蛋白降解靶向嵌合體（PROTAC）藥物的非臨床評(píng)價(jià)策略分析

韓俊源＊，李亞娟＊，王海學(xué)，王全軍

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒物藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家北京藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，北京100850；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，北京100022）

蛋白降解靶向嵌合體（proteolysis-targeting chimeras，PROTAC）是將靶向蛋白募集到E3 泛素連接酶進(jìn)行泛素化標(biāo)記，然后通過泛素-蛋白酶體途徑將其降解的新型藥物分子。PROTAC 分子的發(fā)展經(jīng)歷了從第一代基于多肽片段的PROTAC 設(shè)計(jì)到2008 年開始的第二代小分子PROTAC 設(shè)計(jì)［1］。降解的靶蛋白從最早的甲硫氨酰氨肽酶、雄激素受體和細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白等［2-3］發(fā)展到最近的雌激素受體、tau 微管相關(guān)蛋白和激酶類等［4-6］。目前涉及的疾病包括癌癥、類風(fēng)濕和神經(jīng)退行性疾病等［6-7］?；谄渥饔脵C(jī)制，PROTAC 在消除轉(zhuǎn)錄因子和非酶蛋白質(zhì)等未成藥蛋白靶標(biāo)方面具有巨大潛力。然而，PROTAC 藥物對(duì)正常功能性蛋白的非選擇性降解及其穩(wěn)定性和血管穿透能力差等，決定了其非臨床評(píng)價(jià)研究不容忽視。目前對(duì)于PROTAC藥物的研究，重點(diǎn)在于強(qiáng)調(diào)藥物設(shè)計(jì)和作用機(jī)制，對(duì)其非臨床評(píng)價(jià)研究的報(bào)道很少。PROTAC藥物的研發(fā)的關(guān)注點(diǎn)之一就是藥物的安全性問題。做好非臨床安全性評(píng)價(jià)，有助于更全面地預(yù)測(cè)臨床安全性，更好地推動(dòng)其進(jìn)入臨床研究，最終用于人體疾病治療。本文對(duì)PROTAC藥物的發(fā)展歷程以及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行概述，重點(diǎn)對(duì)PROTAC藥物的非臨床評(píng)價(jià)策略進(jìn)行詳細(xì)分析，以期為PROTAC藥物的研發(fā)提供參考。

1 PROTAC藥物研發(fā)概況

2004 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了以色列科學(xué)家Aaron Ciechanover，Avram Hershko 和美國科學(xué)家Irwin Rose，以表彰他們共同發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞是如何摧毀有害蛋白質(zhì)的，即泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解過程。利用泛素調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解這一機(jī)制，Crews 和Deshaies 課題組在2001 年最早提出了PROTAC這個(gè)概念［8］。最初，PROTAC 只是被作為一種學(xué)術(shù)活動(dòng)或如CREWS 所說是一種“可愛的化學(xué)珍品”。之后，經(jīng)過將近20 年的發(fā)展，PROTAC 被認(rèn)為是一種新的藥物發(fā)現(xiàn)模式并可能會(huì)成為重磅炸彈療法［9］。PROTAC 是一種異雙功能小分子，由3 部分構(gòu)成，中間的連接體（linker）一端連接目標(biāo)蛋白的抑制劑（結(jié)合靶蛋白的配體），另一端連接E3 泛素連接酶的結(jié)合配體分子［10-11］。PROTAC 將靶向蛋白募集到E3 泛素連接酶進(jìn)行泛素化標(biāo)記，然后通過泛素-蛋白酶體途徑將其降解。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的正常生理功能是清除細(xì)胞中變性、突變或有害的蛋白質(zhì)［12］。PROTAC 是一種全新的藥物設(shè)計(jì)策略，通過設(shè)計(jì)這樣的三聯(lián)體藥物，理論上可以將任何過表達(dá)和突變的致病蛋白清除，從而治療疾病。

2001 年，Crews 和Deshaies 課題組利用與泛素連接酶E3 體系S 期激酶相關(guān)蛋白1-cullin-F 盒蛋白〔S-phase kinase-associated protein 1（Skp1）-cullin-F-box protein，SCF〕結(jié)合的10 肽，加上甲硫氨 酰 氨 肽 酶2（methionine aminopeptidase 2，MetAP2）的共價(jià)抑制劑ovalicin（天然產(chǎn)物），設(shè)計(jì)并合成了首個(gè)用于降解MetAP2 的PROTAC-1［8］。蛋白試驗(yàn)驗(yàn)證了PROTAC-1 可快速降解MetAP2，但由于使用的10 肽上有磷酸化的絲氨酸，導(dǎo)致PROTAC 分子無法透過細(xì)胞膜。為解決這個(gè)問題，研究者發(fā)現(xiàn)一個(gè)7 肽ALAPYIP 鏈接上一個(gè)D-精氨酸多聚體，可以使PROTAC成功透過細(xì)胞膜，且不被非特異性蛋白酶水解［13］。在這個(gè)PROTAC分子中，用ALAPYIP取代抑制性核因子κBα（inhibitor kappa B alpha，IκBα）-磷酸肽組分，是一個(gè)人工配體共軛AP21998 靶標(biāo)（F36V）FKBP12 蛋白質(zhì)。這種能透過細(xì)胞膜的PROTAC 已被證明可以在細(xì)胞中破壞其靶蛋白。在穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-（F36V）FKBP12 的HeLa 細(xì)胞中，加入PROTAC靶向的（F36V）FKBP12，觀察到綠色熒光減弱。Western 印跡法也證實(shí)，PROTAC 導(dǎo)致（F36V）FK?BP12 發(fā)生降解。細(xì)胞滲透PROTAC 的發(fā)展，為靶向體內(nèi)致病蛋白提供了可能，在細(xì)胞生物學(xué)特別是藥物開發(fā)中的應(yīng)用展現(xiàn)出前景。2008 年以前的PROTAC 均使用了多肽，雖然已經(jīng)可透過細(xì)胞膜，但多肽PROTAC本身相對(duì)分子質(zhì)量較大且肽鍵不穩(wěn)定，導(dǎo)致合成、純化和穩(wěn)定性方面的諸多問題。為克服這一系列問題，研究者采用“全小分子”的PROTAC設(shè)計(jì)。全小分子PROTAC通過小分子配體去募集目標(biāo)蛋白和E3泛素連接酶，快速靶向降解蛋白，有更好的細(xì)胞滲透性。芐林環(huán)連接酶（culin-ring ligase，CRL）E3 泛素連接酶復(fù)合物〔如鼠雙微體蛋白2（murine double minute 2，MDM2）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白1（cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP1）、重組小腦蛋白和VHL〕和與一些E3泛素連接酶或基質(zhì)受體蛋白結(jié)合的多種小分子已用于PROTAC開發(fā)。

以磷酸化酪氨酸結(jié)構(gòu)域（phosphorylated tyro?sine binding，PTB）或非受體酪氨酸激酶同源結(jié)構(gòu)域（Src homology 2，SH2）的招募蛋白為降解靶標(biāo)，可使酪氨酸激酶信號(hào)通路失活，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖?；谶@一理念，有研究者開發(fā)了一種磷酸化依 賴 的PROTAC（phosphoPROTAC）［14］。phos?phoPROTAC 通過靶向下游效應(yīng)蛋白降解，從而使受體酪氨酸激酶信號(hào)通路激活，而對(duì)正常細(xì)胞的毒性非常低，因?yàn)樗ǔＶ灰种瓢l(fā)生在癌細(xì)胞中的受體酪氨酸激酶信號(hào)的激活。依靠酪氨酸激酶相互結(jié)合，磷酸化多肽PROTAC可降解不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的靶蛋白，在“無成藥性”（undruggable）靶蛋白的藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域有所突破。另外，HEIGHTMAN 小組［15］開發(fā)了一種名為CLIPTAC的先進(jìn)PROTAC技術(shù)。CLIPTACS 是由2 個(gè)小前體分子在細(xì)胞內(nèi)組裝成的PROTAC，該技術(shù)實(shí)際上是基于重組小腦蛋白的PROTAC，由四苯標(biāo)記的沙利多米德衍生物（Tz-thalidomide）的快速反應(yīng)形成，在細(xì)胞中具有跨環(huán)環(huán)-八烯標(biāo)記的配體。此CLIPTAC 可以同時(shí)招募靶蛋白和E3 連接酶重組小腦蛋白，促進(jìn)目標(biāo)蛋白的蛋白酶體降解。2 個(gè)獨(dú)立的小前體分子能夠自組裝，在細(xì)胞中形成功能性PROTAC，因?yàn)槠湎鄬?duì)分子質(zhì)量更小而具有更好的滲透性。

2013 年，Crews 創(chuàng)立了生物技術(shù)初創(chuàng)公司ARVINAS，為臨床應(yīng)用開發(fā)PROTAC技術(shù)。2017年，ARVINAS 選擇了用于治療前列腺癌的雄激素受體PROTAC和乳腺癌的雌激素受體PROTAC 作為首批臨床試驗(yàn)候選藥物［16-17］。ARV-110 是ARVINAS臨床評(píng)估的第一個(gè)PROTAC蛋白降解劑。目前，在轉(zhuǎn)移性抗性前列腺癌患者中，ARV-110 已經(jīng)完成第一階段的臨床試驗(yàn)。結(jié)果顯示，35，70和140 mg劑量組耐受均良好，無劑量限制毒性，也未觀察到2，3或4級(jí)相關(guān)不良事件［18］。

2 PROTAC藥物研發(fā)特點(diǎn)

2.1 PROTAC藥物優(yōu)勢(shì)

目前，小分子抑制劑是靶向細(xì)胞內(nèi)蛋白的主要治療手段。然而小分子抑制劑有比較明顯的局限性，其靶蛋白通常是具有囊泡或者活性位點(diǎn)的酶和受體，這就導(dǎo)致占人類蛋白組活性位點(diǎn)約75%的轉(zhuǎn)錄因子、支架蛋白和非酶蛋白在小分子抑制劑中無成藥性［19］。此外，小分子抑制劑持續(xù)的高全身藥物水平來維持足夠的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度達(dá)到治療效果，這往往會(huì)使小分子抑制劑由于其競(jìng)爭(zhēng)的特性導(dǎo)致脫靶效應(yīng)和不良反應(yīng)。這些限制嚴(yán)重阻礙了小分子抑制劑的開發(fā)和臨床使用。

PROTAC 是一種利用蛋白酶水解靶向嵌合體的蛋白質(zhì)降解策略。將目標(biāo)蛋白質(zhì)募集到E3 泛素連接酶進(jìn)行泛素化標(biāo)記，然后由蛋白酶體介導(dǎo)降解。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的正常生理功能是清除細(xì)胞中變性、突變或有害的蛋白質(zhì)。通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)破壞致病蛋白，而不是使用傳統(tǒng)的小分子抑制劑抑制它們，從而提供了更有效的策略［20］。許多研究表明，降解蛋白質(zhì)比抑制蛋白質(zhì)具有更好的抗癌活性［21］。PROTAC 藥物的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是可降解“無成藥性”靶蛋白。

此外，理論上PROTAC只需少量的催化藥物即可降解細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的蛋白質(zhì)（包括膜蛋白），因此其具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 PROTAC藥物成藥難點(diǎn)

盡管目前研究者已采用全小分子的PROTAC設(shè)計(jì)策略，但其相對(duì)分子質(zhì)量高導(dǎo)致的水溶性、口服吸收和透膜性均較差，同時(shí)PROTAC藥物的化學(xué)合成成本也較高。同時(shí)，必須意識(shí)到目標(biāo)蛋白可能在其他正常生理活動(dòng)中發(fā)揮作用，如果PROTAC藥物不能區(qū)分正常和病理組織，那必將會(huì)引起程度不等的不良反應(yīng)。

另外，PROTAC 藥物的脫靶毒性更值得關(guān)注，因?yàn)榉核鼗瘶?biāo)記不僅涉及到蛋白質(zhì)降解，還關(guān)系到甲基化、乙?；土姿峄冗^程；不僅涉及蛋白質(zhì)，還涉及到DNA。就像沙利度胺對(duì)胎兒的致畸性一樣，其脫靶效應(yīng)在非臨床毒性篩選中不易檢測(cè)和跟蹤，其長(zhǎng)期和生殖毒性是一個(gè)嚴(yán)峻的問題。

3 PROTAC藥物的非臨床評(píng)價(jià)策略

全小分子設(shè)計(jì)的PROTAC 藥物與傳統(tǒng)小分子藥物在體內(nèi)的行為類似，非臨床安全性評(píng)價(jià)可以參考傳統(tǒng)小分子藥物進(jìn)行，但研究過程中還需針對(duì)PROTAC 的特性而對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。結(jié)構(gòu)中含多肽的大分子PROTAC 藥物的非臨床安全性評(píng)價(jià)，可以沿用多肽或抗體的評(píng)價(jià)思路進(jìn)行。

3.1 藥理藥效評(píng)價(jià)

PROTAC 是事件驅(qū)動(dòng)，而小分子抑制劑和抗體藥物是占位驅(qū)動(dòng)［22］。占位驅(qū)動(dòng)是經(jīng)典受體藥理學(xué)的一個(gè)標(biāo)志，需要高藥物濃度以保持目標(biāo)占用水平，提供足夠的臨床療效。然而，藥物濃度高也與脫靶效應(yīng)有關(guān)，可通過具有高特異性和良好的藥動(dòng)學(xué)特性的藥物來降低脫靶效應(yīng)。相反，PROTAC 具有催化作用，因此能夠在較低含量催化誘導(dǎo)蛋白酶體降解靶標(biāo)［23］。

離體細(xì)胞水平已證實(shí)一些蛋白，如雄激素受體、雌激素受體、雌激素相關(guān)受體α 和溴結(jié)構(gòu)域蛋白4，已可通過PROTAC 靶向破壞［23-27］。在體藥效研究中，PROTAC 藥物的非臨床評(píng)價(jià)首先需要確定種屬，即建立能夠表達(dá)PROTAC藥物靶蛋白的動(dòng)物模型。如果PROTAC藥物的靶點(diǎn)僅在人體內(nèi)表達(dá)，可通過開展替代分子在體藥效研究進(jìn)行驗(yàn)證；其次，動(dòng)物藥效模型需盡量選用能反映疾病發(fā)病機(jī)制的模型，即應(yīng)為致病蛋白（PROTAC 的靶蛋白）引起的疾病模型，才能更準(zhǔn)確地模擬相應(yīng)的疾病，驗(yàn)證PROTAC的藥效；同時(shí)，藥效研究需要設(shè)置不同的給藥劑量對(duì)量效關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。藥效除觀察指標(biāo)外，應(yīng)盡量選擇合適的藥效標(biāo)志物，如通過Western 印跡法等對(duì)目標(biāo)（致?。┑鞍椎谋磉_(dá)量進(jìn)行測(cè)定，以驗(yàn)證PROTAC藥物對(duì)靶點(diǎn)的選擇性。

此外，由于PROTAC在藥動(dòng)學(xué)方面與經(jīng)典的抑制劑不同，高濃度時(shí)經(jīng)常會(huì)觀察到“HOOK 效應(yīng)”［28］。在高濃度情況下形成的PROTAC∶E3 連接酶和PROTAC∶POI 二元復(fù)合物，可阻礙靶蛋白降解所必需的三元復(fù)合物的形成。因此，藥效實(shí)驗(yàn)要結(jié)合藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)參數(shù)設(shè)置給藥劑量，避免二元復(fù)合物的形成，制定合理的給藥方案。

3.2 代謝分析

PROTAC 分子必須與靶點(diǎn)蛋白和E3 泛素連接酶形成有效的三元復(fù)合物，才能實(shí)現(xiàn)靶蛋白降解的特性。因此，只有成功透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的PROTAC 才具有成藥性［22］。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)降解分子必須同時(shí)與目標(biāo)蛋白和E3 泛素連接酶形成三元復(fù)合物，避免形成二元復(fù)合物。三元復(fù)合物一旦形成，泛素必須以足夠的速率（快于三元復(fù)合物的本征壽命）轉(zhuǎn)移到靶蛋白受體位點(diǎn)上（通常是表面賴氨酸），所需底物的誘導(dǎo)泛素化也應(yīng)以同樣的速率進(jìn)行，以避免由二氫奎素酶競(jìng)爭(zhēng)性去除泛素。最后，泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白上的模式應(yīng)允許蛋白酶體容易識(shí)別，從而開始實(shí)際降解［30-32］。因此，在代謝研究中除關(guān)注PROTAC 藥物本身的藥動(dòng)學(xué)特性外，還需要重點(diǎn)關(guān)注三元復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性問題。如果是由小前體分子在細(xì)胞內(nèi)組裝成的PROTAC 的前藥，還要關(guān)注起藥效作用的“組裝產(chǎn)物”及其代謝產(chǎn)物的藥動(dòng)學(xué)特性。

生物利用度低、穩(wěn)定性和血管穿透能力差是PROTAC應(yīng)用受限的主要原因，因此在代謝研究中首先要通過質(zhì)譜確定體內(nèi)外代謝產(chǎn)物的種類和結(jié)構(gòu)，包括是否存在二元復(fù)合物以及游離個(gè)體，弄清藥物進(jìn)入體內(nèi)后的代謝途徑。在PROTAC 藥物的動(dòng)物種屬選擇上，需要考慮靶蛋白在各動(dòng)物種屬中的表達(dá)情況，需選取蛋白表達(dá)情況與人類相近的動(dòng)物為相關(guān)種屬；進(jìn)一步的動(dòng)物種屬選擇可參考小分子藥物的種屬選擇方案，通過體外肝微粒體和肝細(xì)胞代謝實(shí)驗(yàn)，確定不同種屬中代謝產(chǎn)物種類和比例，為種屬選擇以及毒理試驗(yàn)中需要監(jiān)測(cè)的代謝產(chǎn)物提供參考依據(jù)。代謝研究需要藥物對(duì)肝代謝酶的鑒定以及對(duì)代謝酶的誘導(dǎo)和抑制作用，為臨床上藥物的相互作用提供參考。此外，基于PROTAC本身的作用特點(diǎn)，在代謝研究中需要關(guān)注藥物與血漿蛋白結(jié)合的問題。綜上所述，在進(jìn)行代謝研究時(shí)，建議小分子PROTAC 進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)包括不同動(dòng)物種屬體外肝微粒體和肝細(xì)胞代謝產(chǎn)物鑒定和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，最好加做不同種屬體內(nèi)血漿中代謝產(chǎn)物的鑒定實(shí)驗(yàn)、CYP 酶亞型鑒定實(shí)驗(yàn)、CYP 酶誘導(dǎo)和抑制實(shí)驗(yàn)，血漿蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)、血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和相關(guān)種屬的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、組織分布和排泄實(shí)驗(yàn)。

PROTAC 的相對(duì)分子質(zhì)量范圍一般為70～1000，與傳統(tǒng)小分子藥物相比，較大的相對(duì)分子質(zhì)量使PROTAC 口服吸收更具挑戰(zhàn)性。但一旦被吸收，PROTAC 與傳統(tǒng)小分子藥物在體內(nèi)的循環(huán)無差異。經(jīng)靜脈、腹腔或皮下注射PROTAC，其在體內(nèi)表現(xiàn)出與傳統(tǒng)小分子藥物相似的代謝特點(diǎn)，暴露量與給藥劑量相關(guān)，優(yōu)化的PROTAC會(huì)有較低的肝清除率。另外，對(duì)于結(jié)構(gòu)中含有多肽的大分子PROTAC藥物，需參考大分子藥物代謝研究程序，并且需對(duì)藥物的免疫原性進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 非臨床安全性評(píng)價(jià)

PROTAC藥物安全性問題除需要考慮藥物整體的安全性外，還需確定藥物進(jìn)入體內(nèi)后PROTAC的連接子是否會(huì)斷裂，組成藥物的3 個(gè)部分是否會(huì)分離，繼而需要考慮各部分單獨(dú)的安全性隱患。在毒理研究中，針對(duì)PROTAC的穩(wěn)定性、生物分布和血管穿透能力差的特性，要充分考慮其代謝產(chǎn)物和（或）形成的復(fù)合物的毒性，及其因蓄積引起的臟器損傷問題。

安全性評(píng)價(jià)研究需進(jìn)行一般毒理、安全藥理、遺傳毒理和生殖毒理等研究?；赑ROTAC 藥物的作用機(jī)制特點(diǎn)，劑量-毒性反應(yīng)關(guān)系可能有別于傳統(tǒng)的小分子藥物，所以在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的劑量選擇時(shí)，需進(jìn)行充分的預(yù)實(shí)驗(yàn)探索，最終確定起效劑量與毒性反應(yīng)劑量之間的關(guān)系。

PROTAC 藥物的安全性評(píng)價(jià)中，動(dòng)物種屬的選擇與其他藥物相同，需要首先確定藥物的相關(guān)種屬。但針對(duì)PROTAC的特殊性，首先需要考慮動(dòng)物種屬中靶蛋白的表達(dá)情況，優(yōu)先選取蛋白表達(dá)與人類相似的動(dòng)物為相關(guān)種屬。進(jìn)一步的動(dòng)物種屬選擇中全小分子PROTAC 藥物可參考小分子藥物的種屬選擇方案，依據(jù)代謝產(chǎn)物研究的結(jié)果來確定；結(jié)構(gòu)中含有多肽的大分子PROTAC藥物，可參考多肽或抗體藥物的安全性評(píng)價(jià)思路，使用多種技術(shù)（如免疫化學(xué)或功能活性評(píng)估）確定相關(guān)種屬［33］；選取藥物代謝與人類更為相似的動(dòng)物種屬進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。

全小分子的PROTAC 藥物的劑量選擇可參照小分子藥物的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路，從單次給藥劑量遞增實(shí)驗(yàn)到不同劑量連續(xù)給藥實(shí)驗(yàn)，確定正式實(shí)驗(yàn)的給藥劑量。建議正式實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)前期的結(jié)果最少設(shè)置3 個(gè)給藥劑量，以確定劑量-毒性反應(yīng)關(guān)系。由于PROTAC 通過在亞化學(xué)計(jì)量的水平上催化誘導(dǎo)蛋白酶體降解靶標(biāo)而起到藥效作用，理論上其藥效劑量相當(dāng)于催化劑的量。所以在安全性評(píng)價(jià)尤其是安全藥理研究中，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的低劑量時(shí)應(yīng)充分考慮與藥效劑量之間的關(guān)系。劑量選擇不宜過高，與藥效劑量相當(dāng)或稍高于藥效劑量即可。同時(shí)，基于使用高濃度PROTAC 時(shí)會(huì)觀察到“HOOK 效應(yīng)”這一特性，在實(shí)驗(yàn)過程中PROTAC很可能會(huì)達(dá)到暴露量飽和的情況。但在非臨床安全性評(píng)價(jià)研究中，建議在飽和時(shí)觀察到的毒性反應(yīng)嚴(yán)重程度較輕時(shí)，繼續(xù)適當(dāng)升高劑量或達(dá)到適當(dāng)?shù)南拗苿┝?，在監(jiān)測(cè)藥物暴露量的基礎(chǔ)上，觀察在“HOOK 效應(yīng)”形成二元復(fù)合物的情況下，藥物潛在的毒性反應(yīng)，以更好地指導(dǎo)臨床安全性研究。針對(duì)大分子的PROTAC 藥物，劑量選擇也應(yīng)能提供反映劑量-反應(yīng)關(guān)系的信息，包括毒性劑量和未見不良反應(yīng)劑量（no observed adverse effect level，NOAEL）；對(duì)于某些毒性很小或無毒性的產(chǎn)品，可能無法規(guī)定一個(gè)特定的最大給藥劑量。在此情況下，應(yīng)提供劑量選擇依據(jù)及其預(yù)計(jì)的人體暴露量倍數(shù)。選擇高劑量時(shí)，應(yīng)該考慮其預(yù)期的藥理和生理作用、合適受試物的可獲得性及預(yù)期的臨床應(yīng)用［28］。

PROTAC 藥物的非臨床安全性評(píng)價(jià)重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)的給藥周期，需結(jié)合臨床試驗(yàn)以及藥物上市后治療期限進(jìn)行綜合考慮，實(shí)驗(yàn)的給藥周期需長(zhǎng)于藥物的治療期限以支持臨床試驗(yàn)或藥物上市（參考ICH M3的要求進(jìn)行）。臨床試驗(yàn)最長(zhǎng)期限≤2周的藥物，重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)最短期限為2周；6個(gè)月的嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和9個(gè)月的非嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通?？芍С纸o藥期限≥6個(gè)月的臨床試驗(yàn)［34］。同時(shí)，在一般毒理試驗(yàn)中，需要設(shè)置足夠長(zhǎng)時(shí)間的恢復(fù)期，以考察停藥后不良反應(yīng)的恢復(fù)情況。給藥頻率根據(jù)藥物的藥效/藥代參數(shù)和臨床擬用頻率進(jìn)行設(shè)計(jì)，試驗(yàn)中的給藥頻率需≥臨床的給藥頻率。

在進(jìn)行PROTAC藥物安全性評(píng)價(jià)時(shí)，基于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，除需要考慮藥物整體的安全性外，也需要考慮各組分的潛在毒性問題。首先確定分子在不同動(dòng)物種屬內(nèi)連接斷開及其代謝情況，測(cè)定游離狀態(tài)各組分及其代謝產(chǎn)物的占比。在安全性評(píng)價(jià)過程中，如果人體中游離狀態(tài)的組分及其代謝產(chǎn)物的暴露量超過動(dòng)物中的暴露量時(shí)，需要單獨(dú)對(duì)游離組分或其代謝產(chǎn)物進(jìn)行非臨床評(píng)價(jià)。

PROTAC 藥物的安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)的檢測(cè)項(xiàng)目及指標(biāo)可參照常規(guī)藥物的檢測(cè)進(jìn)行，在一般毒理試驗(yàn)中主要需包括臨床觀察、攝食量、體重、眼科檢查、體溫（僅非嚙齒類）、血壓和心電圖檢查（僅非嚙齒類）、血液學(xué)和血液生化學(xué)檢測(cè)、尿液觀察和分析、大體剖檢和組織病理學(xué)檢查等；安全藥理試驗(yàn)需要對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的功能進(jìn)行研究，同時(shí)針對(duì)可能存在引起人體其他系統(tǒng)擔(dān)憂的特定PROTAC藥物，需根據(jù)具體情況進(jìn)行安全藥理學(xué)的補(bǔ)充試驗(yàn)（如腎/泌尿系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)等）［35］；遺傳毒理試驗(yàn)中，除需要將PROTAC 當(dāng)作一個(gè)整體，通過體外和體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)組合的方法進(jìn)行遺傳毒性的研究外，針對(duì)在體內(nèi)會(huì)發(fā)生連接斷開和代謝的PROTAC藥物，還需要對(duì)游離各組分進(jìn)行遺傳毒性的檢測(cè)；生殖毒性試驗(yàn)針對(duì)臨床用藥人群，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候分階段進(jìn)行，可在其他藥理和毒理試驗(yàn)已獲得部分結(jié)果后，參考有關(guān)潛在生殖毒性信息的基礎(chǔ)上開展研究［36］；重復(fù)給藥試驗(yàn)的伴隨毒代檢測(cè)至關(guān)重要，可以通過暴露量作為風(fēng)險(xiǎn)控制的重要依據(jù)，PROTAC 藥物除需要監(jiān)測(cè)母藥的暴露量外，還需結(jié)合不同種屬中代謝產(chǎn)物鑒定的結(jié)果，對(duì)可能存在的表達(dá)量較高的游離組分、形成的復(fù)合物以及代謝物進(jìn)行監(jiān)測(cè)；大分子的PROTAC 藥物需要同時(shí)進(jìn)行免疫原性評(píng)估，以及監(jiān)測(cè)是否有抗藥抗體的產(chǎn)生。

脫靶毒性是業(yè)界最為關(guān)注的問題之一。傳統(tǒng)靶向蛋白活性的大分子和小分子藥物，甚至小核苷酸，對(duì)蛋白活性的抑制一般不會(huì)太徹底，多不影響骨架蛋白的表達(dá)，這樣雖然增加了耐藥性發(fā)生的概率，但殘留活性也可能保障正常細(xì)胞、組織器官基本的生理活性，降低潛在毒性。PROTAC 降解靶標(biāo)更為徹底，即使是以前驗(yàn)證過的靶點(diǎn)，會(huì)不會(huì)帶來嚴(yán)重的毒性需要進(jìn)行確證。脫靶效應(yīng)在毒性篩選中不易檢測(cè)和跟蹤，增加了后期開發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在非臨床安全性評(píng)價(jià)研究中應(yīng)對(duì)PROTAC的脫靶毒性進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注。

4 結(jié)語

迄今為止，PROTAC 技術(shù)已被應(yīng)用于不同的靶點(diǎn)，從蛋白酶到核激素受體、表觀遺傳因子和激酶等。PROTAC 技術(shù)在不可成藥靶點(diǎn)的應(yīng)用，有望解決目前80%蛋白因無可作用靶點(diǎn)而缺少調(diào)控的現(xiàn)狀，是未來可進(jìn)一步研究和探索的內(nèi)容。盡管PROTAC 技術(shù)從肽到全小分子有了顯著的提升，穩(wěn)定性、溶解度、血管穿透能力和組織分布得到了一定程度的改善，但與傳統(tǒng)的小分子藥物相比，以上問題依然是非臨床研究所面臨的難題。改進(jìn)PROTAC 的藥動(dòng)學(xué)、生物利用度和組織分布，進(jìn)一步降低相對(duì)分子質(zhì)量和毒性，需今后進(jìn)一步研究。