA在固有免疫防御感染中的作用機制①

羅 濤 雷 蕾 蔣瑾瑾③ （海軍軍醫(yī)大學研究生院，上海 200433）

SAA 蛋白家族是一類高度保守的血清成分，其病理生理學機制已研究了近70 年。最初的臨床和實驗研究中，這種分子被認為是淀粉樣變沉淀物中的一種成分。淀粉樣變病理改變在光鏡下的特征是無固定界限，可被剛果紅或硫黃素T等染料染色；電子顯微鏡下可見淀粉樣變呈纖維樣結(jié)構(gòu)。在慢性或復發(fā)性感染及非特異性炎癥時可形成繼發(fā)性淀粉樣病變。最初研究時認為，淀粉樣變獨特的纖維蛋白（通常為約76 個氨基酸組成的蛋白序列）是淀粉樣蛋白A（amyloid A，AA）。后發(fā)現(xiàn)AA 蛋白是由一個序列更長的血清蛋白（約104個氨基酸組成）水解而來，即現(xiàn)在所稱的血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）［1］。

1 SAA的基因

在哺乳動物及其他脊椎動物的進化過程中，SAA 呈高度保守基因序列。大樣本人群研究已經(jīng)確定SAA 存在基因多態(tài)性，并據(jù)此提出分類方法，但多數(shù)編碼SAA 的基因組僅為單個核苷酸的變異（single nucleotide polymorphisms，SNP）［2］。 SAA 基因可在各種急性時相反應（acute phase reaction，APR）蛋白誘導刺激下轉(zhuǎn)錄，包括：IL-1β、IL-6、TNF-α和MAPK活化分子（如：pERK1/2、pJNK、p38）以及腹腔內(nèi)酪蛋白和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）等。炎癥初期，SAA mRNA 的水平會急劇上升。升高的 SAA 最終會逐漸分解。saa1，saa2，saa3 和saa44 個人類不同編碼基因聚集在11 號染色體的p15.1區(qū)域，長度為150 kb。其基因在染色體上排列按順序分別為saa1、saa2、saa4、saa3。除saa3基因有3個外顯子2 個內(nèi)含子，其他基因均包含4 個外顯子和3個內(nèi)含子［3］。saa1和saa2基因包含saa1α、saa1β、saa1γ、saa2α和saa2?等位基因［4］。saa2α和saa2?基因分別與saa1α第12 和第13 位核苷酸不同。除第71 位密碼子的單堿基取代（腺嘌呤替換為鳥嘌呤），saa2α和saa2?的核苷酸序列基本相同，因此，二者可能有相同的基因進化過程［5］。saa基因的啟動子區(qū)域包含NF-κB（GGGACTTTCC）和NF-IL6（AGGT?TACACAACTG）轉(zhuǎn)錄因子識別序列，IL-1、IL-6、TNF及 SAA 激活序列（SAA-activating sequence，SAS）可誘導SAA 的啟動子激活，其中SAS 激活因子（SAS-activating factor，SAF）的結(jié)合位點是SAS［6-7］。

2 單體SAA和纖維結(jié)構(gòu)

單體 SAA 的三維結(jié)構(gòu)特點為 4 個 α 螺旋和 1 個C 端結(jié)構(gòu)域［8］，單體 SAA 中未發(fā)現(xiàn)存在 β-折疊。SAA 單體結(jié)構(gòu)主要在血清中表達，組織中沉積的淀粉樣蛋白一般并不包含SAA 單體結(jié)構(gòu)。多種淀粉樣纖維存在共同的結(jié)構(gòu)特征，最顯著的特征是呈上下β 折疊堆砌薄片結(jié)構(gòu)（通常是逆向平行），并通過廣泛的氫鍵和范德華作用力維持相互穩(wěn)定。淀粉樣蛋白纖維直徑20 nm，在堆疊的薄片之間有10?空隙。有報道顯示SAA 纖維可有長短不同的形式。大多數(shù)SAA 纖維均包含相同的N 端76 個氨基酸殘基。由于 SAA 單體結(jié)構(gòu)中不存在 β-折疊結(jié)構(gòu)［8］，因此在組裝纖維之前必須對一級結(jié)構(gòu)進行重組。

AA 和其他類型的淀粉樣纖維均具有難以分解的特性，因這些特性造成細胞與細胞間的通訊、營養(yǎng)和離子輸送障礙以及器官微結(jié)構(gòu)的改變。

3 SAA與特定受體的結(jié)合

SAA 可與特定的細胞或大分子結(jié)合，如LPS。SAA 與大腸桿菌的外膜蛋白A（outer membrane pro?tein A，ompA）結(jié)合可增強中性粒細胞對細菌的吞噬功能，起調(diào)理素的作用。

SAA 的細胞受體比較復雜，多個研究的結(jié)論不盡相同，也反映了SAA 可能具有多種不同的生理功能。SAA 與清道夫受體 B1（scavenger receptor B1，SR-B1）結(jié)合主要參與了巨噬細胞對膽固醇的攝??；與Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）2 結(jié)合可激活炎癥小體NLRP3 并誘導炎癥因子的產(chǎn)生和釋放；與TLR4結(jié)合可激活NF-κB、轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1（acti?vate proteins，AP-1）以及一氧化氮合成酶（nitric ox?ide synthase，NOS）；與甲酰肽受體樣受體 1（formyl peptide receptor-like receptor 1，F(xiàn)PRL1）結(jié)合可刺激基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）；與甲酰肽受體（formyl peptide receptor 2，F(xiàn)PR 2）結(jié)合可促使吞噬細胞遷移；與糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）結(jié)合可激活NF-κB，并誘導細胞因子產(chǎn)生；與細菌受體直接結(jié)合可對革蘭氏陰性菌起調(diào)理作用［1，9-10］。

SAA 參與多種病理生理功能。除SR-B1參與膽固醇的轉(zhuǎn)運外，SAA 與多種受體結(jié)合主要參與機體感染的過程。

4 SAA在固有免疫防御感染中的作用

因SAA1與SAA2主要參與APR，在APR 期間蛋白濃度可比正常水平升高約100~1 000 倍，因此被稱為急性期SAA（acute-phase SAA，A-SAA），可激活免疫防御［9］。作為參與固有免疫的一種成分，ASAA 在機體抵御各種病原體侵襲的過程中起重要作用。

4.1 SAA 與細菌感染 HARI-DASS 等［11］研究結(jié)果顯示，A-SAA 可直接結(jié)合幾種革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌和銅綠假單胞菌等。質(zhì)譜儀分析發(fā)現(xiàn)，A-SAA 的配體OmpA 幾乎存在于所有革蘭氏陰性細菌中。有研究采用盲腸結(jié)扎和穿刺（cecal li?gation and puncture，CLP）導致急性多菌群敗血癥，并建立小鼠APR 蛋白誘導模型，在CLP 后第5 天約有75%小鼠仍存活。肝特異性gp130基因純合子缺失的小鼠模型CLP后，因無法合成SAA 出現(xiàn)90%的致死率，當給予外源性SAA 治療后，小鼠生存率可得到恢復。此外，經(jīng)抗SAA 的33-43 基因編碼片段蛋白的單克隆抗體處理后，也可導致小鼠約90%的高致死率。該研究證明了SAA 對急性感染敗血癥小鼠的生存具有保護作用［12］。革蘭氏陰性細菌感染引起的組織損傷和膿毒癥的主要炎性介質(zhì)是LPS，而LPS 是誘導SAA 強烈表達的外源性因子。近期美國伊利諾伊州大學CHENG 等［13］研究證明，急性期SAA1 為LPS 誘導的炎癥和組織損傷提供了保護。研究采用表達人SAA1 轉(zhuǎn)基因小鼠CLP 模型，腹腔注射LPS 導致炎癥反應，研究發(fā)現(xiàn)，表達人SAA1 轉(zhuǎn)基因小鼠對LPS 造成的肺損傷有部分保護作用，但并不能削弱TNF-α 誘導的肺部炎癥和損傷。小鼠SAA1 表達水平與血清和肺組織中的LPS濃度呈負相關(guān)；SAA1 可直接與LPS 結(jié)合形成復合物，并促進巨噬細胞攝取LPS。此外，致病菌侵襲小鼠腸黏膜上皮可誘導產(chǎn)生A-SAA，具有保護腸道正常菌群的作用［14］。A-SAA 與細菌結(jié)合具有調(diào)理巨噬細胞和嗜中性粒細胞的作用，可促進和增強吞噬作用、促進TNF-α和IL-10的分泌以及嗜中性粒細胞呼吸爆發(fā)。機體正常濃度的A-SAA 也具有上述作用，推測A-SAA 可作為模式識別蛋白參與抵御病原體入侵宿主的第一道防線。

4.2 SAA 與病毒感染 A-SAA 在宿主抗病毒中也起重要作用。研究報道，SAA 可通過抑制丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）復制和阻止病毒進入細胞，具有抗病毒活性作用。該研究將人重組SAA蛋白與HCV混合后體外感染肝臟細胞，發(fā)現(xiàn)SAA以劑量依賴的方式抑制了HCV 的感染，濃度為50~100 μg/ml 的 SAA 可完全抑制 HCV 感染，HCV NS3蛋白和正鏈RNA 的水平與SAA 濃度呈負相關(guān)。HCV E2 糖蛋白與人 CD81、SR-B1 和低密度脂蛋白受體等肝臟細胞表面分子相互作用，SAA 可與SRB1 特異性結(jié)合，因此認為SAA 與SR-B1 的結(jié)合是干擾 HCV 感染的原因之一［15］。SAA 阻止 HCV 感染的確切作用機制仍有待研究，但SAA 通過特異性阻斷HCV 感染，表明SAA 可能在抵抗HCV 感染的宿主固有免疫中起重要作用。SIDORKIEWICZ 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）X蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠中，X蛋白完全抑制了A-SAA應答，A-SAA作為一種抗病毒物質(zhì)可能對去除X蛋白后的HBV復制和清除具有治療作用。

4.3 SAA與真菌感染 多項研究證明，A-SAA對真菌感染也具有潛在的固有免疫調(diào)節(jié)作用。在白色念珠菌全身感染期間，A-SAA 濃度可能在數(shù)小時內(nèi)增加至500μg/ml。高濃度的A-SAA 可通過誘導多形核（polymorphonuclear，PMN）細胞脫顆粒和吞噬作用來啟動和增強抗念珠菌活性。實驗研究表明，以 50 μg/ml 的 SAA 孵育 PMN 也可增強抗真菌活性，SAA 激活PMN 以劑量依賴性方式抑制念珠菌生長。目前認為SAA 抑制真菌生長的作用是通過激活PMN 中G 偶聯(lián)蛋白介導的信號通路增強巨噬細胞表面抗原表達（上調(diào)CD11c 和CD16）和促進乳鐵蛋白分泌完成的［17］。

4.4 SAA 與炎癥信號通路 SAA 的多種作用提示該APR 蛋白可與多種受體相互作用并激活炎癥信號通路，SAA與FPR2和G偶聯(lián)蛋白受體結(jié)合是多種免疫細胞的激動劑［18］。缺乏FPR2 受體的炎癥細胞給予外源性SAA，可增強這些細胞的遷移能力，在SAA 刺激下激活 NF-κB，并產(chǎn)生趨化因子和 IL-8 等炎性介質(zhì)［19］。兩項獨立的研究表明，SAA 可以激活TLR，包括：TLR2 和 TLR4［20］。其中一個研究證明TLR2/1 異二聚體是SAA 的首選受體。SAA 刺激這兩種受體誘導了MyD88 信號傳導，包括ERK 和p38 MAPK 的磷酸化，并導致 IL-1β、TNF-α、IL-12p40 和IL-10的轉(zhuǎn)錄激活，以及增加NO生成［21］。TLR2同時介導 SAA 誘導的 IL-23p19 和 G-CSF 的表達［22-23］。近期研究顯示，TLR2 的激活有助于SAA 誘導的IL-33和M2巨噬細胞標志物的表達［24］。

4.5 SAA 與單核-巨噬細胞 各種炎癥均可激發(fā)外周血 SAA 增加。人類 SAA 蛋白家族 SAA1、SAA2 和SAA4 均可激活大量固有和適應性免疫細胞。有研究檢測了人原代單核細胞和單核細胞來源的巨噬細胞在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上表達SAA1、SAA2和SAA4的能力。采用單獨給予LPS 或LPS 聯(lián)合皮質(zhì)類固醇孵育健康供體的單核細胞和衍生的巨噬細胞，在檢測SAA 表達水平的同時，測定前炎癥因子IL-1α、IL-1β 和IL-6 的表達。研究發(fā)現(xiàn)，單獨LPS 并無誘導人單核細胞和巨噬細胞中saa1和saa2基因轉(zhuǎn)錄的作用，而LPS 與地塞米松聯(lián)合可誘導saa1和saa2基因的轉(zhuǎn)錄。單獨LPS刺激可強烈誘導人單核細胞和巨噬細胞前炎癥因子的釋放，而地塞米松則起抑制作用。此外，在極化的M1 表型單核細胞中，LPS 與地塞米松聯(lián)合使用可導致以SAA1 為主的表達增強，SAA mRNA 和細胞內(nèi)SAA 蛋白水平存在較大差異，炎癥刺激人的單核細胞和巨噬細胞可表達saa基因，主要是saa1基因。LPS 與地塞米松聯(lián)合激發(fā)單核/巨噬細胞后，前炎癥因子 IL-1α、IL-1β 和 IL-6 表達下降，而SAA蛋白表達水平顯著增高。由于單核/巨噬細胞是慢性炎癥性疾病的主要炎癥細胞，因此推測巨噬細胞產(chǎn)生的SAA 可能主要參與了局部炎癥的微環(huán)境，如致密組織肉芽腫和結(jié)節(jié)樣病變［5］。

4.6saa基因與炎癥因子 以往研究發(fā)現(xiàn)人類saa1和saa2基因共用了APR 基因表達譜，它們可由TNF、IL-1、IL-6 和 IFN 等多種炎癥因子刺激誘導表達。BUCK 等［10］研究回顧了肝細胞來源的SAA。IL-1β 誘導和 SAA 與 NF-κB 基因位點結(jié)合顯著抑制了緊鄰NF-κB 旁的C/EBP 位點的識別。在炎癥因子刺激 24~36 h 后，血清 SAA 水平可升高 1 000 倍，后可迅速下降，提示SAA 存在顯著的調(diào)節(jié)和反饋機制，但這種調(diào)節(jié)和反饋假設機制目前仍未完全清楚，現(xiàn)有主要的理論依據(jù)來源于小鼠模型。在固有免疫細胞（如：促炎型或M1 表型的巨噬細胞）表面的模式識別受體（pattern recognition receptors，PAMP）與細菌感染性敗血癥的損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）可被TLR 識別，導致 NF-κB 活化、T 細胞啟動和炎癥因子的分泌［25］。在 APR 早期所有刺激因子中，IL-6 對APR 蛋白基因轉(zhuǎn)錄是最有效的。在小鼠saa280~224 nt 基因片段發(fā)現(xiàn)的3 個同源的富含嘧啶的8 個核苷酸組成的基序（CACCGTCA，CACCCACA，CAGCCCCC）可與SAF 發(fā)生特異性反應。這些基序突變可減少肝外細胞對IL-6 誘導產(chǎn)生SAA 的能力。SAF 是由477 個氨基酸組成的鋅指蛋白，在炎癥過程中發(fā)生磷酸化，saa-1轉(zhuǎn)基因小鼠可產(chǎn)生顯著的淀粉樣蛋白沉積病變。具有與gp130 受體結(jié)合的其他炎癥因子可部分替代IL-6 缺失，并產(chǎn)生SAA。2 個gp130 受體組成的信號復合物可在細胞內(nèi)磷酸化，并激活 STAT3 和/或 MAPK 信號。IL-6 受體的抗體可部分阻斷APR 蛋白產(chǎn)生，IL-1 受體拮抗劑或抗TNF 抗體也可部分抑制APR 蛋白產(chǎn)生的作用。小鼠肝臟細胞特異性的gp130 受體缺失可最大程度抑制APR 蛋白的合成，提示SAA 和CRP合成過程中該受體對肝臟細胞內(nèi)信號傳導途徑也十分重要［26］。SAA的促炎和抗炎活性已有多個研究。SAA最顯著的促炎活性為誘導趨化因子和直接趨化白細胞，這兩種情況均發(fā)生在低濃度的SAA（10 ng/ml）狀態(tài)。SAA 通過與G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled re?ceptor，GPCR）或FPR 2 結(jié)合，導致單核細胞、未成熟樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、中性粒細胞和T 細胞趨化。盡管這種直接趨化活性通常較弱，但SAA1-α 能通過與 TLR2 結(jié)合，誘導 CC 和 CXC 趨化因子（如CCL3 和CXCL8），并極大地增強單核細胞和中性粒細胞遷移［4］。人類外周血單核細胞和小鼠髓源性巨噬細胞暴露于SAA，巨噬細胞可表達M2標志，包括：IL-10、Ym1 炎癥區(qū)1（即：found in inflam?matory zone-1，fizz1）、甘露糖受體C型1（mannose re?ceptor C type 1，MRC1）、白介素-1 受體拮抗劑（inter?leukin-1 receptor antagonist，IL-1RA）和 CCL17 等。SAA 還能增強精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）活性，促進巨噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞。SAA 誘導M2型巨噬細胞依賴于MyD88 信號通路，同時也需要IFN 調(diào)節(jié)因子-4（IFN regulatory factor-4，IRF-4）的輔助。有研究表明，小鼠腹腔注射25 ng 人的SAA可上調(diào)腹膜巨噬細胞中IL-10、IL-1RA、fizz1 -1、CCL17、MRC1 和 Arg1 的 mRNA 表達［27］。單核細胞培養(yǎng)加入SAA，也可誘導細胞分化并產(chǎn)生IL-6、IL-1及M2 巨噬細胞標志物IL-10 和CD163。在小鼠體內(nèi)，SAA 誘導可使 CD11bhigh和 CD11chigh表達細胞擴增，在LPS刺激后可增加IL-6、IL-1β和GM-CSF表達水平［19］。

4.7 SAA 與中性粒細胞的氧化呼吸爆發(fā) SAA 的另一種抗炎活性是抑制中性粒細胞的氧化呼吸爆發(fā)，SAA 可抑制趨化因子多肽N-甲酰-甲硫氨?；?亮氨酰-苯甲丙氨酸（N-formyl-methionyl-leucyl-phe?nylalanine，fMLP）激發(fā)的中性粒細胞的活性氧釋放，但不能抑制佛波醇酯（phorbol myristate acetate，PMA）刺激引起的中性粒細胞的活性氧釋放。此外，只有低濃度的SAA（100 ng/ml）才具有這種作用，而SAA≥50 μg/ml 反而能激發(fā)中性粒細胞氧化呼吸爆發(fā)，這表明在病理狀態(tài)下，SAA 調(diào)節(jié)了中性粒細胞從抗炎轉(zhuǎn)化為促炎的作用模式［28］。此外，有研究證明，小鼠SAA≥20 μg/ml 可通過抑制巨噬細胞與T 細胞相互作用，或誘導巨噬細胞及T 細胞產(chǎn)生抑制因子來抑制小鼠抗體的產(chǎn)生［29］。

總之，SAA 作為固有免疫的一部分，對防御機體感染起重要作用，包括對革蘭氏陰性桿菌、病毒和真菌等。SAA 通過與受體結(jié)合激活了炎癥相關(guān)信號通路，同時也增加了固有免疫細胞的趨化和遷移。但在生理情況下或當機體受到病原體侵襲時，不同濃度SAA 的界限及病理生理功能仍不明確，有待進一步深入研究。

5 小結(jié)

最初研究發(fā)現(xiàn)SAA 主要參與APR 蛋白生成及慢性炎癥中病理性纖維的產(chǎn)生，但目前研究表明，SAA 在創(chuàng)傷、感染性疾病、代謝性疾病、心腦血管疾病、自身免疫性疾病和腫瘤多種等病理過程中發(fā)揮不同作用。本文闡述了SAA基因、結(jié)構(gòu)及其受體相關(guān)內(nèi)容，著重說明SAA 在固有免疫防御感染中的作用。SAA 在革蘭氏陰性菌和真菌感染中具有明確的機體保護作用；在HCV感染中SAA具有抗病毒活性，但在其他病毒感染中并未顯示其作用。此外，SAA 在支原體、衣原體和立克次氏體等感染中的作用機制，以及對固有免疫和適應性免疫的作用機制均未見相關(guān)研究報道。SAA 在臨床上與血常規(guī)和CRP 組成了“新三大常規(guī)”，能很好地對感染性疾病進行快速鑒別，但對SAA 的病理生理和固有免疫中的作用仍未完全明確，尤其SAA 在支原體、衣原體和立克次氏體等感染中增高的作用機制研究存在空白，可能是今后課題研究的方向。