不同手術(shù)時(shí)機(jī)高血壓腦出血患者外周血及腦組織TGF-β1、NF-κB表達(dá)的差異

崔植野 李湖廣

高血壓腦出血是臨床上常見(jiàn)的腦血管疾病，與腦內(nèi)動(dòng)靜脈病變破裂出血相關(guān)，具有較高的致殘率和致死率[1]。近年來(lái)，高血壓腦出血發(fā)病率和病死率呈升高趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。在治療方面，臨床上常采用開(kāi)顱血腫清除術(shù)且有一定的治療效果。研究表明，手術(shù)干預(yù)時(shí)機(jī)可能會(huì)影響手術(shù)效果及預(yù)后，目前關(guān)于手術(shù)時(shí)機(jī)尚無(wú)統(tǒng)一的觀點(diǎn)[3-4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor 1,TGF-β1）、NF-κB 是評(píng)估炎癥相關(guān)疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的重要指標(biāo)[5]。研究表明，下調(diào)TGF-β1 mRNA表達(dá)可抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，改善缺氧損傷[6]。而抑制NF-κB表達(dá)可減輕腦出血后的細(xì)胞凋亡，保護(hù)腦神經(jīng)[7]；另一方面，高血壓腦出血后不同時(shí)期NF-κB表達(dá)具有時(shí)相性，但NF-κB在出血過(guò)程中的作用并不明確[8]。因此，本研究探討了不同手術(shù)時(shí)機(jī)高血壓腦出血患者外周血及腦組織TGF-β1、NF-κB的表達(dá)，以期為該病手術(shù)治療時(shí)機(jī)的選擇提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2013年4月至2017年8月在上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院經(jīng)頭顱CT影像學(xué)檢查且符合全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)的高血壓腦出血患者245例，其中手術(shù)時(shí)機(jī)為超早期（出血后＜8 h）105例、早期（出血后8～24 h）95例、延遲（出血后＞24 h）45 例。3 組患者性別、年齡、BMI、高血壓病史、收縮壓、舒張壓、飲酒史、吸煙史、腦出血量、術(shù)前格拉斯哥昏迷評(píng)分（GCS）、手術(shù)方式等臨床資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05），見(jiàn)表 1。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合高血壓腦出血的診斷標(biāo)準(zhǔn)：血壓控制不滿意，未使用抗高血壓時(shí)的收縮壓140 mmHg、舒張壓90 mmHg，腦壓增高，Babinski征陽(yáng)性；（2）首次發(fā)生腦出血；（3）發(fā)病時(shí)間72 h內(nèi)；（4）2個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)激素或免疫抑制劑等藥物。排除外傷性腦出血、靜脈畸形腦出血、動(dòng)脈瘤、腦疝及腫瘤破裂腦出血患者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

表1 3組患者臨床資料比較

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 （1）小骨窗開(kāi)顱血腫清除術(shù)：患者全麻下，在最靠近血腫的顱骨處作5 cm左右的切口，使用電鉆張開(kāi)一個(gè)半徑約2.0 cm的圓形骨窗，穿刺，沿穿刺針清除血腫，縫合切口。（2）微創(chuàng)血腫清除術(shù)：患者局麻下，穿刺針沿著電鉆進(jìn)入顱骨，穿透后取電鉆，在血腫位進(jìn)行引流，利用注射器清除血腫，拔出穿刺針。（3）開(kāi)顱血腫清除術(shù)：患者全麻下行去骨瓣血腫清除術(shù)，取足夠大的骨瓣，打開(kāi)硬腦膜，自顳中回切開(kāi)作一個(gè)約1.5 cm的入口，深入血腫并清除血腫，電凝止血，修補(bǔ)硬腦膜，縫合。

1.2.2 外周血和腦組織取材方法 確診后立即取患者外周血5 ml?；颊呷胧中g(shù)室麻醉后，切開(kāi)頭皮，止血后分離皮瓣，顯露骨窗，留取少量出血皮質(zhì)區(qū)腦組織作為出血區(qū)標(biāo)本，留取清除血腫旁約1 cm的周圍腦組織為非出血區(qū)標(biāo)本。

1.2.3 外周血及腦組織TGF-β1、NF-κB mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取0.5 ml外周血或0.1 mg腦組織（其中腦組織置于勻漿器中），加入1 ml Trizol試劑，使用氯仿、異丙醇法提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，A260/A280為1.8～2.0。按RT-PCR試劑盒（貨號(hào)：K1622，加拿大Fermentas公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，各引物序列見(jiàn)表2。RT-PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 min；94℃變性15 min，60℃退火15 min，72℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。以-actin為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 TGF-β1、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表2 各引物序列

1.2.4 腦組織TGF-β1、NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè) （1）定性檢測(cè)：采用免疫組化Envision二步法。取部分腦組織標(biāo)本，制備石蠟切片，脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育10 min；PBS 沖洗，滴加抗大鼠 CD34（1∶200，批號(hào)：bs-0646R，北京博奧森生物技術(shù)公司）、兔抗人TGF-β1抗體（1∶200，批號(hào)：JM-4342-5，海浩洋生物科技有限公司）、兔抗人NF-κB 抗體（1∶200，一抗，批號(hào)：sc-10791，海浩洋生物科技有限公司），室溫過(guò)夜；PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗（1∶400，批號(hào)：PL03b0371R，海浩洋生物科技有限公司），室溫孵育30 min；PBS沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素；PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。在CX23型顯微鏡（日本OLYMPUS）下觀察，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。（2）定量檢測(cè)：采用Western blot法。采用RIPA蛋白裂解液法提取腦組織總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定腦組織的蛋白質(zhì)。取核蛋白樣品加入等體積的電泳樣品緩沖液加熱變性，取20 g蛋白上樣泳道，電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，采用5%脫脂奶粉封閉，遞次地加入NF-κB抗體（1∶300，鼠抗人，批號(hào)：8242，美國(guó) Cell Signaling公司）/TGF-β1抗體（1∶300，鼠抗人，批號(hào)：RS-0103R，上海研晶實(shí)業(yè)科技有限公司）的一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶4 000，羊抗鼠，批號(hào)：7056，美國(guó) Cell Signaling公司），以 DAB顯色，采用Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）定量掃描灰度值，以TGF-β1/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、NF-κB/GAPDH 分別表示 TGF-β1、NF-κB的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 術(shù)后并發(fā)癥統(tǒng)計(jì) 觀察并記錄3組患者術(shù)后消化道出血、肺部感染和顱內(nèi)感染等并發(fā)癥發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 3組患者外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；其中超早期組外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量最低，早期組其次，延遲組最高（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 3組患者外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 3組患者腦組織TGF-β1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 3組患者腦組織TGF-β1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；其中超早期組腦組織TGF-β1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量最低，早期組其次，延遲組最高（均P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 3組患者腦組織TGF-β1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 3組患者出血區(qū)和非出血區(qū)腦組織TGF-β1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 3組患者腦組織出血區(qū)和非出血區(qū)TGF-β1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；其中超早期組腦組織出血區(qū)和非出血區(qū)TGF-β1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量最低，早期組其次，延遲組最高（均P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 3組患者腦組織TGF-β1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 3組患者術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率比較 3組患者術(shù)后發(fā)生了不同程度的消化道出血、肺部感染和顱內(nèi)感染，合計(jì)并發(fā)癥發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中超早期組最低，早期組其次，延遲組最高（均P＜0.05），見(jiàn)表 6。

表6 3組患者術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率比較[例（%）]

3 討論

TGF-β1是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化作用的細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)以及淋巴細(xì)胞分化、免疫活性細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9-10]。在急性腦血管疾病中，TGF-β1通過(guò)調(diào)節(jié)免疫炎癥、促進(jìn)血管生成、抗凋亡、保護(hù)神經(jīng)、修復(fù)損傷等途徑發(fā)揮腦保護(hù)的效果[11-12]。當(dāng)周圍神經(jīng)發(fā)生損傷時(shí)，TGF-β1表達(dá)明顯升高，其保護(hù)神經(jīng)的作用主要有以下3點(diǎn)：（1）促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞增殖、分裂，而施萬(wàn)細(xì)胞具有清除、吞噬髓鞘及軸突的潰變殘余物及碎屑的作用；（2）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞滲出血管，穿過(guò)神經(jīng)內(nèi)膜，進(jìn)入損傷神經(jīng)處，協(xié)助施萬(wàn)細(xì)胞清除碎屑；（3）髓神經(jīng)纖維的髓鞘是由神經(jīng)膜細(xì)胞包繞神經(jīng)元軸突而形成的，有助于增強(qiáng)神經(jīng)纖維信息傳遞。TGF-β1降低纖溶酶原啟動(dòng)劑的活性，增加纖溶酶原啟動(dòng)劑抑制劑-1的活性，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解；也可直接增加細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成速度，但細(xì)胞外基質(zhì)積聚過(guò)多會(huì)導(dǎo)致瘢痕生成，抑制髓神經(jīng)生長(zhǎng)，故TGF-β1過(guò)高表達(dá)也可能對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響[13]。

NF-κB在多種細(xì)胞中表達(dá)，在炎癥、細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等多種病理、生理過(guò)程中發(fā)揮作用，NF-κB的異常活化參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過(guò)程。一方面，NF-κB的適當(dāng)啟動(dòng)會(huì)使機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，對(duì)感染產(chǎn)生應(yīng)答，刺激膜細(xì)胞異常增殖并分泌大量炎癥因子，啟動(dòng)的單核巨噬系統(tǒng)亦可發(fā)揮炎癥效應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，起到一定的保護(hù)作用[14-16]；另一方面，NF-κB無(wú)限制地被啟動(dòng)，大大增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)也會(huì)促進(jìn)炎癥細(xì)胞凋亡，使得免疫細(xì)胞“沉默”，降低機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染的抵抗力，同時(shí)NF-κB還會(huì)刺激神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的滲入，巨噬細(xì)胞表達(dá)上調(diào)又反饋性刺激細(xì)胞因子分泌，大量細(xì)胞因子可氧化損傷神經(jīng)元，遏制神經(jīng)元再生[17]。

王恒等[8]認(rèn)為高血壓腦出血后不同時(shí)期的NF-κB表達(dá)具有時(shí)相性，出血后1 h NF-κB開(kāi)始表達(dá)，24 h達(dá)到高峰，持續(xù)至72 h降低，但該結(jié)果基于大鼠研究，與人類結(jié)果可能存在差異。本研究探討了不同手術(shù)時(shí)機(jī)高血壓腦出血患者外周血及腦組織TGF-β1和NF-κB表達(dá)，結(jié)果顯示手術(shù)時(shí)機(jī)推遲，患者外周血及腦組織TGF-β1、NF-κB蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高。筆者分析原因可能是腦組織損傷后，機(jī)體迅速啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制，腦組織局部TGF-β1、NF-κB表達(dá)上調(diào)；隨著外周血炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，TGF-β1、NF-κB又可通過(guò)損傷的血-腦脊液屏障進(jìn)入血腫周邊，外周血TGF-β1、NF-κB表達(dá)也隨之升高，這可能是造成術(shù)后并發(fā)癥的病理原因[18-19]，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似[20-22]。

綜上所述，高血壓腦出血患者外周血及腦組織TGF-β1、NF-κB表達(dá)可隨手術(shù)時(shí)機(jī)推遲而明顯升高，術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率也明顯升高，建議對(duì)有手術(shù)指征的患者早期進(jìn)行手術(shù)。