原發(fā)性卵巢功能不全患者原始卵泡體外激活技術(shù)

宋文廣，付浩，郭敏，胡春秀

原發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）是女性不孕的重要原因之一，其總患病率約為1%。歐洲人類(lèi)生殖與胚胎學(xué)會(huì)2020年制定的POI診斷標(biāo)準(zhǔn)為：40歲以下女性少經(jīng)或閉經(jīng)4個(gè)月以上，且間隔4周以上連續(xù)2次檢查均卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）＞25 U/L[1]。目前POI患者的治療主要是通過(guò)供卵途徑實(shí)現(xiàn)生育，但是由于我國(guó)卵子來(lái)源有限，供需嚴(yán)重失衡，等待合適的卵源往往需要數(shù)年時(shí)間，導(dǎo)致患者的生育目的很難實(shí)現(xiàn)。同時(shí)供卵來(lái)源胚胎沒(méi)有其生母的基因遺傳特性，也可能會(huì)導(dǎo)致一定社會(huì)及倫理問(wèn)題[2]。2010年原始卵泡體外激活（in vitro activation，IVA）技術(shù)的提出，為POI患者的生育需求提供了新的解決辦法。在POI患者體內(nèi)，雖然檢測(cè)不到發(fā)育的卵泡，但是有超過(guò)一半的患者的卵巢皮質(zhì)中仍存在原始卵泡，這些原始卵泡可能由于數(shù)目過(guò)少或其他原因?qū)е聼o(wú)法激活并發(fā)育。IVA技術(shù)可通過(guò)藥物或非藥物手段在體外處理卵巢組織，激活卵泡發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路，將卵巢中殘存的原始卵泡重新喚醒[3]。2013年首次報(bào)道應(yīng)用IVA技術(shù)使得POI患者成功分娩1名活嬰，這為IVA技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[4]?，F(xiàn)對(duì)IVA技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為POI患者制定治療策略提供參考。

1 卵泡發(fā)育過(guò)程

卵巢實(shí)質(zhì)部分可分為中央的髓質(zhì)和外周的皮質(zhì)，髓質(zhì)主要由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，血管與神經(jīng)分布較多，皮質(zhì)部分含有不同發(fā)育階段的卵泡、閉鎖卵泡、黃體和白體等[5]。卵泡具有明顯的年齡性變化：5個(gè)月的胎兒時(shí)期，兩側(cè)卵巢內(nèi)共有700萬(wàn)個(gè)原始卵泡，到新生兒時(shí)期有70萬(wàn)～200萬(wàn)個(gè)原始卵泡，青春期時(shí)僅剩約4萬(wàn)個(gè)原始卵泡，圍絕經(jīng)期時(shí)則僅存數(shù)百個(gè)。女性一生可排出400～500個(gè)成熟卵泡，其余的均在不同發(fā)育階段退化成閉鎖卵泡[6]。卵泡的發(fā)育分為原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和成熟卵泡4個(gè)階段。原始卵泡位于卵巢皮質(zhì)的淺層，體積小，數(shù)量多，由1個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞和周?chē)馄降穆雅菁?xì)胞構(gòu)成。初級(jí)卵母細(xì)胞是在胚胎時(shí)期由卵原細(xì)胞分裂分化而來(lái)，出生前卵原細(xì)胞已發(fā)育形成初級(jí)卵母細(xì)胞，并長(zhǎng)期停滯在第一次減數(shù)分裂的前期，停滯時(shí)間可達(dá)12～50年，直至排卵前才完成分裂。進(jìn)入青春期后，卵泡在促性腺激素的作用下開(kāi)始發(fā)育成熟。初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡合稱(chēng)為生長(zhǎng)卵泡，由原始卵泡發(fā)育而來(lái)，最終發(fā)育為成熟卵泡。成熟卵泡體積增大，直徑可達(dá)2 cm以上，并突向卵巢表面，卵泡中的初級(jí)卵母細(xì)胞于排卵前36～48 h完成第一次減數(shù)分裂，形成1個(gè)次級(jí)卵母細(xì)胞和1個(gè)第一極體。新形成的次級(jí)卵母細(xì)胞立即進(jìn)行第二次減數(shù)分裂，停滯在第二次減數(shù)分裂的中期。排卵時(shí)，次級(jí)卵母細(xì)胞外裹放射冠和透明帶，隨卵泡液排出卵巢。

2 IVA相關(guān)信號(hào)通路

2.1 Hippo信號(hào)通路Hippo信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物體內(nèi)較為保守，對(duì)于控制細(xì)胞凋亡與再生發(fā)揮重要作用。Hippo信號(hào)通路主要由幾個(gè)負(fù)性調(diào)節(jié)因子組成，包括哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶1/2（mammalian sterile 20-like kinases，MST1/2）、SAV1（Salvador homolog 1）和大腫瘤抑制因子1/2（large tumor suppressor，LATS1/2）等[7]。當(dāng)外源信號(hào)刺激Hippo信號(hào)通路時(shí)，活化的MST1/2與SAV1結(jié)合形成復(fù)合物，使LATS1和LATS2激酶磷酸化，并通過(guò)級(jí)聯(lián)作用，最終磷酸化關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，包括YES相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）、帶有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）等，導(dǎo)致它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)滯留，最后被相關(guān)蛋白水解酶降解[8]。當(dāng)Hippo信號(hào)中斷時(shí)，核內(nèi)YAP與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)相關(guān)結(jié)構(gòu)域（transcriptional enhanced associate domain，TEAD）的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，增加下游半胱氨酸富集61因子、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、腎母細(xì)胞瘤過(guò)度表達(dá)生長(zhǎng)因子和含有凋亡抑制劑的桿狀病毒凋亡重復(fù)抑制因子等蛋白的表達(dá)，促進(jìn)磷酸化的YAP和TAZ入核，并通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和增殖。研究表明Hippo信號(hào)通路蛋白可調(diào)節(jié)肝臟生長(zhǎng)，肝細(xì)胞中SAV1或MST1/2基因缺失可造成小鼠肝臟增大[9]。在卵巢相關(guān)疾病中，Hippo信號(hào)基因的缺陷與多囊卵巢綜合征、卵泡儲(chǔ)備降低和卵巢上皮細(xì)胞腫瘤的發(fā)生有關(guān)[10]。在卵巢衰老的過(guò)程中，Hippo信號(hào)通路相關(guān)分子可通過(guò)調(diào)控卵巢生殖干細(xì)胞的增殖參與卵巢功能的生理性衰老和病理性衰老過(guò)程[11]。

2.2 磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）信號(hào)通路PI3K/AKT信號(hào)通路是IVA研究中較為成熟的一個(gè)通路。當(dāng)受到外源信號(hào)刺激時(shí)，PI3K可通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）轉(zhuǎn)化為磷 脂 酰 肌 醇3，4，5-三 磷 酸（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3），當(dāng)刺激信號(hào)源消失或減弱時(shí)，PIP3則會(huì)轉(zhuǎn)化為PIP2，二者達(dá)成動(dòng)態(tài)平衡[12]。在這個(gè)過(guò)程中，人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10，PTEN）作為PIP3的拮抗劑，可促進(jìn)PIP3轉(zhuǎn)化為PIP2，從而降低細(xì)胞內(nèi)PIP3含量[13]。PIP3既可以直接與AKT發(fā)生反應(yīng)，也可與3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1（3-phosphoinositidedependent protein kinase 1，PDK1）結(jié)合間接激活A(yù)KT，促進(jìn)叉頭框蛋白O3a（forkhead box protein O3a，F(xiàn)OXO3a）磷酸化并使其從細(xì)胞核內(nèi)向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)移[14]。FoxO3a在卵母細(xì)胞核中的持續(xù)存在或表達(dá)增加可阻斷前顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的物質(zhì)交換，從而抑制原始卵泡的激活和發(fā)育，這對(duì)維持原始卵泡庫(kù)具有重要意義。當(dāng)FOXO3a磷酸化并且從卵母細(xì)胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)移到核外時(shí)，可解除對(duì)原始卵泡發(fā)育的抑制，進(jìn)而激活原始卵泡[15]。2010年，Li等[3]首先提出IVA技術(shù)可能成為POI患者的潛在治療策略。該團(tuán)隊(duì)用PTEN抑制劑和PI3K激活劑體外處理新生小鼠卵巢，激活休眠的原始卵泡，隨后將其移植到卵巢切除的成年小鼠腎囊中，并給予FSH處理以促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)該方法可培育出成熟卵子，并且通過(guò)體外受精（in vitro fertilization，IVF）技術(shù)還能使卵子進(jìn)一步發(fā)育成有生育能力的子代。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用同樣的方法將含有原始卵泡的人卵巢皮質(zhì)碎片移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，可見(jiàn)原始卵泡發(fā)育成為含有成熟卵母細(xì)胞的大的有腔卵泡，提示該方法可激活休眠的人類(lèi)原始卵泡，但由于倫理問(wèn)題未進(jìn)行下一步的IVF。

2.3 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號(hào)通路mTORC1是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，受生長(zhǎng)因子、能量、氧濃度、壓力和營(yíng)養(yǎng)等狀態(tài)的影響，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝。其主要受上游負(fù)性調(diào)節(jié)因子結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物1/2（tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2）的調(diào)控[16]。有學(xué)者通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)mTORC1信號(hào)通路表達(dá)增強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)其可加速原始卵泡發(fā)育并向初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)變。mTORC1信號(hào)通路主要通過(guò)調(diào)節(jié)前顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮原始卵泡激活作用。卵母細(xì)胞與前顆粒細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)了兩者的協(xié)同發(fā)育。敲除小鼠前顆粒細(xì)胞中mTORC1信號(hào)通路抑制因子TSC1基因后，可見(jiàn)顆粒細(xì)胞分泌的KITL（KIT ligand）因子表達(dá)增加，其與卵母細(xì)胞表面的酪氨酸激酶受體結(jié)合后可激活PI3K信號(hào)通路，促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育[17]。當(dāng)敲除mTORC1調(diào)控相關(guān)蛋白后，可見(jiàn)前顆粒細(xì)胞與原始卵泡同時(shí)保持休眠狀態(tài)，提示mTORC1信號(hào)通路的激活可促進(jìn)原始卵泡激活[14,18]。

3 IVA在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用

3.1 藥物IVA2013年，Kawamura團(tuán)隊(duì)基于Hippo和AKT信號(hào)通路影響原始卵泡發(fā)育的理論進(jìn)行了IVA人體試驗(yàn)[4]。研究共招募27例POI患者，其中13例患者卵巢內(nèi)可見(jiàn)原始卵泡。首先在腹腔鏡下將卵巢皮質(zhì)分割成1 mm×1 mm小塊，以破壞Hippo信號(hào)通路，繼而經(jīng)過(guò)AKT激活劑體外處理2 d后，在雙側(cè)輸卵管漿膜下各移植40～80個(gè)卵巢小塊。接下來(lái)每周或每?jī)芍鼙O(jiān)測(cè)一次卵泡生長(zhǎng)情況以及血清激素變化，當(dāng)卵泡直徑＞5 mm后患者每天接受FSH治療，然后在卵泡直徑＞16 mm時(shí)注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG），36 h后經(jīng)陰道超聲下取卵。最終在8例患者中發(fā)現(xiàn)有卵泡生長(zhǎng)，其中5例患者取出了成熟卵泡，經(jīng)過(guò)卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intra cytoplasmic sperm injection，ICSI）后最終有1例患者成功分娩1名健康嬰兒。2016年，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院報(bào)道了中國(guó)首例應(yīng)用IVA技術(shù)成功分娩的POI患者[19]。該團(tuán)隊(duì)納入了14例POI患者，平均年齡29歲，通過(guò)腹腔鏡摘除患者一側(cè)卵巢，卵巢取出后立即轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室恒溫37℃培養(yǎng)箱中，剝離卵巢皮質(zhì)并切成條狀，將一部分卵巢組織切成1 mm×1 mm的小塊，然后將其放入含有PTEN抑制劑和PI3K激活劑的培養(yǎng)基中孵育，剩余的卵巢組織采用玻璃化冷凍法冷凍保存。用10%～20%的卵巢條索進(jìn)行組織學(xué)分析，以確定殘余卵泡的存在。經(jīng)過(guò)2 d的IVA后，腹腔鏡下將卵巢小塊移植到兩側(cè)輸卵管漿膜下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7例患者切除的卵巢中仍有殘存的原始卵泡，最終有1例患者成功分娩健康男嬰，另有3例患者進(jìn)行了胚胎冷凍保存。

3.2 非藥物IVA既往研究表明，原始卵泡在富含膠原的卵巢皮質(zhì)中的定位，賦予了卵泡支持結(jié)構(gòu)和限制卵泡擴(kuò)張的剛性物理環(huán)境，原始卵泡中的卵母細(xì)胞被周?chē)置诩?xì)胞外基質(zhì)蛋白的顆粒細(xì)胞壓縮，導(dǎo)致高機(jī)械壓力狀態(tài)從而保持休眠狀態(tài)，當(dāng)原始卵泡細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)降解后可使原始卵泡激活。近年來(lái)隨著對(duì)卵巢Hippo信號(hào)通路研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)機(jī)械刺激卵巢可干擾并阻斷Hippo信號(hào)通路，促進(jìn)原始卵泡發(fā)育，IVA技術(shù)也有了新進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢切除可誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白聚合一過(guò)性增加，YAP磷酸化降低，導(dǎo)致細(xì)胞核YAP水平升高，隨后下游生長(zhǎng)因子（細(xì)胞周期蛋白）和凋亡抑制因子（含有凋亡抑制劑的桿狀病毒凋亡重復(fù)抑制因子）表達(dá)增加[20]?；诖耍袑W(xué)者使用簡(jiǎn)化的非藥物IVA程序，無(wú)需AKT刺激物（PTEN抑制劑和PI3K激活劑）孵育2 d，僅腹腔鏡手術(shù)下進(jìn)行卵巢取材、分割和原位移植，在14例POI患者中有5例取卵成功，每個(gè)取卵周期的累積妊娠率為57%，最終有2例活產(chǎn)，1例于26周早產(chǎn)后嬰兒死亡，1例持續(xù)妊娠[21]。Kawamura等[22]研究納入11例非藥物IVA治療的卵巢低反應(yīng)合并卵巢儲(chǔ)備降低的患者，經(jīng)過(guò)腹腔鏡下卵巢取材、分割后立即將卵巢小塊移植回患者體內(nèi)，有9例經(jīng)FSH治療后，在多個(gè)月經(jīng)周期中可見(jiàn)有腔卵泡數(shù)增加，隨后提取成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVF，5例患者進(jìn)行了16次胚胎移植，最終1例活產(chǎn)，2例持續(xù)妊娠，1例流產(chǎn)。該IVA程序節(jié)省了2 d的藥物孵育步驟，在將卵巢皮質(zhì)分割后立即移植卵巢小塊，避免了長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中可能發(fā)生的卵泡丟失。此外，只需要1次腹腔鏡手術(shù)，甚至手術(shù)也可以在門(mén)診進(jìn)行，將患者的不適和治療成本降至最低。由于進(jìn)行了原位移植，一些患者在沒(méi)有取卵和IVF-胚胎移植的情況下可能會(huì)自發(fā)妊娠。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

約50%的POI患者卵巢內(nèi)仍含具有發(fā)育潛能的殘留卵泡，IVA技術(shù)為POI患者提供了一種潛在的不孕癥治療方法。這些手術(shù)方式看似在“破壞”卵巢，與傳統(tǒng)的減少器官損害思維背道而馳，但該過(guò)程類(lèi)似于女性每月1次的卵巢重塑，與生理狀態(tài)也有類(lèi)似之處。然而目前的IVA仍有一些問(wèn)題有待解決，一是妊娠率較低，活產(chǎn)率更低，如何有效提高IVA后的妊娠率值得探討；二是無(wú)論藥物IVA還是非藥物IVA，卵巢移植本身會(huì)對(duì)卵巢儲(chǔ)備造成嚴(yán)重?fù)p傷，如何降低這種損傷或是尋求一種新的原位IVA手段，對(duì)于提高IVA的成功率具有重要意義。