HtrA4在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達及與滋養(yǎng)細胞缺氧的相關(guān)性

徐曉敏 汪文寰 孫聰聰 王葉平 李曉慶

子癇前期（preeclampsia，PE）是指孕婦妊娠20周以后新發(fā)高血壓伴蛋白尿，病情嚴重時可發(fā)生全身多臟器病變的母胎致病/致死疾病，發(fā)病率約為5%～7%[1]。滋養(yǎng)細胞侵襲過淺引起胎盤缺氧，釋放多種炎性因子進入母體血液循環(huán)，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，是PE發(fā)病的潛在機制[2]。高溫必需因子 A4（high-temperature requirement A4,HtrA4）是一類絲氨酸蛋白酶，參與了滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲和應(yīng)激調(diào)控[3]。研究表明，HtrA4與PE的發(fā)病相關(guān)，但其在PE孕婦胎盤組織中的表達水平及調(diào)控機制仍不明確[4-7]。而HtrA4表達是否與滋養(yǎng)細胞缺氧關(guān)鍵指標——缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor 1alpha,HIF-1α）相關(guān)也未見報道。本研究通過基因表達綜合（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫和胎盤組織驗證，明確HtrA4的表達情況，探討HtrA4表達水平與滋養(yǎng)細胞缺氧及HIF-1α表達的相關(guān)性，為基于HtrA4的PE發(fā)病機制研究和防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 Bewo滋養(yǎng)細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。細胞培養(yǎng)基和FBS均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM3000和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室均購自美國Corning公司；HtrA4和HIF-1α抗體均購自中國Proteintech公司；MTT試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒均購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；氯化鈷（CoCl2）購自中國阿拉丁公司。引物和小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 GEO芯片數(shù)據(jù)分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫查詢并納入PE孕婦胎盤組織基因芯片數(shù)據(jù)集，共計11組。數(shù)據(jù)納入標準：（1）人PE或正常胎盤組織；（2）PE組和對照組樣本例數(shù)均＞5例。采用GEO2R軟件[8]篩選數(shù)據(jù)集中差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs）。篩選標準如下：（1）P＜0.05；（2）差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2，即log2（FC）≥1。采用“RobustRankAggreg”R語言包[9]對11組數(shù)據(jù)集中的DEGs進行合并，篩選共同DEGs。富集分析采用Metascape基因功能分析平臺[10]。

1.2.2 胎盤組織驗證 胎盤組織采集自2019年1至6月在溫州市人民醫(yī)院行剖宮產(chǎn)分娩的PE孕婦9例（PE組）和無妊娠并發(fā)癥的擇期剖宮產(chǎn)分娩孕婦9例（對照組）。PE組納入標準：符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[11]中的PE診斷標準。排除標準：（1）非自然受孕者；（2）雙胎或多胎妊娠者；（3）有慢性高血壓史、心血管疾病史、腎臟疾病史或糖尿病史者。對照組排除妊娠并發(fā)癥和合并癥的擇期剖宮產(chǎn)分娩孕婦。兩組孕婦年齡、BMI、孕次、產(chǎn)次比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。胎盤經(jīng)剖宮產(chǎn)娩出后，取基底層和絨毛膜板間1 cm3組織，預(yù)冷PBS沖洗去除血液后，液氮保存。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有孕婦均簽署知情同意書。

表1 兩組孕婦一般情況比較

1.2.3 細胞培養(yǎng)及siRNA干擾 Bewo滋養(yǎng)細胞采用含10% FBS的Ham's F12k培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2和20% O2條件下常規(guī)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以1×105個/孔接種至24孔板；常規(guī)培養(yǎng)至近70%融合時，用無血清培養(yǎng)基清洗細胞，采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染細胞，qRT-PCR評估干擾效率，干擾效率≥60%說明干擾成功；HtrA4 siRNA序列：5'-ACUGUACACAGGAACAAGCTT-3'，HIF-1α siRNA 序列：5'-GCUCUUCGACAAGCUUAATT-3'。

1.2.4 細胞增殖實驗及侵襲實驗 Bewo滋養(yǎng)細胞分別經(jīng)HtrA4 siRNA（HtrA4 siRNA干擾組）和陰性對照siRNA（陰性對照組）轉(zhuǎn)染后，以未經(jīng)干擾細胞作為空白對照（空白組），檢測細胞增殖和侵襲活性。細胞增殖實驗采用MTT法，每組細胞按5×104個/孔接種細胞，分別檢測24、48和72 h細胞增殖活性，每個時間點均重復(fù)3次，操作嚴格按照MTT試劑盒說明書。侵襲實驗采用Transwell法，每組細胞重懸計數(shù)濃度為2×105個/ml；將Matrigel與無血清培養(yǎng)基按照1：8比例混合均勻，加入Transwell小室底部待凝固；小室下孔加入15% FBS的 Ham's F12k培養(yǎng)基，小室中加入200μl無血清的細胞懸液，每組細胞做2個復(fù)孔；48 h后，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色并計數(shù)，每組計數(shù)4個視野。

1.2.5 細胞缺氧實驗 滋養(yǎng)細胞缺氧模型采用低氧（1% O2）誘導(dǎo)和 HIF-1α 激活劑 CoCl2誘導(dǎo)。按 1×106個/孔接種細胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，分為HIF-1α激活組、低氧組和對照組。HIF-1α激活組：采用含200μM HIF-1α激活劑CoCl2的10% FBS的Ham's F12k培養(yǎng)基，37℃、20% O2、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；低氧組：37 ℃、1% O2、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h；對照組：繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。為進一步觀察抑制HIF-1α對HtrA4的影響，設(shè)立缺氧條件下的HIF-1α抑制組，即細胞經(jīng)HIF-1αsiRNA干擾后，按1×106個/孔接種細胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h，再在37℃、1% O2、5% CO2條件下培養(yǎng) 24 h。

1.2.6 HtrA4和HIF-1α蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。使用細胞裂解液將細胞或胎盤組織裂解后，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度；30μg蛋白上樣，經(jīng)15% SDS-PAGE電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h；按照抗體說明書中建議的使用濃度，用TBST配置一抗工作液，并將PVDF膜置于工作液中4℃孵育過夜；TBST溶液漂洗PVDF膜后，加入二抗，室溫孵育1.5 h；TBST溶液漂洗，進行顯影，Quantity One軟件掃描各條帶的光密度并分析結(jié)果。

1.2.7 HtrA4和HIF-1αmRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR法。提取細胞或胎盤組織RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，qRT-PCR法檢測樣本中HtrA4和HIF-1αmRNA表達水平。HtrA4上游引物：5'-GTCAGCACCAAACAGCG-3'，下游引物：5'-GGAGATTCCATCAGTCACCC-3'；HIF-1α 上游引物：5'-GTTAGTTCAATTTTGATCCCCTTTCT-3'，下游引物：5'-GCTACTGCAATGCAATGGTTTAA-3'。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。采用Pearson相關(guān)分析HtrA4與HIF-1αmRNA表達水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選與富集分析 11組芯片數(shù)據(jù)集篩選獲得13個共同DEGs，其中上調(diào)表達基因12個，下調(diào)表達基因1個。HtrA4在各數(shù)據(jù)集中均上調(diào)表達，log2（FC）為0.84～2.74，校正后P＜0.05。DEGs及表達量見圖1。HtrA4具有分泌活性，參與細胞外基質(zhì)的形成及調(diào)控細胞對生長因子刺激反應(yīng)，DEGs富集分析結(jié)果見表2。

表2 DEGs富集分析

圖1 11組芯片數(shù)據(jù)集中的共同上下調(diào)差異表達基因（DEGs）

2.2 兩組孕婦胎盤組織HtrA4和HIF-1α表達水平比較 與對照組比較，PE組孕婦胎盤組織HtrA4蛋白和mRNA表達水平均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與對照組比較，PE組孕婦胎盤組織 HIF-1α mRNA表達水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但兩組孕婦HIF-1α蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 3和圖2。

表3 兩組孕婦胎盤組織HtrA4和HIF-1α表達水平比較

圖2 兩組孕婦胎盤組織高溫必需因子A4（HtrA4）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）蛋白表達的電泳圖（PE為子癇前期）

2.3 各組細胞增殖和侵襲活性比較 HtrA4 siRNA干擾組（干擾效率為77.84%）、陰性對照組和空白組24、48和72 h細胞增殖活性比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表4。與陰性對照組比較，HtrA4 siRNA干擾組細胞侵襲活性明顯減弱，穿過小室基底膜的鏡下細胞數(shù)明顯減少。與陰性對照組比較，HtrA4 siRNA干擾組侵襲活性下降（64.93±1.46）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=44.41，P＜0.05），見圖 3。

圖3 小干擾RNA（siRNA）干擾高溫必需因子A4（HtrA4）對滋養(yǎng)細胞侵襲的影響（a：HtrA4 siRNA干擾細胞后，穿過小室基底膜的鏡下細胞數(shù)明顯減少；b：與陰性對照組比較，HtrA4 siRNA干擾組侵襲活性下降，*P＜0.05）

表4 各組細胞增殖活性比較

2.4 細胞缺氧對HtrA4表達的作用 與對照組比較，HIF-1α激活組、低氧組HtrA4和HIF-1α蛋白、mRNA表達水平均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與低氧組比較，HIF-1α抑制組（HIF-1αsiRNA干擾效率為61.50%）HtrA4和HIF-1α蛋白和mRNA表達水平均下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表5和圖4。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)各組細胞HtrA4與HIF-1α mRNA表達水平呈正相關(guān)（r=0.87，P＜0.01）。

表5 各組細胞HtrA4和HIF-1α mRNA表達水平比較

圖4 細胞缺氧對細胞高溫必需因子A4（HtrA4）和缺氧誘導(dǎo)因子 -1α（HIF-1α）蛋白表達的影響

3 討論

HtrA4是促進胎盤滋養(yǎng)細胞侵襲，抑制上皮細胞功能并促進子宮螺旋動脈重塑的關(guān)鍵蛋白[4，7]。本研究對11組PE芯片數(shù)據(jù)分析及胎盤組織驗證的結(jié)果顯示，PE孕婦胎盤組織HtrA4表達水平明顯高于正常妊娠女性，這與文獻報道一致[5-7]。筆者對HtrA4 siRNA干擾實驗表明，抑制HtrA4表達將下調(diào)滋養(yǎng)細胞的侵襲活性，但對滋養(yǎng)細胞增殖活性并無影響。Wang等[4]對HtrA4的體外機制研究認為，HtrA4一方面通過降解細胞基質(zhì)纖連蛋白來抑制纖連蛋白與整合素受體作用，另一方面通過裂解合胞素-1抑制細胞間融合，促進滋養(yǎng)細胞的侵襲能力。而HtrA4的表達雖然有利于滋養(yǎng)細胞侵襲，但部分研究顯示，HtrA4在PE孕婦胎盤中過表達并游離至血清將誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷及抑制內(nèi)皮正常功能，促進PE發(fā)展[12-14]。因此，精確調(diào)控HtrA4的表達可能對維持細胞侵襲和抑制PE發(fā)展具有重要作用。

目前，HtrA4的調(diào)控機制尚不明確，結(jié)合HtrA4的基因與蛋白功能和在PE孕婦胎盤組織中表達上調(diào)，筆者認為HtrA4可能受細胞應(yīng)激狀態(tài)如細胞缺血缺氧等作用，反饋促進細胞侵襲。胎盤缺氧是PE的早期特征之一，胎盤中低氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子和基因特異性表達是PE發(fā)病的核心因素[15-17]。研究顯示HIF-1α在PE患者胎盤組織和體內(nèi)/體外模型中高表達，參與PE發(fā)病[18-19]，本研究HIF-1αmRNA驗證結(jié)果與其一致，但PE組和對照組間HIF-1α蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與HIF-1α蛋白表達水平低且易降解有關(guān)。Liu等[7]檢測滋養(yǎng)細胞HTR-8在1% O2環(huán)境下的HtrA4表達水平，結(jié)果顯示HtrA4在缺氧環(huán)境中呈高表達。本研究通過低氧（1% O2）細胞模型實驗也證實，缺氧可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞HtrA4表達上調(diào)。進一步采用激動或抑制低氧條件下HIF-1α表達顯示，HtrA4表達與HIF-1α相關(guān)，部分受其調(diào)控。而HIF-1α誘導(dǎo)HtrA4表達的具體機制，有待于進一步研究。

綜上所述，本研究證實HtrA4在PE孕婦胎盤組織中表達顯著上調(diào)，可促進HtrA4的侵襲能力，并發(fā)現(xiàn)HtrA4的表達與滋養(yǎng)細胞缺氧和HIF-1α表達水平相關(guān)。孕期監(jiān)測和靶向調(diào)控HtrA4的表達可能是防治PE的有效途徑。此外，本研究對GEO數(shù)據(jù)庫PE孕婦胎盤組織基因芯片進行分析，得到13個DEGs，其中基因如LEP、FSTL3、PAPPA2 已被證實與 PE 發(fā)病相關(guān)[20-22]，而較多基因在PE孕婦胎盤組織中的表達和臨床意義仍有待于實驗驗證。